Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Dit protocol is met name relevant omdat het de detectie en selectie van enkele cellen uit een pool van gemengde cellen mogelijk maakt voor latere downstream-analyse met een resolutie van één cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het potentieel om individuele circulerende tumorcellen, of CTC's, te scheiden van bloedcellen voor een reeks analyses die een hoge zuiverheid vereisen. Begin met het opstarten van de micromanipulatorsoftware en het inschakelen van de micromanipulator.

Sluit de micromanipulator aan op de computer en klik op Verbinding maken en initialiseren apparaat om de robotarm in de microscoopfase te initialiseren. Reinig de externe en interne oppervlakken van de beschermkast met ethanol en sluit de beschermkast na elke manipulatie van de machine om het apparaat door de computer te kunnen manoeuvreren. Installeer een nieuwe 20 tot 30 micrometer glazen capillaire op de robotarm en spoel systeemolie door het systeem om eventuele bellen in de slang te verwijderen.

Vul sterilisatie tank een met 70%ethanol, sterilisatie tank twee met steriel nuclease-vrij water, en de buffer tank met steriele Dulbecco's PBS. Steriliseer de capillaire twee keer met 70%-ethanol en vervang sterilisatietank één door sterilisatietank twee om de sterilisatiefunctie te gebruiken om de capillaire in water minstens drie keer te wassen. Start in de software voor micromanipulator een nieuw experiment en selecteer het type plukexperiment in de automatische en handmatige selectiemodi.

Configureer de deklade om de posities van de sterilisatietank, buffertank en deponerende lade op te geven en stel de temperatuur van de vloeistoftanks in de geselecteerde deponerende lade in op vier graden Celsius. Plaats een ultralaage bevestigingsplaat met de vrijgekomen CTC-oplossing onder de micromicromanipulatorkast. Haal het deksel van de plaat en sluit de kast.

Centrifuge een 384-well plaat met 20 microliters van CTC cultuur medium per goed om ervoor te zorgen dat het medium wordt afgezonderd aan de onderkant van elke put en plaats de plaat in het doel een positie van de vier graden Celsius geselecteerde deponerend lade. Selecteer handmatig de microscoopdoelstelling voor het plukken en de belichtingstijd van alle benodigde kanalen. Selecteer Well Navigator weergeven om het type ophaalplaat te visualiseren en te selecteren.

Kalibreer vervolgens een ophaalpositie in het midden van de put met de CTC-oplossing zonder cellen in het midden van het gezichtsveld. Gebruik de sensor om de onderkant van de plaat voorzichtig aan te raken met een capillair en de ophaalpositie op 0,05 millimeter boven de bodem van de plaat in te stellen. Laat de robotarm voorzichtig met 10 micrometer per keer zakken om beschadiging van de capillaire te voorkomen.

Selecteer het celtype en de pickparameters. Selecteer de handmatige modus voor het kiezen van één cel. Gebruik de joystick om de glazen capillaire navigeren in de put en plaats de capillaire op de top van een enkele cel van belang ten minste een millimeter van de put grens.

Voeg vervolgens handmatig deeltjes toe en selecteer Geactiveerde deeltjes kiezen om het plukken te starten. Wanneer alle cellen zijn geplukt, centrifugeren de plaat om sediment de cellen op de bodem van elke put. Bio-amino kleuring met anti-epitheelcelheemcuuleenlichaam antilichaam maakt de visualisatie van kankercellen in de suspensie met een nauwkeurig onderscheid van CD45 positieve gebeurtenissen.

Nauwkeurige CTC isolatie wordt gekenmerkt door de aspiratie van alleen het gewenste doel zonder de omringende verontreinigingscellen. Zoals vermoed, CTC clusters tonen een toename van de overleving in vergelijking met enkele CTC's, waardoor de aanleiding voor celkolonies binnen 56 dagen na in-vitro cultuur. Met name CTC clusters vertonen ook een hogere proliferatie snelheid en dus bereiken hogere uiteindelijke celnummers, wat aangeeft dat het directe contact met andere tumorcellen heeft een impact op zowel de levensvatbaarheid van tumorcellen en proliferatie tarief.

Single-cell RNA sequencing van CTC's direct geïsoleerd van borstkanker patiënten onthult een T-gedistribueerde stochastische buurman inbedding van single-cellen afgeleid van enkele CTC's, CTC clusters, of CTC witte bloedcellen clusters. Vergeet niet om de glazen capillaire te installeren om luchtbellen te verwijderen in het fluidic systeem van de micromanipulator en om de pick-up positie te kalibreren om een efficiënte single-cell picking te garanderen. De single-cells kunnen worden gezaaid of verder verwerkt voor de volgende generatie sequencing om ex-vivo analyse en CTC karakterisering mogelijk te maken op een single-cell resolutie om het gemetastaseerde proces te onderzoeken.