Robuust, ligatuur-geïnduceerde model van lymfklier-periodontitis voor de evaluatie van orale neutrofielen

Het hier beschreven protocol voorschrijft onderzoekers een methode om orale neutrofielen te bestuderen binnen een door ligatuur geïnduceerde diermodel van parodontitis op een vergelijkbare manier met menselijke deelnemers. Het belangrijkste voordeel van deze techniek wordt benadrukt door het toegenomen volume van ontstoken gingivale weefsels die beschikbaar zijn voor latere analyse, wat het gebruik van dieren vermindert. Ons vermogen om de met biofilm gecoate ligaturen rond de tanden te halen, maakt het mogelijk om een effectieve behandeling van een gelokaliseerde parodontitis te simuleren.

Het gebruik van dit model zou kunnen worden toegepast in de studie van de systemische effecten van parodontitis in een diermodel, als gevolg van de toegenomen gebieden van ontstoken gingivale weefsels. Vertrouwd raken met het gebruik van microchirurgische instrumenten en dissectiemicroscopen, evenals het knopen van chirurgen voordat levende dierlijk behandelde onderwerpen worden behandeld, wordt sterk aangeraden. Visuele demonstratie van deze techniek is van cruciaal belang bij het verminderen van de lengte van de leercurve die nodig is om een bedreven plaatsing van ligatuur te bereiken.

Het aantonen van de procedure zal Jeff Chadwig zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Begin met het positioneren van de muis op een verwarmd chirurgisch platform. Na ervoor te zorgen dat de muis goed is verdoofd, stabiliseert u de maxilla en de onderkaak in de open positie met behulp van elastische banden.

Prop de hals met een katoenen rol om de maxilla in een horizontale positie te houden en bedek het lichaam en de staart om warmteverlies te beperken. Plaats de chirurgische microscoop bij de gewenste vergroting en verlichting over de mondholte. Gebruik splinter tangen om een steriele 50 of kleinere gevlochten zijde hechting rond de M1 en M2 maxillaire kiezen in de gingivale sulcus te installeren.

Plaats de distale staart van de hechting aan de palatale kant van het gebit en plaats het proximale segment tussen het contact van M2 en M3. Wikkel het vervolgens rond het buccale oppervlak van M2 en steek het tussen het contact van M1 en M2. Zorg ervoor dat beide uiteinden van de hechting stevig worden getrokken om het in de gingivale sulcus te drijven. Wikkel het proximale hechtingssegment rond M1 onder de contourhoogte en plaats het tussen het contact van M1 en M2. Trek de proximale staart van de hechting stevig om alle speling te verwijderen. Bind de uiteinden van de hechting met de knoop van een chirurg en trim de staarten zo sorteren mogelijk.

Plaats de knoop in de gingivale embrasure tussen M1 en M2 aan de palatale kant van het maxillaire gebit. Het is van cruciaal belang dat de knoop die wordt gebruikt om de ligatuur veilig te stellen, veilig is en in positie is waar het dier niet zal irriteren of de masticatie zal verstoren. Na de ligatuurinstallatie, verwijder de muis uit het chirurgische apparaat en plaats deze in een schone kooi onder een warmtelamp, om deze te controleren totdat deze volledig hersteld is.

Steriliseren de chirurgische instrumenten in de hete glazen kraal sterilisator tussen elk dier onderwerp. Individueel huis elke muis met de juiste milieu-verrijking en laat ad libitum toegang tot gefilterd water en puree standaard chow in een temperatuur en vochtigheid gecontroleerde omgeving voor zeven tot 11 dagen. Wanneer u klaar bent om monsters te verzamelen, gebruik dan een pipet om de mondholte te spoelen met 100 microliters van gesteriliseerde vier graden Celsius PBS zonder calcium en magnesium gedurende 10 seconden.

Herhaal de spoeling nog twee keer en plaats elke spoeling in dezelfde kegelvormige reageerbuis van 15 milliliter voor elk dier. Voer de inhoud van elke 15 milliliter buis door een 40 micrometer nylon mesh filter in een 50 milliliter conische buis, en breng het filtraat in een nieuwe 15 milliliter reageerbuis. Voeg 33,3 microliter van 16% paraformaldehyde toe om monsterfixatie te vergemakkelijken.

Vortex de monsters onmiddellijk en incubeer ze op ijs gedurende 15 minuten. Paraformaldehyde is het gevaarlijkste reagens dat in het protocol wordt gebruikt en moet worden behandeld met de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen die door de fabrikant worden geadviseerd. Vul na de incubatie de buis tot 15 milliliter met PBS en centrifugeer het vervolgens vijf minuten op 1000xg en vier graden Celsius.

Aspirate de supernatant, opnieuw opschorten de pellet in een milliliter FACS buffer op vier graden Celsius en tel de cellen op een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Herhaal de centrifugatie en aanzuigen de supernatant. Hang vervolgens de celpellet opnieuw op in een passend volume FACS-buffer voor een uiteindelijke concentratie van 500,000 tot 1 miljoen cellen per 50 microliter FACS-buffer en breng de cellen over naar facs-buis.

Voeg een microliter rattenserum en twee microliter anti-muis IGG-antilichaam toe aan 50 microliter van het monster. Vortex het monster onmiddellijk en blokkeren op ijs gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens de juiste antilichamen toe aan elk monster.

Vortex en incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Na de incubatie, was de monsters met een milliliter FACS buffer, vortex kort, en centrifuge gedurende vijf minuten op 1000xg en vier graden Celsius. Dump de supernatant en blokkeer voorzichtig de opening van de FACS buis.

Herhaal de was twee keer en schort de monsters opnieuw op in 250 microliter facs-buffer voor opslag. Bedek de buizen met paraffine film, wikkel ze in aluminiumfolie, en bewaar ze op vier graden Celsius tot klaar om te analyseren. Flow cytometrie werd gebruikt om neutrofielen hersteld van een orale spoeling van een naïeve muis te analyseren, evenals een orale spoeling en herstelde ligatuur van een muis met ligatuur-geïnduceerde parodontitis.

Om alveololen botverlies te beoordelen, werden alveololol gehalten gemeten van de alveololische botkam tot de cementoenamelverbinding voor gezonde en ligated muizen. Vervolgens werden de meetverschillen berekend. Hoewel hier niet herzien, histopathologische, immunohistochemische, en morfometrische evaluatie van het parodontium en alveololator bot kan ook worden uitgevoerd, afhankelijk van het onderzoek vraag.

Dit model wordt momenteel gebruikt in mijn laboratorium om de effecten van het orale aangeboren immuunsysteem op de gezondheid en ziekte van het systeem te bestuderen.