Name: Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Leer een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire aorta-endotheelcellen van miniatuurvarkens. Deze techniek levert >97% zuivere cellen op voor xenotransplantatieonderzoek naar immuun- en stollingsreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gesteund door subsidies van Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisch wetenschappelijk onderzoek Stichting van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 en JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua district Stichting van wetenschap en technologie, Grant/Award nummer: 2017013; Nationale sleutel R & D-programma van China, subsidie/Gunnings nummer: 2017YFC1103704; Sanming project van geneeskunde in Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong (2019); Fonds voor medische discipline op hoog niveau bouw van Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Stichting van gezondheid en familie planning Commissie, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 en SZXJ2018059. We bedanken Hancheng Zhang en Zhicheng zou van de Universiteit van Shenzhen voor het assisteren bij de voorbereiding van het manuscript.

Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie van Shenzhen Second People's Hospital, in overeenstemming met de beginselen van dierenwelzijn.
1. bereiding van dieren, medium en buffers
<ol><li>Bereid het miniatuur varken voor. Opmerking: alle miniatuur varkens waren Chinese Wuzhishan of Bama Pigs (mannelijk). De leeftijd en het gewicht van de varkens waren 100 dagen ± 8 dagen en 5,7 kg ± 1,0 kg (gemiddelde ± SD, n = 3), respectievelijk.</li>
	<li>Bereid het kweekmedium voor: endotheliale cel medium (ECM) aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetaal serum (FBS), 1% (v/v) penicillaire/streptomycine (P/S) en 1% (v/v) Endotheliale celgroei supplement (ECG'S).</li>
	<li>Bereid de wasbuffer: 1x PBS-oplossing (pH 7,4) met 1% (v/v) P/S.</li>
	<li>Bereid een 0,005% Collagenase IV spijsvertering oplossing: 1 mg Collagenase IV poeder in 20 mL PBS-oplossing. Verwarm de Collagenase digestieve oplossing vóór de spijsvertering bij 37 °C.</li>
	<li>Bereid de stop buffer voor: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FBS en 1% P/S.</li>
</ol>2. chirurgie en voorbereiding voor het isoleren van de aorta-endotheel cellen van varkens
<ol><li>Ontsmetten van de operatiekamer met UV-licht voor 1 uur en medisch ontsmettingsmiddel 84 vloeistof (beschikbaar chloorgehalte is 4,0%-5,0%, Inhoudsopgave) voor het uitvoeren van een operatie.</li>
	<li>Na het miniatuur varken kreeg een intramusculaire injectie gevormd door 15 mg/kg ketamine, 15 mg/kg Xylazine hydrochloride en 0,05 mg/kg Phenacetin hydrochloride (volumes: 100μL/kg, tabel van de materialen) (Figuur 1a), bevestig het dier anesthesie status met het controleren van de pijnlijke stimulus van varkens (bv. knijpen één oor of schudden één forelimb) en fysiologische index (bv. bloeddruk, hart-en ademhalingsfrequentie). Opmerking: er kan nog een halve dosis injectie aan het varken worden gegeven als het de tekenen van wakker laat zien.</li>
	<li>Snijd de buik met een scalpel, bloot de inferieure Vena Cava en Injecteer daarom heparine natrium (5.000 U, tabel van de materialen) in de onderste Vena Cava met 5 ml spuit.</li>
	<li>Vijf minuten later, steek een katheter aan de abdominale aorta naar bloed, snijd de huid van de borst en insnijden van het diafragma met een scalpel en vervolgens snijd de linker ventrikel af. Opmerking: Zorg ervoor dat varken wordt geësaliseerd door de aorta puls na het bloederen te controleren en het hart te snijden.</li>
	<li>Accijns de ribben met bot Tang (tabel van de materialen), en bloot het hart en de longen. Zoek de aorta posterieure naar het hart en de longen en klem de twee uiteinden. Was de aorta eenmaal met een voorgekoelde wasbuffer (Figuur 1B, C).</li>
