Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof
20 juni 2019
We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.
De optische opname methode met spanning gevoelige kleurstof wordt beschouwd als een ideale technologie om te visualiseren hoe de hersenen werken. Deze methode stelde ons in staat om een neuropsychische dynamiek stabiel en betrouwbaar op te nemen gedurende 12 uur, gaf ons een visie op psychische activiteit. We proberen de toepassing uit te breiden om circuitveranderingen veroorzaakt door chemische stoffen in het hele ontwikkelingsstadium te detecteren, zoals waardevolle zuurtoepassing voor moeders.
De techniek is al goed ingeburgerd. Probeer studies te reproduceren door het volgen van de methode hier gepresenteerd. Om deze procedure te beginnen, dompel de onthoofde kop onder in ijskoude ACSF in een roestvrijstalen chirurgische lade.
Haal de hersenen binnen een minuut en plaats het in een beker met gekoelde ACSF gedurende vijf minuten. Vervolgens verdeel de hersensectie op de middellijn met een scalpel en plaats beide hemisferen op een blok van 4%agar. Plaats vervolgens het hersenblok met beide hersenhelften op een blok van 4%agar.
Veeg de overtollige ACSF uit het blok met een filterpapier. Breng vervolgens superlijm aan op het vibratome-platform. Plaats het agarblok erop en veeg de overmatige lijm af met een filterpapier.
Breng voorzichtig een kleine hoeveelheid ijskoude ACSF van de bovenkant van de hersenen agar blok te helpen stollen overtollige superlijm en om te voorkomen dat de lijm van het bedekken van de hersenen en het verstoren van de snijden. Bevestig daarna het platform aan de vibratomelade en giet de aangepaste ACSF. Stel het vibratome in op een lage snelheid en laat de bladfrequentie op de maximale stand staan.
Begin dan met snijden. Plaats de segmenten in de hoek van de snijkamer in volgorde, zodat de volgorde van de plakjes gemakkelijk kan worden onderscheiden. Gewoonlijk kunnen drie tot vijf plakken van één hemisfeer worden verkregen.
Vervolgens afgesneden van de hersenstam gedeelte met behulp van een 30-meter naald. Met behulp van een kleine tip penseel, plaats het segment op het membraan filter gehouden met een plexiglas ring. Plaats de ring in een vochtige herstelkamer en zet de afdekking vast om de binnendruk hoog te houden.
Bij het plaatsen van het segment op het membraanfilter, pas de richting en positie van het segment binnen de ring om ervoor te zorgen dat het goed gecentreerd is en een consistente richting heeft. Laat het monster 30 minuten op 28 graden Celsius staan en vervolgens minstens 10 tot 30 minuten op kamertemperatuur voor herstel. Om de plakjes te bevlekken, breng voorzichtig 100 microliters van de kleuroplossing aan op elk plakje en broed op 20 minuten voor kamertemperatuur.
Bereid vervolgens 50 tot 100 milliliter ACSF in een container. Plaats de ring met het monster erin om de kleuroplossing te spoelen. Breng vervolgens de gespoelde plakjes over naar een andere incubatiekamer.
Wacht meer dan een uur voor herstel voor het experiment. Schakel om deze procedure te starten het versterker-, computer- en camerasysteem in en open de software. Giet ACSF in een 50 milliliter buis en bel het met carbogen.
Gebruik een peristaltische pomp om de ACSF te laten circuleren en pas de stroomsnelheid aan op ongeveer een milliliter per minuut. Stel vervolgens de hoogte van de zuigpijp aan, zodat het vloeistofniveau in de experimentkamer altijd constant is. Plaats de grondelektrode in de kamer.
Vul vervolgens de glaselektrode met een kleine hoeveelheid ACSF en plaats deze in de elektrodehouder. Bevestig de houder aan de staaf van de manipulator. Met behulp van een versterker, zorg ervoor dat de elektrode weerstand is ongeveer een megaohm.
Breng in de opnamesessie een stuk van de vochtige kamer over naar een experimentele kamer. Druk de rand van de ring stevig in de siliconen o-ring. Zorg ervoor dat u het membraan of de onderkant van de experimentkamer niet breekt.
Plaats onder de microscoop de punt van de stimulerende elektrode en het veldpotentieel opnameelektrode op de slice. Controleer de opgeroepen reactie door het leveren van een stimulus. Controleer of het gezichtsveld het juiste neurale circuit in het optische opnamesysteem bedekt.
