Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten

Mechanische eigenschappen van plantencellen zijn essentieel om rekening mee te houden bij het begrijpen van mechanismen die aan de ontwikkeling ten grondslag liggen. Atoomkracht microscopie kan worden gebruikt om deze eigenschappen te meten, en volg de manier waarop ze veranderen, tussen organen, weefsels, alle ontwikkelingsstadia. De belangrijkste voordelen van deze techniek, is dat het geen invasieve, het is relatief snel en het vereist geen behandeling, zodat het direct kan worden toegepast op levende monsters.

Voor iemand die nieuw is voor deze procedure, cis sectie van het monster is echt kritisch, dus zorg ervoor dat je echt de juiste mechanische fixatie van het monster. Visuele demonstratie van deze procedure, is van cruciaal belang om beter te begrijpen van de fijne kneepjes van monster fixatie, kwaliteitscontrole van de bevordert en meting setup. Het aantonen van de procedure zal Simone Bovio, een ingenieur en Yuchen Long, een post doc in mijn laboratorium.

Om te beginnen, plaats een stuk van dubbelzijdige tape in het midden van vijf centimeter diameter petrischaal. Voeg een monster van genesium dat is geïsoleerd van een bloemknop aan de tape. Voeg snel water toe aan de schotel totdat het monster volledig bedekt is om uitdroging te voorkomen.

Plaats het monster vervolgens op een AFM-fase en beweeg het hoofd zodat het over het monster gaat. Na het kalibreren van de cantilever, in de software, ervoor te zorgen dat het systeem in QI-modus, en de aanpak van het monster met een set point force van vijftien nano newtons. Stel vervolgens een Z-lengte van vier micron in en stel het scangebied in op tachtig bij tachtig micron in het kwadraat met het aantal pixels ingesteld op veertig bij veertig.

Ga vervolgens naar het paneel geavanceerde beeldvormingsinstellingen en stel de modus in op constante snelheid. Bovendien, stel uit te breiden enter track snelheden tot tweehonderd micron per seconde, en de steekproefsnelheid tot vijfentwintig kilo hertz. Zodra de parameters zijn ingesteld, verplaatst u de tip naar het gebied van belang op het voorbeeld.

Controleer of het te scannen gebied vrij is van vuil, zoek een zo vlak mogelijk gebied en schakel in, begin vervolgens met de scan en gebruik de snelle scan met lage kracht om te controleren of het monster zich verplaatst. Zodra een gebied van belang als gelegen, selecteert u een regio die veertig bij veertig tot zestig door zestig Micron kwadraat, en verhoging van het pixelnummer tot twee pixels per micron. Verhoog vervolgens het ingestelde punt tot vijfhonderd nano newton, om een inkeping van honderd tot tweehonderd nanometer te verkrijgen.

Verlaag de Z-lengte tot twee micron en de voerkanaalsnelheden tot honderd micron per seconde, verhoog vervolgens de monstersnelheid tot vijftig kilohertz en begin met het scannen van het monster. Sla de uitvoer op als een afbeelding en een gegevensbestand als u klaar bent. Open de software voor gegevensverwerking en laad het gegevensbestand.

Klik op de knop Deze kaart gebruiken voor batchverwerking om dezelfde parameters op alle curven van de kaart te gebruiken, ga vervolgens naar vooraf gedefinieerd proces laden en selecteer hertz-pasvorm. Ga vervolgens naar schakelbare basislijnbewerking en stel aftrekken op offset plus tilt en X min tussen de veertig en zestig procent. Selecteer op het tabblad verticale tippositie op gladde strak, als u liever aan ruwe gegevens werkt.

Als u het juiste pasvormmodel wilt selecteren, gaat u naar het tabblad elasticiteitspasta en selecteert u een van de opties op basis van de verwachte hechtingssterkte. Als er geen of zwakke hechting aanwezig is, gebruikt u de benaderingscurve en gebruikt u liever het hertz-isnadermodel. In geval van sterkere hechting, gebruik maken van het model van Dergen Milia Dortoprov of DMD en werken op een retard curve.

Stel nu de tip geometrische parameters op basis van nominale tip vorm. De tip die in dit experiment wordt gebruikt is een bolvormige punt, met een straal van vierhonderd nanometer. Stel vervolgens de Poisson-verhouding in op 0,5 en selecteer shiftcurven.

Voeg een tweede elasticiteitspasroutine toe door op het pictogram bij het hoofdvenster te klikken en herhaal dezelfde parameterinstellingen. Geef ten slotte de gewenste inkeping in X min op en houd deze op alle opties op alle curven van de kaart. Sla de resultaten op om een afbeelding in een dot tsv-bestand te verkrijgen.

Om te meten met snelle oplossingsveranderingen, monteer een monster in een petrischaaltje, met een klein stukje lijm mastiek. Verzegel snel de kloof tussen de mastiek en de monsterbasis met biocompatibele lijm. Wacht tot de lijm te stollen en vervolgens onderdompelen het monster in vloeibare apex cultuur medium, met 0,1 procent plantenconservering mengsel.

Nadat u het systeem hebt gekalibreerd, opent u de acquisitiesoftware en gaat u eerst naar het venster controleparameter. Daar zet de veerconstante aan de vervaardigde veerconstante van cantilever of de bepaalde de lenteconstante. Stel vervolgens de tipradius in op vierhonderd nanometer, de verhouding monsterpoisson op 0,5, de monsterlijn op honderdentwintig om een snelle aanschaf te garanderen, de scansnelheid op 0,2 hertz en de scangrootte op één micron.

