Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie

Dit pneumatisch geactiveerde microfluïde compressieapparaat kan worden gebruikt om mechanobiologie te bestuderen in 3D hydrogelculturen van groeiplaatchondrocyten. Het microfluïde apparaat is kosten- en tijdeffectief omdat het tegelijkertijd meerdere grootheden van een compressie kan genereren op kleine hoeveelheden monsters, en verschillende microscopische beeldvormingen kunnen met het apparaat worden toegepast. Onze methode kan ook worden toegepast op de studie van mechanobiologie van andere celtypen.

Als u de microkanaallaag wilt instellen, mengt u PDMS eerst met een gewichtsverhouding van 10 prepolymeren tot één uithardingsmiddel gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de mal op een schuimpad en giet het mengsel in de master mal. Ontgde de PDMS 30 minuten in een vacuümkamer en sandwich de ontgaste PDMS met een stuk transparantiefilm.

Klem de ingeklemde montage met de glasplaat, schuimkussens en plexiglasplaten. Genereer de PDMS zes uur lang op 80 graden Celsius en isoleer de PDMS-laag en de transparantiefilm van de ingeklemde structuur. Activeer de oppervlakken van de PDMS en een schone glasplaat met de plasmareiniger gedurende één minuut voordat u de PDMS gedurende 30 minuten op de glasplaat in de 80-graden Celsius-oven bindt.

Verwijder vervolgens de transparantiefilm. Voor de bereiding van het dunne PDMS-membraan, spin coat uncured PDMS op een transparantie film op 1,000 rotaties per minuut gedurende een minuut om een 60 micrometer dikke PDMS laag te verkrijgen. Genees de met de spin gecoate PDMS gedurende 20 tot 30 minuten gedeeltelijk op 80 graden Celsius voordat u de plasmareiniger gebruikt om de microkanaal PDMS-laag op de glasplaat en de dunne PDMS-laag gedurende één minuut te activeren.

Bind vervolgens de dunne PDMS-membraanlaag op de microkanaal PDMS-laag en plaats de lagen 's nachts in de 80 graden Celsius-oven. Voor de bereiding van het buizenblok plaatst u metalen buizen verticaal op een petrischaal en giet u ongezonderd PDMS voorzichtig in de schaal tot ongeveer 3/4 van de buizen onder water zijn gezet. Na het ontgassen van de PDMS in een vacuümkamer gedurende 30 minuten, moet u de PDMS in de oven gedurende meer dan zes uur op 60 graden Celsius laten staan.

Knip aan het einde van het uithardingsproces een stuk PDMS-blok met één buis en sla een gat in de dunne PDMS-laag voor de inlaat. Activeer het PDMS-blok en de dunne PDMS-laag met de plasmareiniger. Bevestig na een minuut het PDMS-blok aan het inlaatgat van de dunne PDMS-laag en plaats de gehele actuatie-eenheid 's nachts op 80 graden Celsius.

Voor agarose gel schimmel voorbereiding, meng 5%agarose en 200 millimolar calciumchloride in gedeïmiseerd water en verwarm de agarose gel oplossing tot het koken. Giet de gekookte agarose gel oplossing in een aluminium mal en sandwich de mal met de glasplaat. Verwijder na vijf minuten de gestolde agarosegel uit de aluminiummal.

Plaat 150 microliters van alginaat-chondrocyte oplossing op de aminosilanized glasplaat en bedek de oplossing met agarose gel schimmel gedurende drie minuten. Gebruik aan het einde van de incubatie een scheermesje om de overmatige alginaatgeloplossing te verwijderen en de agarose gelmalt mal van de plaat te verwijderen. Plaats vervolgens de alginaat-chondrocyte constructies in cross-linking oplossing met 50 millimolar calciumchloride en 140 millimolar natriumchloride in gedeïmiseerd water gedurende een minuut.

Om het apparaat te monteren, lokaliseert u vier een millimeter dikke PDMS-afstandshouders op de vier hoeken van de dunne PDMS-laag van de actuatie-eenheid. Bedek de luchtkamers van de dunne PDMS-laag met 700 microliters van chondrocyte cultuurmedium. Plaats met behulp van een stereomicrosope de alginaat-chondrocyteconstructie op de dunne PDMS-laag, zorg ervoor dat de constructies met de luchtkamers worden uitgelijnd en klem het apparaat met 3D-geprinte klemmen.

Gebruik voor de bediening van het apparaat een stukje siliciumslang om de uitlaat van een luchtpomp aan te sluiten op de inlaat van een solenoïde klep. Gebruik een extra stuk slang om de uitlaat van de solenoïde klep aan te sluiten op de inlaat van het gemonteerde apparaat. Sluit de solenoïde klep aan met een functiegenerator en gebruik een vierkante golf van één hertz die door de functiegenerator wordt gegenereerd om de solenoïde klep te manipuleren.

Zet vervolgens de luchtpomp aan om het apparaat pneumatisch te bedienen. De microfluïde chondrocyte compressie-apparaat bevat vijf bij vijf arrays van cilindrische alginaat-chondrocyte constructies en deze constructies kunnen worden gecomprimeerd met vijf verschillende grootheden van compressie. In dit voorbeeld werd de gelkolom met 33,8% in hoogte gecomprimeerd door de grootste PDMS-ballon en de resulterende drukspanning van de gelconstructies steeg met ongeveer 5% per toename van 0,2 millimeter en de PDMS-ballondiameter.

Compressieve vervorming van de chondrocyten werd bepaald door beeldvorming van de cellen in een 613 door 613 door 40 tot 55 micrometer volume in de buurt van de gel construct centrum. Hier wordt een afbeelding getoond van een chondrocyte die met 16% werd gecomprimeerd door de grootste PDMS-ballon. In deze grafiek kan de verdeling van de gemeten celcompressiestamwaarden worden waargenomen.

In deze analyse werden de cellen meer in het algemeen gecomprimeerd door grotere PDMS-ballonnen. Samen suggereren deze gegevens dat de hoeveelheden alginaatgel en chondrocytecompressie worden gecontroleerd door de diameter van de PDMS-ballonnen onder een constante druk van 14 kilopascals. Om de herhaalbaarheid van de prestaties van het apparaat te garanderen, is het van cruciaal belang een dun PDMS-membraan met een constante dikte en elasticiteit te creëren.

Na deze procedure kunnen verschillende biologische tests worden uitgevoerd, zoals immunofluorescentie en in situ hybridisatie. Met behulp van deze techniek kunnen veel vragen over mechanotransducductie in groeiplaat of articulaire chondrocyten worden beantwoord.