Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

Onder verschillende bestaande protocollen voor weefselvoorbereiding voor transmissie elektronenmicroscopie, selecteerden we methoden die optimale structurele bewaring en hoge resolutie micrografen opleveren om morfometrische analyse van synaptische vesiklesdistributie bij presynaptische terminals uit te voeren. De afbeeldingen met een hoog contrast verkregen met deze methoden maken het mogelijk om parameters te kwantificeren, zoals de afstand van synaptische blaasjes van het presynaptische membraan aantal blaasjes die aan de presynaptische membraan en interserige afstanden zijn gedokt. Al deze parameters zijn indicatief voor synaptische functie.

Aangezien veranderingen in de ruimtelijke organisatie van synaptische akels kunnen worden geassocieerd met de verstoring van de synaptische functie, zijn deze methoden gebruikt om de effecten van algemene verdoving op synaptische ontwikkeling te onderzoeken. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om de effecten van een geneesmiddel of behandeling op de gedetailleerde morfologie van synapsen te onderzoeken om inzicht te geven in hun functie. Begin met het voorbereiden van osmiumtetroxide voor postfixatie van rattenhersensecties die eerder zijn vastgesteld met paraformaldehyde en glutaraldehyde via vasculaire perfusie.

Secties worden stijf na behandeling met osmium tetroxide. Daarom weefsel behandeling vereist aandacht vanaf dat. Ook, voordat het toevoegen van osmium, zorg ervoor dat uw secties worden afgevlakt als een vouw zal waarschijnlijk resulteren in weefselfractuur.

Open een vijf milliliter glazen ampule van 4% osmium tetroxide en water en laat het in een bruine glazen fles vallen. Voeg vijf milliliter fosfaatbuffer van 0,2 molar toe en voeg vervolgens 10 milliliter fosfaatbuffer van 0,1 moler toe om een uiteindelijke oplossing van 1% te bereiken. Gebruik een spuit van 20 milliliter die is uitgerust met een lange naald om de 1%osmiumtetroxide op te stellen en voeg vervolgens de osmiumtetroxide toe aan een bruine glazen pot bedekt met aluminiumfolie.

Voeg na het feit dat het monster is uitgeklapt en afgevlakt 1%osmiumterroxide en 0,1 molaire PB toe aan het flacon. Incubeer het monster in osmiumtetroxide gedurende een uur bij kamertemperatuur. Haal de osmiumtetroxide uit met een micropipet nadat incubatie is voltooid en spoel de secties zoals beschreven in het protocol.

Om uranylacetaat te bereiden, plaatst u een maatkolf van 200 milliliter met 100 milliliter ethanol op een roerplaat. Voeg vier gram uranylacetaat toe aan de kolf, wikkel een aluminiumfolie om neerslag door licht te voorkomen en roer continu. Dehydrateer de secties in 50% ethanol.

Vlek met de bereide de 4%uranyl acetaat voor een uur en volg met seriële uitdroging en spoelen zoals beschreven in het manuscript. Verwijder de spuitzuiger uit een 60 milliliter gavage spuit en sluit deze af met een veiligheidsnaald. Plaats de spuit met de open zijkant omhoog en voeg elk ingrediënt van de harsmix één voor één toe.

Werk af door 525 microliters van DMP30 toe te voegen met een pipet. Het verplaatsen van de zuiger van de pipet heel langzaam als DMP is zeer stroperig. Doe de zuiger terug in de spuit.

Keer de spuit een paar keer om de inhoud te mengen. De kleur verandert van geel naar oranje. Evacueer de lucht in de spuit.

Plaats het dan op een tuimelschakelaar met continu schudden voor ten minste 30 minuten. Voeg een volume epoxy hars en een volume aceton aan een scintillatie flacon en schud om te mengen. Breng deze op een hars op aceton mengsel op het weefsel sectie na de laatste aceton spoeling houden in bedekt om aceton verdamping te voorkomen.

Verwijder de een tot een mengsel van hars en aceton na twee tot vier uur en vervang het met volledige hars en incubeer gedurende vier uur. Doe al het harsafval in een inzamelcontainer onder de motorkap om te polymeriseren en later te verwijderen. Snijd twee rechthoekige stukken van heldere polychlooriefluorethyleen film en veeg ze met 70% ethanol.