	<li>Knip de aorta met een schaar en houd de aorta aan elk uiteinde geklemd. Accijnzen overtollig weefsel rond de aorta met steriele Tang en schaar. Zet de aorta in een centrifugebuis van 50 mL, was de aorta met een voorgekoelde wasbuffer 3x (30 mL per wasbeurt) en breng de aorta over naar het laboratorium (figuur 1d).</li>
</ol>3. isolatie van varkens aorta-endotheel cellen
<ol><li>Verwijder onder aseptische omstandigheden het varken aorta uit de wasbuffer en plaats het op een 150 mm Petri schaaltje (Figuur 2a).</li>
	<li>Knip de twee uiteinden van de aorta voorzichtig af en het overtollige weefsel van de accijnzen rond aorta met steriele Tang en schaar opnieuw (Figuur 2b). Was de buitenkant en binnenkant van de aorta (over het cultuur gerecht bij kamertemperatuur) met 20 − 50 mL wasbuffer. Opmerking: probeer alleen het gebied waar de klemmen werden geplaatst tijdens de operatie te knippen, omdat sommige ECs werden beschadigd in dit gebied, en overtollige weefsels en arteriële kant takken verwijderen.</li>
	<li>Passeer een chirurgische hechting door de aorta en bind vervolgens het ene uiteinde van de aorta met behulp van de chirurgische hechting (5-0, 90cm, tabel van materialen). Houd de chirurgische hechtdraad aan de binnenkant van de aorta (figuur 2c,D).</li>
	<li>Bevestig de aorta in de buurt van het gebonden uiteinde met een tang en trek de chirurgische hechting langzaam om de aorta om te keren totdat het endotheliale oppervlak van de aorta wordt blootgesteld (Figuur 2E-G). Opmerking: Zorg ervoor dat u de aorta in de buurt van het gebonden uiteinde vast te stellen en niet de aorta strak vast, of anders de aorta kan niet worden teruggedraaid door het trekken van de chirurgische hecht.</li>
	<li>Was het endotheliale oppervlak van de aorta met wasbuffer 3x (10 mL per wasbeurt) en gooi deze oplossing dan weg. Plaats de aorta in een centrifugebuis van 15 mL en bedek de aorta met 10 mL 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing in de buis (figuur 2H). Opmerking: Verwarm de spijsverterings oplossing 0,005% Collagenase IV vóór de spijsvertering voor op 37 °C.</li>
	<li>Inbroed bij 37 °C gedurende 15 min. plaats de verteerde aorta en spijsvertering oplossing in een kweek schaal van 100 mm en stop de effecten van 0,005% Collagenase IV door 10 − 15 mL voorgekoelde stop buffer toe te voegen. Opmerking: de aanbevolen verterings tijd is tussen 10 en 20 minuten. Zorg ervoor dat het endotheliale oppervlak van de aorta wordt gedekt door de stop buffer.</li>
	<li>Schrapen de pAECs van het binnenoppervlak van de aorta met behulp van een celscraper (figuur 2I). Was de geschraapte aorta 3x met wasbuffer (5 mL per keer). Zet de oplossing van de kweek schaal in een centrifugebuis van 50 mL. Was de bodem van de kweek schotel 2x met wasbuffer (5 mL per keer) en zet de oplossing opnieuw in een centrifugebuis van 50 mL. Opmerking: schuif in één richting voorzichtig en niet comprimeren. Raak het weefsel niet aan de randen en gaten aan. Schrapen 5 − 8x wordt aanbevolen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en laat 10 mL oplossing aan de onderkant van een centrifugebuis van 50 mL. Voeg 20 mL wasbuffer toe aan de centrifugebuis van 50 mL en regeer de pellets. Vermijd bubbels tijdens deze stap.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant langzaam weg. Respendeer de celpellets met 1 mL kweekmedium en meng goed. Opmerking: het verkregen gemiddelde aantal ECs per cm aorta is 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (gemiddelde ± SD, n = 3).</li>
	<li>Tel de cellen met een celteller. Plaat en kweek de cellen in een vat zonder coatingmateriaal volgens het celnummer. Als het celgetal kleiner is dan of gelijk is aan 1,0 x 106, worden kweekcellen in een kolf van 25 cm2 . Als het celnummer groter is dan 1,0 x 106, worden de kweekcellen in verschillendekolven van 25 cm (1,0 x 106 cellen per kolf). Plaats de kolf in een incubator (zonder schudden) bij 37 °C met 5% CO2 en vervang het medium elke 2 − 3 dagen. Opmerking: sommige cellen worden beschadigd door de celscraper. Een cel levensvatbaarheid test vond het percentage levende cellen 95,7% ± 1,7% (gemiddelde ± SD, n = 3). De verdubbelingstijd van de geïsoleerde cellen is ongeveer 1 − 2 dagen.</li>
