Name: Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Leer de voorbereiding van muisnetvlies cryosecties voor immunohistochemie met behulp van fixatie, OCT-inbedding en cryostaat snijden. Dit protocol levert hoogwaardige secties voor gedetailleerde analyse van retinale celstructuren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door fondsen van NIH (RO1-GMO97327) en de Universitaire Stichting van het onderzoek (UPenn). Wij danken Svetlana Savina vooral voor haar hulp bij de ontwikkeling van het Immunohistochemistry protocol, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) en de Penn vet Imaging Core voor hulp bij microscopie en Leslie King, Ph.D. voor kritisch lezen van dit manuscript .

Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de nationale instituten van de gezondheidsgids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren die door het Instituut voor laboratorium dierlijke hulpbronnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en het gebruik Comite van de Universiteit van Pennsylvania.
Alle gereedschappen en apparatuur voor de methoden worden weergegeven in Figuur 1 en vermeld in de tabel van materialen.
1. Muis Eye enucleation, Eye Cup dissectie, en inbedding
<ol><li>Euthanaseren muizen met kooldioxide (CO2), gevolgd door een onthoofding (postnatale muizen P0-P11) of cervicale dislocatie (Adult > P11 muizen). Voor P0-P14 muizen, zijn de ogen bedekt door de huid. Zorg ervoor dat de huid te verwijderen voordat de volgende stappen.</li>
	<li>Markeer de temporele deel van het oog (Figuur 2a) door een beetje branden het hoornvlies met behulp van een staart cauterizer. Vermijd het branden van een gat in het hoornvlies door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde met de cauterizer.</li>
	<li>Onmiddellijk enucleate muis ogen met behulp van gebogen Dumont #5/45 Tang. Incubeer gedurende 15 min in een 1,5 mL cryotube buis met 1 mL van 4% Paraformaldehyde (speels) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op het ijs.</li>
	<li>Na 15 min in 4%-punt, breng het vaste oog met behulp van de gebogen Tang Dumont #5/45 naar een aangepaste 35 mm dissectie schotel (Zie tabel van materialen en figuur 1c) gevuld met PBS en plaats onder ontleden Microscoop.</li>
	<li>Maak een kleine incisie op het brandmerk, loodrecht op en net boven de limbus (grens van het hoornvlies) met behulp van de micro-mes.</li>
	<li>Steek de gebogen schaar in de incisie en voer een omtrek snede van het hoornvlies na de limbus (Figuur 2b).</li>
	<li>Verwijder het hoornvlies en pak de lens met een dunne Dumont #5 Tang, (Figuur 2b) en til het delicaat weg van het achterste gedeelte van het oog. Het glaslichaam, de heldere gel die de ruimte tussen de lens en het netvlies vult, zal komen met de lens (Figuur 2b) en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste Eye Cup. Zorg ervoor dat er geen zichtbare schade aan het netvlies, zoals gaten of tranen (figuur 2c).</li>
	<li>Was het oog cups tweemaal in 1 mL PBS voor 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Cryoprotect het oog cups door equilibrating ze in een oplossing van 15% sacharose in PBS overnachting bij 4 ° c tot de Eye Cup zinkt</li>
	<li>Breng de Eye cups naar 30% sacharose in PBS voor 2-3 h tot de Eye Cup daalt.</li>
	<li>Embed de Eye cups in OCT in 10 x 10 mm cryomolds (Figuur 3a). Met behulp van een ontleden Microscoop, oriënteren het oog in de cryomold langs de dorsale-buik-as (figuur 2D, Figuur 3a) door het roteren van het oog tot het branden merk is op de top, de oogzenuw is aan de linkerkant en de cut-out deel van de mal gezichten het recht ( Figuur 2D). Zorg ervoor dat bubbels in de buurt van het weefsel te vermijden. Opmerking: om de Eye Cup te manipuleren, gebruik dan een titanium sonde gemaakt van een titanium draad bevestigd aan een pipet tip.</li>