Ga dan naar het opritvenster en stel de hellingsgrootte in op vijf micron, de trigdrempel tot maximaal, en het aantal monsters op vierduizend zeshonderd acht. Met alle parameters ingesteld, zorgvuldig aanpak van het monster handmatig. Wanneer de sonde relatief dicht bij het monsteroppervlak ligt, klikt u op nadering.

Verhoog bij contact geleidelijk de scangrootte en wijzig de scansnelheid, totdat een gewenst saldo is bereikt zonder het monster of de tip te beschadigen. Verplaats de scan als het meetgebied niet naar wens is. Wanneer u tevreden bent, klikt u op de knop, wijs en schiet, om het punt te starten en venster te schieten.

Geef een opslagmap en een bestandsnaam op. Klik vervolgens op de helling op de volgende scan om de opname te starten. Wanneer de scan is voltooid, wordt de software-interface omgeleid naar het opritvenster.

Klik op de gescande afbeelding om de posities op te geven die u moet inspringen. Kies ten minste drie inkepings bezienswaardigheden per cel in de buurt van het bessencentrum, stel deze in om de inkeping drie keer per kant te herhalen en klik vervolgens op helling en opname. In de analysesoftware opent u het dot MCA-bestand, dit toont de positie van elke krachtcurve op de gescande afbeelding.

Open vervolgens een krachtcurve om te analyseren. Klik op de knop basislijncorrectie en sleep de blauwe streepjeslijnen op de krachtcurve, totdat de bronbasislijn begint en de bronbasislijnstop wordt verlengd, of op respectievelijk 0 procent en 80 procent. Klik dan op uitvoeren.

Klik vervolgens op de knop autofilter en klik op uitvoeren om de krachtcurve glad te strijken. Klik vervolgens op de inspringingsknop. Stel in het invoervenster de actieve curve in om uit te breiden, de vijfde methode naar het lineaire model, de maximale krachtpastlaag op 99 procent, de minkrachtpastgrens op 75 procent en het pasvormmodel op stijfheid.

Analyseer de krachtcurven in een batch. Klik hiervoor op de knop Run History, geef de rapportmap op en voeg andere krachtcurven toe waarvoor dezelfde behandeling vereist is. Klik als u klaar bent met uitvoeren.

Wanneer de waarde voor K is gemonteerd op de batch, klikt u op de geschiedenis en gaat u naar vijf inspringing om terug te keren naar het inspringingsvenster. Eenmaal daar, verander max force fit grens tot tien procent en min kracht fit grens tot een procent. Stel vervolgens het geschikte model in op Hertzian.

Open vervolgens het juiste bestand om de verschillende gescande kanalen weer te geven. Klik in het venster met hoog kanalen op de sectieknop. Dit zal het mogelijk maken de meting van monster oppervlak kromming die nodig is voor turgor drukaftrek.

Teken vervolgens een lijn over de lange as van één cel, verplaats de streepjeslijngrenzen naar de celranden en noteert de straalwaarde. Ten slotte volgen in het tekstprotocol, om de gemiddelde jonge modulus, lenteconstante, E, K, en de turgor druk voor elke cel te berekenen. De afbeelding aan de linkerkant is een kaart van de jonge modulus, verkregen door het analyseren van de hele inkeping tot aan de gebruiker gedefinieerde kracht set point, terwijl de afbeelding aan de rechterkant, toont het resultaat van de analyse van de eerste honderd nano meter van de inkeping.

Hier, de twee kaarten zien er zeer vergelijkbaar echter, de variatie van de inkeping diepte kan leiden in sommige gevallen beter markeren monster heterogeneties, die nuttig kunnen zijn voor het identificeren van de locatie of voor het verstrekken van informatie over het gedrag van interne structuren. Voor elk punt op deze kaarten is er een onderliggende krachtcurve. De curve hier weergegeven, heeft twee effecten die het vermelden waard zijn.

Ten eerste, als het naderingsgedeelte van de krachtcurve eindigt op vijfhonderd nano newton. De neerwaartse tipbeweging blijft doorgaan. Dit betekent dat de uiteindelijke kracht die door de tip wordt uitgeoefend hoger is dan verwacht.

Het tweede ding om op te merken, is de golf in op de intrekcurve gemarkeerd door de ellips. Een dergelijk zwaaien kan een indicator zijn van het bewegen of trillen van monsters onder de werking van de tip en overschakelen naar een andere fixatiemethode kan nodig zijn. Met behulp van de procedure gedocumenteerd in dit artikel, alle van de belangrijkste parameters voor een turgor drukaftrek, behalve voor de dikte van de celwand kan worden opgehaald van AFM scans en inkepingen.

De krachtcurve van diepe inkeping op de rode kruispositie beschrijft de modulus van de celwand en de schijnbare stijfheid van het monster bij verschillende regimes van de curve. Monsterfixatie is cruciaal. Let tijdens het meetproces op tekenen van instabiliteit van monsters.

Kies zorgvuldig een gebied met vlak oppervlak om loodrechte inkeping te garanderen. Na deze procedure kan men mechanische eigenschappen in de loop van de tijd en verschillende omstandigheden controleren. Men kan ook mechanische metingen met confocale beelden voor correlative studies bedekken.

Deze techniek maakt de weg vrij voor het koppelen van biomechanica aan fysiologieontwikkeling en andere biologische processen.