</ol>4. oogst en karakterisering van zuivere endotheel cellen
<ol><li>Laat de cellen ongeveer 4 − 5 dagen groeien. Wanneer de cellen bereiken 80% samenloop (Figuur 3a), verteren de cellen met 0,25% trypsine en doorgang van de cellen. Vervolgens, verzamel enkele van de geïsoleerde cellen (dag 3, passage 1 en passage 2) en identificeren doorstroming cytometrie (met een anti-CD31-antilichaam).</li>
	<li>Label geïsoleerde pAECs (Cell Number: 1 x 105) (dag 3, passage 1 en passage 2) met anti-PORCINE CD31-fluorescein isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd antilichaam (10 μL antilichaam voor per 100 μL cellen, gekleurd voor 30 min bij 4 °c) voor Flowcytometrie analyse.</li>
	<li>Gate totale levende celpopulatie met een voorwaartse verstrooide plot, onbevlekt monster als een negatieve controle. Presenteer vervolgens de CD31 positieve cellen van de gated cellen met histogram. Opmerking: de werkzaamheid van CD31-positieve cellen is 97,4% ± 1,2% (dag 3), 94,4% ± 1,1% (P1) en 92,4% ± 1,7% (P2) (gemiddeld ± SD), respectievelijk (Figuur 3b).</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+transplantation+in+China%3A+concerns+remain%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Organ transplantation in China: concerns remain.</a> Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).</li>
<li>Ekser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+xenotransplantation%3A+the+next+medical+revolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?</a> Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).</li>
<li>Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+genetically+engineered+pigs+in+xenotransplantation+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research.</a> The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).</li>
<li>McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells%3A+role+in+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells: role in infection and inflammation.</a> World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).</li>
<li>Ekser, B., Cooper, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+barriers+to+xenotransplantation%3A+prospects+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).</li>
<li>Yeom, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+aortic+endothelial+cell+genes+responsive+to+selected+inflammatory+stimulators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators.</a> The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).</li>
<li>Beigi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+isolating+highly+purified+and+functional+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).</li>
<li>Jansen of Lorkeers, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Cardiomyocyte+Progenitor+Cells+Does+Not+Improve+Cardiac+Function+in+a+Porcine+Model+of+Chronic+Ischemic+Heart+Failure.+Results+from+a+Randomized%2C+Blinded%2C+Placebo+Controlled+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial.</a> PLOS One. 10 (12), e0143953(2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Antigens+Involved+in+Delayed+Xenograft+Rejection+in+a+Ggta1%2FCmah+Dko+Pig-to-Monkey+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10024(2017).</li>
<li>Paris, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGR1+expressed+by+porcine+enriched+liver+sinusoidal+endothelial+cells+mediates+human+platelet+phagocytosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro.</a> Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).</li>
<li>Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+human+and+porcine+platelet+oligosaccharides+may+influence+phagocytosis+by+liver+sinusoidal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro.</a> Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).</li>
<li>Bernardini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70%2C+heat+shock+protein+32%2C+and+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+their+effects+on+lipopolysaccharide-induced+apoptosis+in+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+%26+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells.</a> Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).</li>