Pas vervolgens de excitatielichtintensiteit aan op ongeveer 70 tot 80% van de maximale capaciteit van de camera. Pas met de fluorescerende lichtbron de focus aan met het acquisitiesysteem. Start vervolgens de opname en analyseer de gegevens in een software voor het verkrijgen van afbeeldingen na de overname.
Dit cijfer toont het representatieve optische signaal op elektrostimulatie van Schaffer collaterol in gebied CA1 van een plakje van de muis hippocampal. Deze opeenvolgende beelden tonen het optische signaal voordat een ruimtelijke en temporele filters werden toegepast, terwijl deze beelden tonen dezelfde gegevens na het toepassen van een vijf bij vijf bij vijf kubieke filter twee keer. Vanwege de hoge framesnelheid en hoge ruimtelijke resolutie heeft de toepassing van het filter het signaal niet veranderd, maar het geluid eruit gefilterd dat ook kan worden waargenomen in de tijdskoers die in pixels in één proef is opgenomen.
Hier is de vergelijking van de typische reacties in gebied CA1 van de hippocampal plakjes tussen muis en rat. De kleine hyperpolariserende respons wordt waargenomen in de distale kant van de CA1 na 24 milliseconden in de muis hippocampal slice, maar meer massieve hyperpolariserende reactie overviel de depolariserende reactie in de rat hippocampal slice. Zodra de plakjes zijn gekleurd, moeten ze duren voor meer dan 12 uur en u andere elektrofysiologische opnames op hen uit te voeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een stabiele optische registratiemethode met gebruik van spanningsgevoelige kleurstoffen voor hersensecties, met de nadruk op signalering van hippocampale neuronen. De techniek biedt een betrouwbaar inzicht in neuropsychische dynamiek over langere perioden, wat onderzoek naar circuitwijzigingen als gevolg van chemische applicaties vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Optische beeldvorming
Achtergrond
- Spanningsgevoelige kleurstof is essentieel voor het visualiseren van hersenactiviteit.
- Conventionele preparaten van hippocampus-slices dienen als biologisch model.
- De studie onderzoekt neuropsychische dynamiek en circuitwijzigingen.
- Eerdere methoden waren onvoldoende betrouwbaar over langere opnametijden.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbare methode te introduceren voor optische registratie in hersensnijden.
- Om inzicht te bieden in de effecten van chemicaliën op de dynamiek van hersencircuits.
- Om langdurige observatie van neuronale activiteit en responsen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Het gebruikte platform bestaat uit ex vivo hersencoupes voorbereid uit de hippocampus van muizen.
- Het belangrijkste model omvat hippocampale coupes, wat studies naar elektrische activiteit faciliteert.
- Er worden geen multi-omics workflows vermeld; de focus ligt op optische en elektrofysiologische technieken.
- De preparatie omvat nauwkeurige stappen zoals het koelen, kleuren en incuberen van de coupes.
- Registratiesessies worden uitgevoerd in een experimentele kamer met precieze setup-vereisten.
Belangrijkste resultaten
- De optische methode maakt betrouwbare gegevensverzameling over een periode van 12 uur mogelijk.
- Vergelijking van de responsen tussen hippocampussneden van muizen en ratten laat duidelijke neurofysiologische profielen zien.
- Elektrofysiologische veranderingen, zoals hyperpolariserende responsen, worden ondersteund door optische opnames.
- De techniek vergroot ons begrip van de dynamiek van neuronale circuits onder verschillende condities.
Conclusies
- Deze methode biedt een significante vooruitgang voor het bestuderen van hersencircuits en neuropsychische fenomenen.
- Het stelt onderzoekers in staat om veranderingen in neuronale signalering in real-time te observeren.
- Het begrijpen van deze mechanismen kan inzicht verschaffen in plasticiteit en potentiële therapeutische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Wide-field single-photon voltagegevoelige kleurstof-imaging maakt een stabiele, langdurige functionele beoordeling van neurale circuits in hersensecties mogelijk, wat een cruciale uitdaging bij de validatie van targets in de neurowetenschappen aanpakt. De methode ondersteunt mechanische risicoreductie door kwantitatieve, hoge-resolutie optische read-outs van neuronale activiteit over uitgebreide perioden te bieden, wat essentieel is voor het evalueren van effecten van verbindingen op circuitdynamiek in de preklinische ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door real-time neuronale signaleringsdynamiek in hippocampuscircuits te visualiseren.