	<li>Om het netvlies te breken, dompel de cryomold gedurende ten minste 5 min in een metalen beker met isopentane en plaats het bekerglas in vloeibare stikstof of droog ijs/100% ethanol bad (tot 1/3 van de hoogte van de metalen beker). Let op: de cryomold moet worden ondergedompeld in isopentane tot meer dan de helft van de hoogte, maar hoeft niet volledig onder te dompelen.</li>
	<li>Verwijder het bevroren blok en wikkel het in aluminiumfolie.</li>
	<li>Opslag bij-80 °C.</li>
	<li>Markeer de bevroren blok met behulp van een pen of Sharpie om de oriëntatie van het blok (Figuur 3b) vast te leggen.</li>
</ol>2. Secties met een cryostat
<ol><li>Na het aanpassen van de cryostat temperatuur (tussen-20 en-25 ° c), laat de mallen met de embedded Eye cups equilibrate aan de cryostat temperatuur voor 1 uur.</li>
	<li>Installeer het blok met dorso-buik oriëntatie (figuur 3c) en snijd 10 µm dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvlies secties op geannoteerde en genummerde Microscoop dia's.</li>
	<li>De dia's van de opslag in schuif dozen bij-20 °C of-80 °C tot IHC procedures.</li>
</ol>3. Fluorescentie immunokleuring met het schuif rek
Opmerking: de dia rack systeem (bijv. Sequenza) houdt de glazen Microscoop dia's met een afdekplaat, het creëren van een ~ 100 µ L capillaire kloof tussen de dia en de plaat.
<ol><li>Ontdooi de Cryo-secties bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h tot 4 uur om ze te laten drogen en hechten aan Microscoop dia's. Let op: het is ook mogelijk om ze te drogen bij 30-37 °C voor 30 min tot 1 uur.</li>
	<li>Plaats dia's in dia rek en was de retinale secties tweemaal in 100-200 µ L PBS voor 2 min.</li>
	<li>Permeabilize de netvlies secties door incubatie hen in 0,25% Triton-X/0,05% NaN3in PBS voor 5 min bij RT.</li>
	<li>Voeg 100 µ L van het blokkeren van oplossing voor de dia's.</li>
	<li>Voeg 100 µ L van primair antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing voor de dia's.</li>
	<li>Incubeer retinale secties overnachting op 4 ˚ C. Opmerking: gedurende deze tijd, bedek de dia rek om uitdroging van de secties te voorkomen.</li>
	<li>Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min, gebruikend 200 µ L PBS. Nota: de toevoeging van 0,001-0,002% Triton-X100 aan PBS (PBS-T) staat een strengere was toe maar kan sommige membranen en cellulaire structuren verstoren.</li>
	<li>Incubeer retinale secties in fluorescerende-gelabelde secundaire antilichamen voor 1 h bij RT. Van nu af aan te beschermen tegen licht.</li>
	<li>Was de retinale secties 3 keer, elk voor 15 min.</li>
	<li>Incubeer de netvlies secties op RT voor 5 min met een nucleaire marker zoals Hoechst 33342 of DAPI oplossing.</li>
	<li>Was de netvlies secties 1 keer voor 15 minuten.</li>
	<li>Plaats een dekglaasje op de top van een papieren handdoek op het lab bankje.</li>
	<li>Voeg 2 druppels anti-fading montage media naar het midden van de dekglaasje.</li>
	<li>Draai de schuif om de retinale Cryo-sectie naar beneden te hebben.</li>
	<li>Voorzichtig Monteer de dekglaasje langzaam, op een ~ 45 ˚ hoek, tip de dia op de montage media. Opmerking: het vermijden van het vormen van bubbels als je de dia op zijn plaats lager.</li>
	<li>Breng zelfs druk, met behulp van een zware boek of catalogus (zie hieronder), om de dia-dekglaasje combinatie om overtollige montage media te elimineren. Nota: om consistentie in steekproefvoorbereiding te verzekeren, gebruik altijd het zelfde voorwerp, (d.w.z., het zelfde boek of de catalogus) om zelfs druk aan de dekglaasje tijdens dia montage toe te passen.</li>
	<li>Houd plat en laat verharden 's nachts op RT in het donker. Op te slaan dia's plat bij 4 °C voor onbepaalde tijd.</li>
	<li>Beeld via breed veld of confocale fluorescentie microscopie (Figuur 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Geen onthullingen.