<li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li>
<li>Graupera, M., Claret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cells%3A+New+Players+in+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%3A+TEM%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).</li>
<li>Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+endothelial+progenitor+cells+for+therapeutic+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Radiation+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.</a> Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).</li>
<li>Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+stem+and+progenitor+cell+transplantation+for+organ+vascularization+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration.</a> Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).</li>
<li>Jain, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+death%2C+angiogenesis%2C+and+microvascular+function+after+castration+in+an+androgen-dependent+tumor%3A+role+of+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).</li>
<li>Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+transplantation+of+cardiac+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells.</a> BioMed Research International. 2013, 359412(2013).</li>
<li>Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li>
<li>Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Epithelial+and+Endothelial+Cells+from+Mouse+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).</li>
<li>Naschberger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Endothelial+Cells+from+Normal+Colon+and+Colorectal+Carcinoma+-+An+Improved+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57400(2018).</li>
<li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+endothelial+colony-forming+cells+from+mononuclear+cells+of+rat+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).</li>
<li>Chi, L., Delgado-Olguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Mouse+Placental+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).</li>
<li>Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+strategies+to+bring+islet+xenotransplantation+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic.</a> Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).</li>
<li>Yi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Accelerate+Collagen+Digestion+by+Bacterial+Collagenase+in+Lung+Tissue+Strips%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips.</a> Frontiers in Physiology. 7, 287(2016).</li>
<li>Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase-+and+trypsin-dissociated+heart+cells%3A+a+comparative+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).</li>
<li>Yonenaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+of+collagenase+treatment+for+isolation+of+articular+chondrocytes+from+aged+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues.</a> Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).</li>
<li>French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+proteolysis+of+type+I+collagen+at+hyperreactive+sites+by+class+I+and+II+Clostridium+histolyticum+collagenases%3A+complementary+digestion+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns.</a> Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).</li>
<li>Hara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+pig+cells+for+resistance+to+human+antibody-mediated+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%3A+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection.</a> Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Endotheliale cellen worden vaak gebruikt in onderzoek van vasculaire dysfunctie, diabetes, weefselregeneratie, transplantatie, en kankers14,15,16,17,18. Om de biologie en functie van ECs in deze ziekten te begrijpen en te karakteriseren, zijn er talrijke methoden om de ECs van verschillende zieke organen of weefsels te isoleren, gemeld8...