Trim ze zo dat er ten minste 1,5 centimeter van weefsel-vrij plastic aan elke kant van de sectie, ervoor te zorgen dat ze dezelfde breedte, maar de hoogte van het blad op de top is ongeveer 2/ 3 van de onderste plaat. Langzaam kantelen van de flacon en gebruik een fijne kameel penseel en een flexibele micro-spatel om zeer voorzichtig til het exemplaar van de bodem. Verplaats vervolgens voorzichtig het gedeelte langs de flaconwanden en breng over op het onderste PCTFE-blad.

Verwijder overtollige hars met een microspatel en bedek het monster voorzichtig met het bovenste vel. Duw voorzichtig alle gevangen luchtbellen zonder directe druk op de weefselsectie uit te voeren en veeg de overtollige hars weg. Gebruik een oplosmiddelbestendige pen om de vellen te etiketteren en plaats in een oven op 60 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen te polymeriseren.

Trek voorzichtig de ingeklemde PCTFE vellen uit elkaar om ze te openen. Gebruik een oplosmiddelbestendige pen om de zijkant van het vel te markeren die de aanhangende sectie bevat die deze in de buurt van het weefsel markeert. Gebruik een schijf punch om een cirkel monster van de sectie te verkrijgen om ervoor te zorgen dat de pen merk is onderdeel van de geponste weefsel.

Het penteken zal glinsten wanneer er licht op het monster schijnt. Plaats de dop van een inbedding capsule kant op een capsule houder. Plaats een druppel hars op de dop en steek de geponste schijf in de dop met het weefsel gedeelte naar boven gericht.

Steek een capsule in de dop met behulp van een zachte kurkentrekker beweging. Gebruik fijne pincet om een twee centimeter lang stuk papier label in de capsule te rollen en te laten zakken, zodat het past bij de kromming van de zijwanden van de capsule. Giet de inbedding hars in de capsule, vul tot rand van de capsule en gebruik een puntige houten stok om het weefsel monster naar beneden te duwen.

Plaats de capsule in de oven op 60 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen voor polymerisatie. En ga dan verder met secties en kleuring zoals beschreven in het protocol. Elektronenmicrograaf van bevredigende bewaring van de neuronale celstructuur toont gelaagde celmembranen zonder onderbrekingen.

Het cytoplasma is uiteindelijk korrelig en zonder lege ruimtes. Mitochondriën zijn noch gezwollen of gekrompen met een geconserveerd buitenste dubbele membraan en intacte interne cristae. Optimale bewaring van neuronale ultrastructuur en fijne morfologische details is essentieel om synaptische vesikels te visualiseren en hun afstand tot het presynaptische membraan te meten.

Synaptische adereilanden moeten worden onderscheiden en bekleed door een ononderbroken enkel membraan. Om de morfometrische analyse van de synaptische vesicleverdeling te vergemakkelijken, moeten presynaptische en postsynaptische membranen parallel zijn in hun continuïteit die behouden blijft. Elektronenmicrograaf van gebrekkige bewaring van weefselstructuur toont de vervorming en breuk van neuronale celmembranen en de aanwezigheid van aanzienlijk vergrote extracellulaire ruimten.

Mitochondriën lijken opgezwollen en hebben gezwollen cristae. In een ander voorbeeld van gebrekkige weefselstructuur behoud, waren er grote witte lege ruimtes binnen het cytoplasma in plaats van fijn korrelige cytoplasmatische stof met vergrote extracellulaire ruimten. Een kunstmatig membraan zoals forall waarschijnlijk het gevolg van mobilisatie van lipiden tijdens fixatie met glutaraldehyde.

Bij het werken jong hersenweefsel gebruik 1 molaire fosfaatbuffer als oplosmiddel voor al uw oplossing, zodat u toniciteit zo dicht mogelijk bij die van pasgeboren rat hersenen te houden en artefactuele weefsel krimp en of zwelling te minimaliseren. De micrografen verkregen met deze methoden kunnen worden gebruikt om de gedetailleerde morfologie en dimensionale structurele relaties van een aantal cellulaire componenten andere dan synaptische vesikels te bestuderen. Bijvoorbeeld mitochondriën, golgi-apparaten en nucleaire chromatine.

Verschillende stappen in dit protocol vereisen chemische stoffen die giftig kunnen zijn. Werk altijd onder een rookkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van aldehyden, osmium, uranium en loodverbindingen.