Muis Retina dissectie is een delicaat proces te wijten aan de kleine omvang en de vorm van muis ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies weefsel. Hoewel het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige dissectie is een kwestie van de praktijk, met een gedetailleerd protocol, het verstrekken van efficiënte methoden en tips is een noodzaak om het netvlies secties en IHC te verkrijgen. In aanvulling op de hier beschreven protocollen, zijn er verschillende tips die het mogelijk maken voor een consistente hoge kwaliteit netvlies s...

Immunohistochemistry (IHC) is een krachtige techniek voor het lokaliseren van specifieke eiwitten en cellulaire structuren in weefsels in situ1,2,3. Ongepaste fixatie methoden en sub-optimale afdeling van complexe weefsels kan verstoren weefselstructuur, het genereren van hoge achtergrond vlekken of te verminderen antilichaam-epitope interacties, wat resulteert in vlekken artefacten en daaruit voortvloeiende verkeerde interpretatie van IHC gegevens4. Als de gewervelde Retina is een complex en zeer georganiseerd neuraal orgaan bestaat uit lagen van onderling verbonden fotoreceptoren, interneuronen en ganglioncellen, het is zeer kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verstoord tijdens de dissectie en de sectie. Een gedetailleerd, gestandaardiseerd, en gevalideerd Protocol van muis oog dissectie en oriëntatie naar immunokleuring zal helpen aanzienlijk verminderen IHC artefacten, waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten en waardoor meer accurate vergelijkende gegevens Analyse.
Er zijn vele protocollen voor weefsel voorbereiding voor IHC, echter, niet zijn allen geschikt voor netvlies weefsel. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin behouden de netvlies structuur tijdens dissectie en sectioning5. Helaas, sterke Fixatieven vaak leiden tot de versterkte achtergrond fluorescentie en epitope masking als gevolg van de chemische modificatie van epitopes6. Aan de andere kant, mildere Fixatieven, net als 4% Paraformaldehyde (toppunt) kan verlichten sommige van deze artefacten, maar vereisen nauwgezette dissectie en het delen van de optimale retinale structuur te behouden. Het snel doordringen van het gaasweefsel, maar dwars-verbindingen proteïnen zeer langzaam, verminderend het risico van epitope masking. Sinds korte tijd is de incubatie van het middel een vrij milde fixatie, vereisen de weefsels vaak het snelle bevriezen om antigenen te bewaren. Het is belangrijk om te voorkomen dat ijs kristalvorming tijdens het bevriezen van weefsels als ze vervormen en beschadiging van de integriteit van cellen en weefsels7.
Hier beschrijven we gedetailleerde en gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, fixatie, en Cryo-bescherming van de muis oculaire achterste cups die consistente en betrouwbare IHC gegevens opleveren.

<table><tbody><tr><td>6qt. Roestvrij stalen beker (185 x 218mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Voor vloeibare stikstof (Figuur 1E)</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cauterizer&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Om de oogoriëntatie te markeren (Figuur 1A)</td></tr><tr><td>Gebogen pincetten, Dumont #5/45 pincetten, 45-graden gebogen&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#72703-D</td><td>Voor enucleatie en onderhoud van muizenogen (Figuur 1A)</td></tr><tr><td>Gebogen schaar, Vannas Spring Scissors - 2,5 mm snijrand&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Om de cornea omtrent te snijden (Figuur 1B)</td></tr><tr><td>35 mm dissectiebak bedekt met tandheelkundig was</td><td></td><td></td><td>Voor het dissekeren van de oogbeker (Figuur 1C)</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop&nbsp;</td><td>Leica, Houston, USA&nbsp;</td><td>MZ12.5 High-performance stereomicroscope</td><td></td></tr><tr><td>Micro Knives - Plastic Handgreep&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Om een kleine insnijding te maken bij de brandplek (Figuur 1A)</td></tr><tr><td>Roze tandheelkundig was&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>#72660</td><td>Voor het coaten van de dissectiebak</td></tr><tr><td>Glijmiddel en dekplaat</td><td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>Voor retinale IHC (Figuur 1G)</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen beker (89 x 114mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>Voor isopentaanbad (Figuur 1E)</td></tr><tr><td>Styrofoam doos</td><td></td><td></td><td>Voor geïsoleerde koelbox</td></tr><tr><td>Dunne pincetten Dumont #5&nbsp;&nbsp;</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Om de cornea te verwijderen en de lens te extraheren (Figuur 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold&nbsp; (10mm x 10mm x 5mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>Vorm voor OCT-inbedding</td></tr><tr><td>Buffers en reagentia</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Blockingoplossing</td><td></td><td></td><td>2% normaal paardenserum, 1,5% koude vishuidjegel (bij 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovien serumalbumine (cat #AK1391-0100) in permeabilisatiebuffer.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (anti-fade mounting media)</td><td></td><td></td><td>Onder de afzuigkap 0,337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) oplossen in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&nbsp; Aanpassen naar pH 8-8,5 met 12N HCl (~ 5 druppels).&nbsp; Bewaren in een amberkleurig druppelflesje bij 4&deg;C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stock</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 mg/ml in PBS (1000x). Geportioneerd en bewaard in het donker, bij 4&deg;C voor maximaal 1 jaar of bij -20&deg;C voor langetermijnopslag. Bereid vers&nbsp; op 1 ug/mL (1x)&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopentaan, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) in PBS</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>#15710</td><td>Verversen van 4% PFA uit 16% PFA stock. Bewaar de resterende 16% PFA bij 4&deg;C in het donker.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permeabilisatieoplossing</td><td></td><td></td><td>PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3.&nbsp; Vers bereiden.</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/L Na2HPO4, pH 7,4.&nbsp; Bereid uit 10x stock&nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose oplossingen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Los het juiste bedrag sucrose op in&nbsp; 37&deg;C PBS (neemt ~15 min om op te lossen). Kan een paar dagen bewaard worden bij 4&deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT-compound&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Om horinzotale cellen te labelen&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>Om GABAerge amacrine cellen te labelen</td></tr><tr><td>anti-GS</td><td>BD Transduction</td><td>610517</td><td>Om Müller cellen te labelen</td></tr><tr><td>anti-rhodopsine</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>Om staafjes te labelen</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de muis netvlies cryo-profielen voor immunohistochemistry