Het tekort aan beschikbare organen voor transplantatie is een uitstekend probleem wereldwijd1. Volgens de Rode Kruis vereniging van China, slechts een klein aantal patiënten met eindstadium orgaan falen kreeg een geschikt orgaan in China in 2018.
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het probleem van orgaan tekorten op te lossen. Varkens organen worden beschouwd als de meest geschikte organen voor de mens vanwege anatomische en fysiologische gelijkenissen2,3. Het falen van een varkens xenotransplantaatmodellen is is grotendeels gerelateerd aan de primaat immuunafstoting en coagulatie responsen. Varkens endotheel cellen (ECs) zijn kritisch, omdat deze cellen zijn de eerste om te communiceren met het primaat immuunsysteem, waaronder antilichamen, complement, cytokines, en immune cellen (bv, T-cellen, B-cellen, en macrofagen)4,5. Varkens ECs spelen een vitale rol in varkens orgel en eilandje xenotransplantatie6,7. Dus, ECs zijn belangrijke cellen voor het onderzoeken van de afwijzing en coagulatie reacties op een varken Graft. Isolatie van hoge kwaliteit varkens ECs is vereist voor xenotransplantatie onderzoek.
In pogingen om ECs te isoleren van verschillende organen (bijv. hart, nieren, lever en aorta), zijn verschillende protocollen gerapporteerd in een xenotransplantaat instelling8,9,10,11,12. Echter, het houden van een ultrapuur cultuur van geïsoleerde ECs is een uitstekend probleem in de standaardprotocollen. De verhoogde concentratie van de verteerde oplossing, de ongepaste digestie tijd en de intensiteit van de Schraap kunnen bijdragen aan de verhoogde fibroblast besmetting in de huidige studies8,10,13. Trouwens, de methode van geïsoleerde pAECs van miniatuur varkens is minder bestudeerd. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde enzymatische methode om hooggezuiverde pAECs te isoleren van miniatuur varkens (Wuzhishan of Bama). Verschillende stappen in het protocol zijn ontworpen om fibroblast besmetting te verminderen en hoge zuiverheid ECs te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boneforceps</td><td>Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China</td><td>HL-YGQ&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BOON Disposable Syringe (10ml)</td><td>Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31-FITC antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1746F</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3010#</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138#-1G</td><td></td></tr><tr><td>Compound ketamine injection&nbsp;</td><td>Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China</td><td></td><td>Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306#</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965118#</td><td></td></tr><tr><td>ECM</td><td>Sciencell</td><td>1001#</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Sciencell</td><td>1052#</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)&nbsp;</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C#</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100mm Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003#</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10270-106#</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp;</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium</td><td>Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodine tincture</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniature Pig (Bama or Wuzhishan)</td><td>Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mshot microscope&nbsp;</td><td>Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd.</td><td>M152</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 x 15 mm)</td><td>Biologixgroup</td><td>66-1515#</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063#</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap?T25?</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3289#</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological Transfer Pipettes (10ml)</td><td>JET Biofil</td><td>GSP010010#&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pasteur Pipette</td><td>GeneBrick</td><td>GY0025#</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe Filter (0.22&micro;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS#</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scalpel</td><td>ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China</td><td>22#</td><td></td></tr><tr><td>Surgical suture</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>5-0#</td><td></td></tr><tr><td>Syringe?5mL?</td><td>Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>GIBCO</td><td>25200056#</td><td></td></tr><tr><td>75% Medical alcohol</td><td>Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free)</td><td>Sangon Biotech</td><td>B540627#</td><td></td></tr><tr><td>Medical disinfectant 84 liquid</td><td>Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd</td><td>450ml/bottle</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het tekort aan menselijke organen op te lossen voor patiënten met eindstadium orgaanfalen, en het varken wordt beschouwd als een geschikte orgaan bron. Immuun afwijzing en coagulatie zijn twee belangrijke hindernissen voor het succes van xenotransplantatie. Vasculaire endotheliale cel (EC) letsel en dysfunctie zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de ontsteking en coagulatie reacties bij xenotransplantatie. Zo is isolatie van varkens aorta endotheel cellen (pAECs) noodzakelijk voor het onderzoeken van de immuunafstoting en coagulatie reacties. Hier hebben we een eenvoudige enzymatische aanpak ontwikkeld voor de isolatie, karakterisering en uitbreiding van zeer gezuiverde pAECs van miniatuur varkens. Eerst werd het miniatuur varken verdoofd met ketamine, en een lengte van aorta werd weggesneden. Ten tweede werd het endotheliale oppervlak van aorta blootgesteld aan 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing voor 15 min. ten derde werd het endotheeloppervlak van de aorta in slechts één richting met een celscraper (< 10 keer) geschuurd en niet gecomprimeerd tijdens het proces van Schrapen. Tot slot, de geïsoleerde pAECs van dag 3, en na passage 1 en passage 2, werden geïdentificeerd doorstroming cytometrie met een anti-CD31-antilichaam. De percentages van CD31-positieve cellen waren respectievelijk 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% en 92,4% ± 1,7% (gemiddelde ± SD). De concentratie van Collagenase IV, de spijsverterings tijd, de richting, en de frequentie en intensiteit van het schrapen zijn van cruciaal belang voor het verminderen van fibroblast besmetting en het verkrijgen van hoge zuiverheid en een groot aantal ECs. Concluderend, onze enzymatische methode is een uiterst effentieve methode voor het isoleren van ECs van het miniatuur varken aorta, en de cellen kunnen in vitro worden uitgebreid om de immuunrespons en coagulatie reacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.

