Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

Ons protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen van muismodellen gereconstitueerd met menselijke PBMC en tumoren voor immuno-oncologie onderzoek. Deze procedures bieden een kosteneffectieve en zeer reproduceerbare aanpak voor het gedeeltelijk reconstrueren van menselijke immuniteit bij menselijke tumordragende muizen door onderhuids en mengen van menselijke PBMC met kanker xenografts. Het demonstreren van de procedures met mij zal Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai en Xiaolong Yang, stuurde ons van de afdeling Farmacologie.

Voor myeloïde cel uitputting intra peritoneally leveren 100mg per kilogram cyclofosphamide en mondeling leveren 125mg per kilogram disulfiram tot zes tot acht weken oude NOD / SCID vrouwelijke muizen eenmaal per dag gedurende twee dagen. 24 uur na de tweede dosis cyclofosfchimde en disulfiram, vijf maal 10 van de zes vers geïsoleerde menselijke PBMC en 2,5 keer 10 van de zes menselijke tumorcelcellen en 200 microliter pbs plus 50% metrogel per dier en het gehele volume onderhuids in de rechterflank van elk proefdier injecteren. Meet en neem het primaire tumorvolume twee keer per week gedurende vier tot zes weken vast.

Wanneer de tumoren een gemiddeld volume van 200 tot 500 millimeter in blokjes bereiken, gebruik optomische schaar om hele tumor van elk dier te oogsten. PBMC donoren tumorcellijnen en patiënt afgeleide xenografts die resulteren in een matige tumorgroei met relatief hoge PD-1, PD-L1 en CD8 expressie moeten worden gebruikt voor latere analyse. Voor immunohistochemische analyse van de geoogste tumorweefsels, bevestig de monsters en formaline 24 tot 72 uur voor uitdroging en inbedding van de weefsels in paraffine.

Verkrijg drie micrometersecties van de ingebedde weefsels op met polylysine gecoate glijbanen en deparaffine de monsters met drie xyleenonderdomies van zeven minuten. Hydrateer na de derde behandeling de secties met drie minuten gesorteerde alcoholonderdompeling. Spoel vervolgens de glijbaan drie keer in gedeïioneerd water en verwijder overtollige vloeistof uit de glijbanen.

Om antigeen retrieval uit te voeren, plaatst u de dia's in een container en dekt u de dia's af met een buffer van 10 millimolar sodiocitrate. Verwarm de glijbanen, container, in een magnetron gedurende drie minuten voor het plaatsen van de dia's in een 95 graden Celsius waterbad voor 30 minuten. Na het afkoelen tot kamertemperatuur, spoel de glijbanen drie keer in gedeïsatiseerd water en aanzuigen overtollige vloeistof uit de glijbanen.

Incubeer met 0,3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten om endogene peroxidaseactiviteit te blokkeren, gevolgd door blokkering met 3%BSA en PBS gedurende een uur. Aan het einde van de waterstofperoxide incubatie, label de dia's met de juiste primaire antilichamen op vier graden Celsius 's nachts. Behandel de dia's de volgende ochtend met mierikswortelperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur voordat u het substraat dropwise op de glijbanen toepast totdat een passend niveau van bruine vlekken wordt waargenomen door lichte microscopie.

Vervolgens bevlekken de monsters met hematoxylin. Na een minuut, stop de reactie met gedestilleerd water gevolgd door een vijf seconden onderdompeling in 0,5% zoutzuur alcohol en vijf seconden in 0,5%ammoniak water. Droog vervolgens de monsters uit met drie oplopende drie minuten ethanol en drie, vijf minuten xyleen onderdompeling.

Om de antitumoractiviteit van een kandidaat-medicijn van belang te beoordelen, start u de behandeling op de dag van de celinenting volgens het geplande experimentele protocol en controleert u het primaire tumorvolume twee keer per week gedurende vier tot zes weken. Voor PharmaCODE dynamische analyse van de tumor geïnfiltreerd immuuncellen, gehakt de tumor weefsels in kleine stukjes en verteren de fragmenten met collagenase type een en DNase I en RPMI-1640 medium plus 5%FBS gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de spijsvertering, filter het verteerde weefsel door een 40 micrometer celzeef om een enkele cel suspensie te verkrijgen en de cellen te verzamelen door middel van centrifugatie.

Resuspend de pellet op een een keer 10 van de zevende cellen per milliliter van ijskoude faxbuffer concentratie en breng een gelijk volume van de cellen naar het juiste aantal putten in een 96-goed ronde bodemplaat. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellets in 20 microgram per milliliter van de menselijke IGG gedurende 30 minuten om een niet-specifieke binding te blokkeren. Vlek vervolgens de cellen met de juiste primaire antilichamen gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius vóór hun analyse door stroomcytrie volgens standaardprotocollen.

Zoals aangetoond, 100 milligram per kilogram cyclofosfaag en 125 milligram per kilogram disulfiram myeloablation resulteert in een aanzienlijke uitputting van neutrofielen en monocyten vier dagen na de behandeling. Na menselijke PBMC en tumortransplantatie kan de aanwezigheid van menselijke immuuncelinfiltreren worden geverifieerd binnen de tumormicro-omgeving door immunohistochemie. Een in vivo screening van een panel van PBMC-donoren kan worden uitgevoerd om de aanwezigheid van een relatief hoge immuuncelinfiltratie in de tumormicro-omgeving te bevestigen in een aanvaardbaar tumorgroeipercentage.

Menselijke kankercellijnen in patiënt afgeleide xenografts van verschillende soorten kanker kunnen ook worden geëvalueerd om de tumorgroei en immuuncelinfiltratie te beoordelen. In dit representatieve experiment resulteerden de behandeling van het PBMC en geënt gehumaniseerde muizen met gehumaniseerd anti-PD1-antilichaam in significante antitumoractiviteiten. Disulfiram vermindert urotoxiciteit van cyclofosfaag, de combinatie kan langere neutropenie-effecten bij muizen uitoefenen.

De exacte dosis regime van cyclofosfdiamde en disulfiram kan nodig zijn om vooraf te bepalen. Nieuwere stammen van meer immunodeficiënte muizen voor gemakkelijkere herindeling van menselijke immuniteit en verminderde xenogene GvHD-effect zijn vastgesteld en zijn in afwachting van verdere onderzoeken met ons gedocumenteerde protocol. Ons model is nuttig voor de evaluatie van T-cel boeiende kanker immuuntherapieën, met name bij het werken aan korte tijdlijnen of voor het selecteren van agenten voordat u naar een meer complexe multilineage immuniteit model.