Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Dit protocol beschrijft een methode om bloed en mononucleaire cellen te herprogrammeren tot neurale stamcellen die kunnen worden gebruikt voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Parkinson. Het biedt een autologe celbron voor de behandeling van neurodegeneratieve ziekten. Ook is het tijdsbestek dat nodig is voor conversie naar geïnduceerde neurale stamcellen en differentiatie naar gewenste celtypen korter dan voor geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Geïnduceerde neurale stamcellen bezitten een goede proliferative capaciteit en kunnen vóór toepassing worden opgeschaald. Aangezien de iNSCs kunnen worden gespecificeerd in verschillende regio-specifieke neurale cellen, zoals ruggenmergneuronen of motorneuronen, kan deze methode worden uitgebreid voor de behandeling van andere neurologische ziekten. De hele procedure duurt lang, met alle stappen gerelateerd en kritisch, dus visuele demonstratie geeft een idee over hoe de cellen eruit zien en biedt een aantal tips om een succesvolle generatie van de gewenste cellen te garanderen.

Om te beginnen, overdracht eerder geïsoleerd perifeer veneuze bloed in een 50-milliliter conische buis, en verdun het met een gelijk volume van steriele Dulbecco's PBS. In een andere 50-milliliter conische buis, bereiden 15 milliliter van gesteriliseerde dichtheid gradiënt medium. Kantel de buis in een hoek van 45 graden en leg langzaam en voorzichtig 30 milliliter verdund perifeer bloed op het medium dichtheidsgradiënt.

Centrifugeer de buis op 800 keer g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met de centrifugerem op de uitpositie. Aspirate de gele, bovenste plasmalaag, en gooi het. Gebruik een pipet van 10 milliliter om de witte, troebele dunne laag met mononucleaire cellen over te brengen naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter.

Voeg 30 milliliter D-PBS toe aan de buis met MNIC's en vercentrifugeer 600 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Voeg na het weggooien van de supernatant 45 milliliter D-PBS toe en verleg de cellen opnieuw. Na het centrifugeren van de buis op 400 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, gooi de supernatant.

Resuspend de cellen met vijf milliliter D-PBS, tel de levende cellen met de trypan blauwe uitsluiting methode, zet de MNC's die nodig zijn voor uitbreiding, en bevriezen de resterende cellen voor toekomstig gebruik. Op dag min 14, zaad MNCs bij een dichtheid van twee tot drie miljoen cellen per milliliter per put van zes-put plaat met 1,5 milliliter van 37-graden Celsius, voorverwarmd MNC medium. Incubeer bij 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende twee dagen.

Gebruik op dag min 11 een gesteriliseerde pipet om de cellen met het medium te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Centrifuge op 250 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gooi de supernatant, en resuspend de cellen in een milliliter van voorverwarmde MNC medium. Na het tellen van de levensvatbare cellen met trypan blauw, zaad de MNCs op een dichtheid van een miljoen cellen per milliliter in voorverwarmd MNC-medium in een zes-put plaat.

Incubeer bij 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende drie dagen, en herhaal cel verzamelen, centrifugeren, en beplating in MNC medium op dagen min acht en min vier. Sendai virus in deze procedure is gevaarlijk, en alle procedures waarbij Sendai virus moet worden uitgevoerd in een veiligheidskast. En alle tips en buizen blootgesteld aan Sendai virus moet worden behandeld met ethanol of bleekmiddel voor verwijdering.

Verzamel op dag nul de cellen in MNC-medium en breng over op een conische buis van 15 milliliter. Na het centrifugeren van de cellen op 200 keer g gedurende vijf minuten, aspirate de supernatant en resuspend de cellen met een milliliter van voorverwarmde MNC medium. Tel de levensvatbare cellen met trypan blauw, en dan resuspend ze met voorverwarmde MNC medium tot een concentratie van 200,000 cellen per put in 24-well platen.

Ontdooi de buizen verwijderd uit min 80-graden Celsius opslag met Sendai virus in een 37-graden Celsius waterbad voor vijf tot 10 seconden, en laat ze ontdooien op kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, plaats ze onmiddellijk op ijs. Voeg het ontdooide Sendai-virus toe aan de putten van de 24-putplaat met MULTINATIONALS bij een veelheid aan infectie van 10.

Om de bevestiging van cellen te vergemakkelijken, centrifugeer de platen gedurende 30 minuten op 1.000 keer g en plaatst u daarna de platen in de couveuse bij 37 graden Celsius, 5%kooldioxide. Breng de cellen op dag één met het medium over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Om de resterende cellen verder los te maken, spoelt u de putten met één milliliter MNC-medium per put en voegt u de cellen met medium aan de buis toe.

Na het centrifugeren van de celsuspensie op 200 keer g gedurende vijf minuten, de supernatant aanzuigen, de cellen opnieuw opblazen met 500 microliters van vers voorverwarmd MNC-medium, en toevoegen aan een put van een 24-put plaat. Gebruik op dag twee één milliliter per put van eerder verdunde 50 microgram per microliter poly-D-lysine in D-PBS om zes-goedplaten gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur te coaten. Aspirate poly-D-lysine uit de zes-put platen, en droog op de verticale schone bank voor ongeveer 10 minuten.