Onze methode is bedoeld om een effectieve manier te bieden om zeer gezuiverde ECs te isoleren van de aorta's van miniatuur varkens. Het proces van aorta chirurgie wordt getoond in Figuur 1. De eerste stap is dat de hele aorta uit het varken wordt weggesneden. Het voorkomen van andere cellen of bacteriële besmetting is erg belangrijk. Dus, geen wonden toebrengen aan andere organen of weefsels in het geval ongerichte cellen of bacteriën verontreinigen de aorta, en was de aorta met voorgekoelde...

Er wordt een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire varkens aorta endotheel cellen (pAECs) beschreven. De geïsoleerde primaire pAECs kan worden gebruikt om de immuunrespons en coagulatie reactie bij xenotransplantatie te onderzoeken.

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

De methode is een zeer effectieve methode voor het isoleren van endotheelcellen van miniatuurvarken. En de cellen kunnen ook worden uitgebreid, onderzoeken de immuun- en stollingsrespons bij xenotransplantatie. Het belangrijkste voordeel van techniek is dat het niet alleen gemakkelijk, zeer effectief is om zeer gezuiverde endotheelcellen te isoleren van varkens, maar ook beter om andere pAC's te houden wanneer deze worden doorgegangerd.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pijnreflex bij het verdoofde varken, was de varkensbuikwand drie keer met 75% medische alcohol en een tinctuur jodium. Na de laatste wasbeurt, gebruik een scalpel om een abdominale incisie te maken om de inferieure vena cava bloot te stellen, en gebruik een vijf milliliter spuit om 5000 eenheden heparine natrium te injecteren in de inferieure vena cava. Na vijf minuten, steek een katheter in de abdominale aorta, en gebruik een scalpel om het middenrif in te ringen.Verwijder met behulp van een tweede onderzoeker de linkerventrikel en gebruik bot tangen om de ribben uit te roeien om het hart en de longen bloot te leggen. Zoek de aorta achterste naar het hart en de longen, en klem de uiteinden. Gebruik een schaar om de aorta uit te roeien en was deze een keer met een voorgekoelde wasbuffer.Verwijder overtollig weefsel rond de aorta met steriele tangen en scharen en plaats het vat in een 50 milliliter centrifugebuis met verse voorgekoelde wasbuffer voor overdracht naar het laboratorium. Voor varkensatheek endotheelcelisolatie, breng de varkensaorta in een 150 millimeter petrischaal onder aseptische omstandigheden, en verwijder voorzichtig beide uiteinden van het vat. Snijd extra overtollig weefsel waar het vat was geklemd, met steriele tangen en scharen, en gebruik 20 tot 50 milliliter verse wasbuffer om de buitenkant en binnenkant van de aorta te spoelen.Vervolgens passeert u een chirurgische hechting door de aorta en bind losjes het ene uiteinde van het vat, waarbij de hechting in het lumen blijft. Bevestig de aorta voorzichtig in de buurt van het gebonden uiteinde met tangen en trek vervolgens de chirurgische hechting langzaam, om de aorta om te keren, totdat het endotheeloppervlak van de aorta wordt blootgesteld. Was het endotheeloppervlak van de aorta drie keer met 10 milliliter verse wasbuffer per wasmachine en plaats de aorta in een 15 milliliter centrifugebuis.Bedek het monster met 10 milliliter van 37 graden Celsius opgewarmd 0,005% collagenase IV spijsverteringsoplossing, en incubeer het weefsel op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng aan het einde van de incubatie de gehele buisinhoud over in een 100 millimeter kweekschotel en arresteer de spijsvertering met 10 tot 15 milliliter vooraf gekoelde stopbuffer. Verwijder met behulp van een celschraper voorzichtig de aorta-endotheelcellen van het binnenoppervlak van het vat en was het vat drie keer met vijf milliliter wasbuffer per wasmachine.Na de laatste wasbeurt, breng de supernatant in een 50 milliliter centrifuge buis, en was de bodem van de cultuur schotel twee keer met vijf milliliter verse wasbuffer, per was, trekken de wast in de 50 milliliter buis. Verzamel de cellen door centrifugatie, en gooi alle, behalve de laatste 10 milliliter supernatant. Voeg 20 milliliter wasbuffer toe om de pellet opnieuw op te hangen, zorg ervoor dat bellen worden vermeden en verzamel de cellen met een andere centrifugatie.Resuspend de pellet in een milliliter van cel cultuur medium voor het tellen, en plaat de cellen op een keer tien tot de zes cellen per 25 centimeter vierkante kolf concentratie. Plaats vervolgens de cellen in de celkweek incubator op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide, verfrissende het medium om de twee tot drie dagen. Na isolatie worden de endotheelcellen geïnspecteerd op dag nul, één en twee, en na passages één en twee op besmetting en hun morfologische evaluatie.Flow cytometrische analyse met behulp van een anti-CD31-FITC antilichaam geeft een typisch groter dan 97% endotheelcel marker positieve populatie op dag drie van de cultuur, dat wordt gehandhaafd op een meer dan 90%zuiverheid, zelfs na twee passages. Het endotheeloppervlak van de aorta werd in slechts één richting geschraapt, met een celschraper, minder dan 10 keer, en het werd niet gecomprimeerd tijdens het proces van schrapen. Beste antwoord, geoptimaliseerde methode van pAECs isolatie, kunnen we gezuiverde pAC's gebruiken om individuele experimenten uit te voeren en de immuunafstoting en stolling respons in xenotransplantatie te onderzoeken.