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

De voorbereiding van hoge-kwaliteit muis oog secties voor Immunohistochemistry (IHC) is van cruciaal belang voor de beoordeling van de netvlies structuur en functie en voor het bepalen van de mechanismen ten grondslag liggen aan het netvlies ziekten. Het handhaven van structurele integriteit in het weefsel preparaat is van vitaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare retinale IHC gegevens, maar kan uitdagend zijn als gevolg van de kwetsbaarheid en complexiteit van het netvlies cytoarchitecture. Sterke Fixatieven zoals 10% formaline of de oplossing van Bouin de retinale structuur optimaal te bewaren, belemmeren zij vaak IHC analyse door de achtergrond fluorescentie en/of afnemende antilichaam-epitope interacties, een proces te verbeteren dat als epitope masking wordt bekend. Milder Fixatieven, aan de andere kant, zoals 4% Paraformaldehyde, vermindert de achtergrond fluorescentie en epitope-masking, nauwgezette dissectie technieken moeten worden gebruikt om het netvlies structuur te behouden. In dit artikel presenteren we een uitgebreide methode om muis oculaire achterste cups voor IHC die voldoende is om de meeste antilichaam-epitope interacties te behouden zonder verlies van retinale structurele integriteit te bereiden. Wij omvatten vertegenwoordiger IHC met antilichamen aan diverse retinale cel type tellers om weefsel behoud en richtlijn onder optimale en sub-optimale voorwaarden te illustreren. Ons doel is het optimaliseren van IHC studies van het netvlies door het verstrekken van een compleet Protocol van oculaire posterior Cup dissectie IHC.

Om te illustreren hoe deze protocollen, zorgen voor een optimale retinale bewaring voor IHC, we probed netvlies secties van P28 WT muizen (C57BL/6N) met antilichamen tegen rhodopsine (een fotoreceptor marker)8, glutamine acid decarboxylase 65 (Gad65, een amacrine cel marker)9, glutamine SYNTHETASE (GS, een Müller-cel marker)10, en calbindin (een horizontale cel marker)11 (F...