Voeg vervolgens een milliliter per put van een eerder verdunde vijf microgram per milliliter laminine aan de zes-goed platen, en incubeer voor vier tot zes uur op 37 graden Celsius te coaten. Was de borden voor gebruik met D-PBS. Op dag drie, plaat alle Sendai virus-getransduceerde MNC's in geïnduceerde neurale stamcel medium op de poly-D-lysine / laminine-gecoate zes-put platen.

Op dag vijf en zeven, voeg voorzichtig een milliliter van 37-graden Celsius, voorverwarmd iNSC medium aan elke put van de zes-put platen. Vervang het medium van dag negen tot dag 28 dagelijks door vers voorverwarmd iNSC-medium. Monitor de opkomst van iNSC kolonies, en in ongeveer twee tot drie weken pick kolonies met de juiste morfologie met behulp van verbrande glazen pipetten en breng elke kolonie naar een aparte put van een zes-put plaat voor uitbreiding.

Om eenzijdige 6-hyroxydopamine-laesietische muismodellen vast te stellen, scheert u het hoofd van een verdoofde, volwassen, mannelijke, SCID-beige muis en breng erythromycine oogzalf toe. Plaats de muis op het stereotaxic-apparaat en bevestig de muis met snijbalken. Plaats de oorschelpen correct om de muiskop goed en op de juiste manier te positioneren.

Steriliseren het hoofd met povidone jodium en isopropyl alcohol, en gebruik dan een scalpel blad om een ongeveer 1,5 centimeter sagittale incisie op de hoofdhuid te maken, het blootstellen van de schedel. Pas de snijbalk en oorbalken aan om het hoogteverschil tussen bregma en lambda te verlagen tot minder dan 0,1 millimeter. Langzaam bewegen en verlagen van de punt van de microsyrerenaald naar bregma, en behandel bregma als het nulpunt.

Verplaats de tip naar een positie met coördinaten van voorste 0,5 millimeter en laterale 2,1 millimeter ten opzichte van bregma. Trek de tip in, markeer het punt met een stift en braam met een elektronische boor een klein gaatje in de schedel. Haal twee microliter van vijf microgram per milliliter 6-hyroxydopamine-oplossing in de microsyringe.

Breng de naald terug naar het gemarkeerde punt en steek de naald in rug/ventrale 3,2 millimeter. Injecteer de 6-hyroxydopamine-oplossing uit de spuit met een snelheid van één microliter per minuut, laat de injectienaald nog vijf minuten op zijn plaats en trek deze vervolgens langzaam in. Na het sluiten van de incisie met hechtingen, breng erythromycine oogzalf opnieuw op de ogen.

Verwijder de muis uit het stereotaxic-apparaat, zet deze in de herstelkooi en geef toegang tot voedsel en water totdat hij weer bij bewustzijn komt. Nadat PBMNCs besmet waren met SeV, veranderde hun morfologie en ondergingen cellen een drastische dood tot dag vijf. INSC kolonies ontstond op dag 12.

Na het plukken en overbrengen van iNSC klonen voor uitbreiding voor een aantal passages, toonden ze een goede morfologie en konden ze zichzelf stabiel vernieuwen in iNSC-medium, hetzij in een monolaagvorm of als sferen. Na 24 dagen van differentiatie, iNSCs werden geïdentificeerd als dopaminerge neuronen als een meerderheid van hen uitgedrukt tyrosine hydroxylase, vorkhoofd doos A2, en neuron-specifieke klasse III beta-tubuline markers. Na de oprichting van unilaterale 6-hyroxydopamine-laesietische parkinson muis modellen, gedragsbeoordeling werd uitgevoerd om de ziekte van Parkinson symptomen te schatten.

De muizen die celtransplantatie hadden ondergaan, vertoonden een significante verbetering van de motorische functie. De omvang van 6-hyroxydopamine-geïnduceerde laesie werd geverifieerd door postmortem immunofluorescente kleuring voor TH in het striatum, mediale forebrain bundel, en substantia nigra pars compacta. De TH-positieve signalen werden sterk teruggevonden in het striatum waar cellen werden geïmplanteerd en ook licht hersteld bij SN. Drie maanden na transplantatie, onder overlevende cellen, ongeveer 13.84%waren TH-positieve dopaminerge neuronen.

Ongeveer 91,72% van de TH-positieve cellen uitgedrukt weeskern receptor, ongeveer 86,76%uitgedrukt FOXA2, en ongeveer 98,77%werden mede-gelabeld met G-eiwit gekoppelde inkomende rectifier kalium. Bij het leggen van 30 mils verdund perifeer bloed op het dichtheidsgradiëntmedium, doe het dan langzaam en voorzichtig, niet om de gradiëntinterface te verstoren. Zorg moet worden genomen om te voorkomen dat herhaalde ontdooien en bevriezing van Sendai virus om een hoge virusactiviteit te garanderen.

Bij het herprogrammeren van perifere bloed mononucleaire cellen aan geïnduceerde neurale stamcellen, gelieve nauwlettend observeren de morfologie van cellen elke dag. Ook is 6-hydroxydopamine licht- en temperatuurgevoelig. Wees voorzichtig om de oplossing te beschermen tegen licht, en houd het op ijs voor gebruik.

Na deze procedure kan men doorgaan met het bestuderen van de ziektemechanismen met behulp van familiale PD patiënt-afgeleide dopaminerge neuronen in de cultuur. Men kan ook blijven onderzoeken hoe de getransplanteerde cellen de beschadigde neuronale circuits beïnvloeden.