isolation-culture-primary-aortic-endothelial-cells-from-miniature

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Een methode voor het zaaien titanium bloed-contact biomaterialen met autologe cellen en het testen van biocompatibiliteit wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van endotheliale progenitor cellen en titanium buizen, zonder zaadjes binnen enkele minuten van de chirurgische implantatie in varkens venae cavae. Deze techniek is aan te passen aan vele andere implanteerbare biomedische apparaten.

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

In this video, we demonstrate a procedure for the surgical removal of the aorta from miniature pigs. Endothelial cells harvested from these isolated aortae can be further cultured in in vitro conditions to study coagulation and immune responses.

Porcine Aorta Isolation: A Surgical Procedure to Excise the Thoracic Aorta From Miniature Pigs for Downstream Analysis

In this video, we demonstrate the isolation of endothelial cells from the abdominal aorta of a pig model using one-step collagenase digestion. The endothelial cells can be cultured for further downstream applications.

Porcine Aortic Endothelial Cell (pAEC) Isolation: An Enzyme-based Method to Isolate Endothelial Cells from Harvested Porcine Abdominal Aorta

De mogelijkheid om endotheelcellen van hartkleppen (VEC's) te isoleren, is van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van klepontwikkeling, onderhoud en ziekte.  Hier beschrijven we de isolatie van VEC's van embryonale en volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van FACS, wat studies mogelijk maakt om de bijdrage van VEC's in ontwikkelings- en ziekteprocessen te bepalen.

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

De vasculaire endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij veel belangrijke cardiovasculaire aandoeningen. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren en uit te breiden van de muisaorta zonder het gebruik van speciale apparatuur. Ons protocol biedt een effectieve manier om mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

Er zijn nieuwe isolatiemethoden voor primaire endotheelcellen uit bloedvaten nodig. Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek die bloedvaten van belang volledig omkeert, waardoor alleen de endotheelzijde wordt blootgesteld aan enzymatische vertering. De resulterende pure endotheelcelcultuur kan worden gebruikt om hart- en vaatziekten, ziektemodellering en angiogenesis te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

Dit protocol beschrijft de verzameling menselijke aortakleppen geëxtraheerd tijdens chirurgische aortaklepvervangingsprocedures of uit cadaverische weefsel, en de daaropvolgende isolatie, uitbreiding en karakterisering van patiëntspecifieke primaire klep endotheel- en interstitiële cellen. Inbegrepen zijn belangrijke details over de processen die nodig zijn om de levensvatbaarheid van cellen en fenotypespecificiteit te garanderen.

Isolatie van menselijke primaire klepcellen voor in vitro ziektemodellering

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Leer een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire aorta-endotheelcellen van miniatuurvarkens. Deze techniek levert >97% zuivere cellen op voor xenotransplantatieonderzoek naar immuun- en stollingsreacties.

Isolatie en cultuur van primaire aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens

Meer video's verkennen