Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Eiwit-eiwit interactie in transcriptie is traditioneel bestudeerd met behulp van Por dialyse. Por dialyse is echter puur kwantitatief. We gebruiken biolayer interferometrie, of BLI, om dit probleem te overwinnen.

In vergelijking met Por dan, BLI detecteert real-time associatie en dissociatie tussen binding partners. Het genereert ook kwantitatieve kinetische parameters, die indicatief zijn voor interactiemechanismen. BLI-technologie klinkt misschien intimiderend, maar het is niet moeilijk om te leren Om deze technologie te gebruiken, moet men de toegang hebben tot een BLI-instrument en de bijbehorende software.

Deze video stelt u in staat om u gemakkelijk aan te passen aan de BLI-technologie. Ongeveer 10 minuten voor het begin van een test, pipet 200 microliters van de BLI buffer in een PCR buis. Verwijder een nikkel NTA biosensor uit de originele verpakking door het grote gedeelte van de biosensor met een gehandschoende hand vast te houden.

Plaats de biosensor over de PCR buis zodanig dat alleen de glazen punt van de biosensor wordt ondergedompeld in de BLI buffer. Houd de biosensortip minstens 10 minuten onder water om volledige hydratatie te garanderen. Zet de Blitz machine aan.

Zorg ervoor dat de machine is aangesloten op de computer via een USB-gegevensuitvoerpoort aan de achterkant van de machine. Open op de computer de bijbehorende software en klik op Advanced Kinetics aan de linkerkant van het scherm. Typ in de software alle geschikte informatie over het experiment onder elke respectievelijke rubriek.

Klik op Biosensor Type en kies Nickel NTA in het vervolgkeuzemenu. De duur van elke stap kan worden gewijzigd van standaard als dat nodig is. Voor optimale resultaten gebruik een minimum van 30 seconden voor de initiële basislijn en baseline en 120 seconden voor associatie en dissociatie.

Verwijder de gehydrateerde nikkel NTA biosensor uit de PCR buis en breng deze aan op de biosensor mount op de machine door het brede gedeelte van de biosensor op de houder te schuiven. Plaats een 0,5 milliliter zwarte microcentrifuge buis in de buishouder van de machine en pipet 400 microliter van BLI buffer in. Sluit de afdekking van de machine zodanig dat de biosensorpunt onder water komt te staan in de buffer in de microcentrifugebuis.

Klik op Volgende op de software om te beginnen met het opnemen van de oorspronkelijke basislijn. Nadat de eerste basislijnstap is voltooid, opent u de afdekking van de machine. Verplaats de schuifregelaar naar rechts, zodat de druppelhouder zich voor de zwarte pijl bevindt.

Pipette vier microliters van een gedialyseerde Zijn-tagged ligand op de druppelhouder en sluit de cover van de machine, die automatisch zal beginnen met het opnemen van de laadstap. Nadat de laadstap klaar is met opnemen, opent u de afdekking van de machine. Verplaats de schuifregelaar naar links, zodat de buishouder zich opnieuw voor de zwarte pijl bevindt.

Sluit het deksel van de machine en zorg ervoor dat de biosensorpunt wordt ondergedompeld in de BLI-buffer van de buis in de buishouder. De machine en software beginnen automatisch met het opnemen van de basislijnstap. Nadat de basislijnstap is voltooid, opent u de afdekking van de machine.

Verwijder de druppelhouder en maak het schoon door het eiwit uit te spoelen en te spoelen met dubbel gedeïoniseerd water voor een totaal van vijf keer. Gebruik een weefseldoek om het oppervlak van de druppelhouder na de laatste wasbeurt schoon te maken. Vervang de druppelhouder terug op de machine.

Verplaats de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de druppelhouder zich opnieuw voor de zwarte pijl bevindt. Pipette vier microliters van een gedialyseerde analyt op de druppelhouder en sluit de cover van de machine, die automatisch zal beginnen met het opnemen van de associatiestap. Nadat de associatiestap klaar is met opnemen, opent u de cover van de machine.

Verplaats de schuifregelaar op de machine naar rechts, zodat de buishouder zich opnieuw voor de zwarte pijl bevindt en de afdekking van de machine sluit, die automatisch begint met het opnemen van de dissociatiestap. Nadat de dissociatiestap is voltooid, opent u de afdekking van de machine en verwijdert u de druppelhouder en de buishouder. Spoel beide grondig af met dubbel gedeïsized water om eiwitten weg te wassen.

Verwijder de biosensor en gooi deze veilig weg. Herhaal deze stappen voor dezelfde ligand analyt paar met behulp van verschillende analyt concentraties. Zodra alle runs zijn voltooid, slaat u de gegevens op de software op door op Bestand en Experiment opslaan als aan de linkerkant van het scherm te klikken.

Selecteer onder de kop Gegevens uitvoeren de optie Stapcorrectie en Montage van één op één en klik op Analyseren om kinetische gegevens te genereren. Als u de kwantitatieve gegevens in een werkblad wilt extraheren en grafieken wilt genereren, klikt u op Exporteren naar CSV en slaat u de opgenomen gegevens op als een CSV-bestand. Open het CSV-bestand met behulp van een spreadsheetsoftware.

Full length GrgA is gemaakt van 288 aminozuren. Zoals hier getoond, een 28 aminozuur middengebied bindt Sigma 28 direct. Hier werd het middengebied getagd met een eindterminal His-tag werd gebruikt als de ligand, die voor het eerst werd geïmmobiliseerd tot het puntje van een nikkel NTA biosensor.

Opnames van experimenten met drie verschillende analytconcentraties die elk 30 seconden voor de binding van ligand beginnen en twee minuten na het begin van de laatste wasbeurt eindigen. Verbeterde visualisatie van ligande analytassociatie en dissociatie wordt weergegeven na verwijdering van waarden in de eerste twee fasen en het resetten van de basislijn. Na het wassen van ongebonden en terminal Zijn-tagged GrgA 138 tot 165 uit de biosensor, real-time associatie met de analyt werd opgenomen na de toevoeging van Sigma 28.

Ten slotte werd de real-time dissociatie opgenomen na de wasbeurt. Voordat BLI-tests worden afgenomen, wordt glycerol uit liganden en analyten verwijderd. Wij raden aan om BLI kort na de dialyse uit te voeren, zoals besproken in de tekst.

Na het karakteriseren van eiwit-eiwit interacties in transcriptie met BLI, kan men onderzoeken hoe de interactie transcriptie initiatie, verlenging en of beëindiging beïnvloedt.