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC). Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Muis retinale dissectie is een echt delicaat proces als gevolg van de grootte en vorm van de ogen en de kwetsbaarheid van het netvlies sectie. Noodzakelijk om te oefenen, met een gedetailleerd protocol dat efficiënte methode en tips bieden is de sleutel tot hoge kwaliteit retinale dissectie en sectie. We geven tips en advies om onderzoekers te helpen veelvoorkomende valkuilen te vermijden en een aantal hoogwaardige netvliessecties te verkrijgen die geschikt zijn voor immunohistochemie.Markeer het tijdelijke deel van het oog van een geëuthanaseerde muis met behulp van een staart cauterizer door het aanraken van het hoornvlies zeer licht en voor niet meer dan een fractie van een seconde om iets te branden het hoornvlies en vermijd het maken van een gat. Onmiddellijk daarna gebruikt gebogen Dumont 545 tangen om muisogen te geven. Plaats de ogen in een 1,5 milliliter cryotube met een milliliter van 4%PFA en PBS en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.Breng vervolgens de vaste ogen met behulp van de gebogen Dumont 545 tangen over naar een gemodificeerde 35 millimeter dissectieschotel gevuld met PBS en plaats onder ontledenmicroscoop. Gebruik een micromes om een kleine incisie te maken bij de brandwond loodrecht op en net boven de limbus grens van het hoornvlies. Steek gebogen schaar in de incisie en voer een omtreksnede van het hoornvlies na de limbus.Dan, met behulp van dunne Dumont 5 tangen, verwijder het hoornvlies, extract van de lens, en til het subtiel uit de buurt van het achterste gedeelte van het oog. Het glasvocht lichaam zal komen met de lens en het netvlies zal zichtbaar zijn als een wit oppervlak dat de binnenkant van de achterste oogbeker. Was de geïsoleerde oogcups twee keer in één milliliter PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Om de oogbekers te cryo-beschermen, equilibrate ze in 15% sacharose en PBS 's nachts op vier graden Celsius totdat ze zinken. Breng vervolgens de oogcups over naar 30% sacharose en PBS gedurende twee tot drie uur totdat ze zinken. Plaats de oogcups in OCT in 10 bij 10 millimeter cryo-mallen voor inbedding.Onder een ontledende microscoop, oriënteren het oog in de cryo-mal langs de rug ventrale as door het draaien van het oog tot de brandwond is op de top. De oogzenuw is een van de linker en de uitgesneden deel van de mal gezichten aan de rechterkant. Om het netvliesweefsel te bevriezen, dompelt u de cryo-mal gedurende ten minste vijf minuten onder in een metalen beker met isopentane en plaatst u het bekerglas in vloeibare stikstof tot een derde van de hoogte van het bekerglas.Verwijder het bevroren blok, wikkel het in aluminiumfolie en bewaar op min 80 graden Celsius. Gebruik een pen of Sharpie om het bevroren blok te markeren om de afdrukstand op te nemen. Na het aanpassen van de cryostat temperatuur tussen min 20 en min 25 graden Celsius, plaats de mallen met de ingebedde oogcups binnen en laat ze in evenwicht zijn met de cryostat temperatuur gedurende een uur.Installeer het blok in de cryostat met de rug ventrale oriëntatie en beginnen met het snijden van 10 micrometer dikke seriële secties. Plaats voorzichtig de netvliessecties op geannoteerde en genummerde microscoopdia's en bewaar vervolgens in diadozen bij min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor immunostaining. Immunohistochemie met antilichamen tegen rhodopsine, een fotoreceptormarkering, glutaminezuur decarboxylase 65, en amacrine celmarker, glutamine synthetase en Muller-celmarker en calbindin, een horizontale celmarker, werd uitgevoerd op netvliessecties.De resultaten geven aan dat dit protocol levert hoge kwaliteit en goed bewaard netvlies secties in tegenstelling tot in slechte kwaliteit retinale secties verkregen uit een ander protocol. Rhodopsine rijke binnenste en buitenste segmenten blijven verticaal en intact met weinig tot geen scheiding van bovenalig het netvlies gepigmenteerde epitheel. Interneuronen, zoals Gad65 positieve amacrine cellen, blijven goed gestratificeerd binnen de binnenste nucleaire laag en binnen plexiforme laag.Ook Muller cellen blijven goed bewaard met soma goed uitgelijnd in cytoplasma processen die zich uitstrekken van de ganglion cellaag naar de buitenste nucleaire laag. Bovendien zijn goed gedefinieerde horizontale cellen detecteerbaar bij de binnenste kernlaag en buitenste plexiforme laagrand. Het is belangrijk om de topper regio van de ogen te markeren en de oriëntatie te behouden tijdens het inbedden.Bereid paraformaldehyde altijd onder de motorkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

preparation-of-mouse-retinal-cryo-sections-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Wij beschrijven een protocol voor transcardiale perfusie van muizen, het verwijderen en doorsnijden van de hersenen, evenals immunoperoxidasekleuring, inbedding in hars en ultradunne doorsneden van de hersencoupjes. Na voltooiing van deze procedures is het immuungekleurde materiaal klaar voor onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie.

Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Het doel van dit verslag is om te beschrijven van het protocol voor robuuste immunohistochemische detectie van epigenetische markers, 5-methylcytosine (5mC) en 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) bij de ontwikkeling en postmitotic muis netvlies.

Immunohistochemische detectie van 5-Methylcytosine en 5-Hydroxymethylcytosine bij de ontwikkeling en Postmitotic muis Retina

Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Dit protocol schetst de gedetailleerde stappen van het pre-embedden van immuno-elektronenmicroscopie, met een focus op het verkennen van synaptische circuits en eiwitlokalisatie in het netvlies.

Onderzoek naar retinale circuits en moleculaire lokalisatie door pre-embedding immuno-elektronenmicroscopie

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring 

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Leer de voorbereiding van muisnetvlies cryosecties voor immunohistochemie met behulp van fixatie, OCT-inbedding en cryostaat snijden. Dit protocol levert hoogwaardige secties voor gedetailleerde analyse van retinale celstructuren.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Meer video's verkennen