- Operationele waarde: Maakt stabiele, reproduceerbare opnames gedurende meer dan 12 uur mogelijk, wat longitudinale beoordeling van target engagement en padmodulatie ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de detectie van circuitwijzigingen geïnduceerd door chemische applicaties, wat helpt bij de vroege identificatie van effecten van neuroactieve verbindingen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereikt een framerate van 10 kHz en een resolutie van 100x100 pixels, wat high-throughput temporele en ruimtelijke analyse van neurale responsen mogelijk maakt.
- Signaalkwaliteit: Filtering na de opname verbetert de signaal-ruisverhouding, waardoor betrouwbare detectie van subthreshold circuitveranderingen mogelijk is, die cruciaal zijn voor de sensitiviteit van de assay.
- Reproduceerbaarheid: Stabiele protocollen voor het hanteren en kleuren van coupes minimaliseren mechanische artefacten, wat consistente gegevens over replica's en experimentele sessies waarborgt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Ondersteunt de evaluatie van circuitwijzigingen in hippocampale netwerken, een regio die betrokken is bij cognitieve en neuropsychiatrische stoornissen.
- Translationele continuïteit: Maakt parallelle optische en elektrofysiologische opnames mogelijk, wat de validatie van functionele uitkomsten over verschillende meetmodaliteiten versterkt.
- Risico-geoptimaliseerde vooruitgang: Verschillende responsprofielen tussen muis- en ratplakjes informeren de translatie tussen soorten en helpen bij het verminderen van risico's bij de selectie van preklinische kandidaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door functionele circuit-readouts te bieden die de brug slaan tussen targetvalidatie en lead-identificatie, in het bijzonder voor neuroactieve verbindingen waarvoor een fenotypische beoordeling op circuitniveau vereist is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van neuropsychische dynamiek en pathway-verduidelijking via directe visualisatie van opgewekte optische signalen in gedefinieerde neurale circuits.
- Screening: Levert kwantitatieve, hoge-resolutie optische outputs die geschikt zijn voor geautomatiseerde analyse en vergelijking van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in de neurale activiteit.
- Analytics: Maakt het gebruik van spatiotemporele filters mogelijk om signalen uit ruis te extraheren, wat een objectieve kwantificering van circuitresponsen en een beoordeling van de variabiliteit faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Verbindt observaties van circuits in de ontdekkingsfase met preklinische validatie door herhaalde opnames over langere perioden mogelijk te maken om de stabiliteit en reproduceerbaarheid van effecten van verbindingen te beoordelen.
- Enterprise Reuse: Gestandaardiseerde coupes-preparatie en imaging-platformen ondersteunen hergebruik in meerdere projecten en verbindingenseries, waardoor methodologische variabiliteit in neuroscience screening-cascades wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de functie van neuronale circuits, waardoor ambiguïteit bij de validatie van targets wordt verminderd en het voorspellend vertrouwen in neurofarmacologische screening wordt ondersteund.
- Operationele waarde: Handhaaft fysiologische condities en voorkomt beweging van de coupes, wat zorgt voor een stabiele, artefactvrije data-acquisitie voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van off-target- of ongewenste circuiteffecten mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van functionele circuitprofielen, wat de kapitaalefficiëntie in preklinische pipelines verhoogt.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, optische beeldvorming en weefselverwerking om de juiste levensvatbaarheid van de coupes en de efficiëntie van de kleuring te waarborgen.
- Afhankelijk van high-speed camerasystemen, fluorescentielichtbronnen en perfusiesystemen die in staat zijn fysiologische condities te handhaven tijdens langdurige registraties.
- Necessiteert standaardisatie van de oriëntatie van de coupes, de kleuringsduur en de herstelprotocollen tussen teams om variabiliteit in de optische signaalbasislijn en responsiviteit te minimaliseren.
- Aanpassing aan andere hersenregio's of ziektemodellen kan validatie van de kleuringsefficiëntie en de circuitspecifieke signaalexpressie vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige optimalisatie van de intensiteit van het excitatielicht om fototoxiciteit te voorkomen, terwijl een voldoende signaalamplitude voor detectie behouden blijft.
