Kwantificerende Subcellulaire Ubiquitin-proteasome activiteit in het knaagdier hersenen

Dit protocol meet subcellulaire eiwitubiquilining niveaus en proteasoom activiteit in het knaagdier hersenen waardoor binnen onderwerpen vergelijkingen van hoe ubiquitine-proteasoom activiteit verandert in reactie op cellulaire activiteit, leren, of ziekte. Het protocol maakt het verzamelen van synaptische, cytoplasmatische en nucleaire fracties van hetzelfde knaagdierbrein mogelijk. Het minimaliseren van verlies, het kan worden uitgevoerd met kleine weefselhoeveelheden en basislaboratoriumapparatuur.

Het aantonen van de procedure zal Taylor McFadden zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Begin deze procedure met het verzamelen en ontwijken van knaagdieren hersenweefsel zoals beschreven in het tekstprotocol. Zorg ervoor dat het halfrond dat wordt gebruikt, tegenwicht is voor de extractieomstandigheden voor elke experimentele groep.

Verwijder de 1,5 milliliter centrifuge microbuis met een halfrond van het gebied van belang uit de min 80 graden Celsius vriezer. Met behulp van een scalpel, breng het bevroren hersenweefsel naar een twee milliliter glas Teflon homogenisator. Voeg 500 microliter lysebuffer toe aan de Teflon buis.

Met behulp van stamper B, homogeniseren hetzelfde weefsel met 15 slagen totdat er geen zichtbare hoeveelheid vast materiaal aanwezig is. Gebruik een draaiende beweging tijdens elke slag. Breng met een pipet van 1.000 microliter het gehomogeniseerde monster over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Leg de buis op nat ijs en broed gedurende 30 minuten. Plaats de buis in de microcentrifuge en draai gedurende 10 minuten op 845 keer g in vier graden Celsius. Verwijder na voltooiing voorzichtig de supernatant door pipetting en plaats in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Dit is de cytoplasmische fractie. Voeg 50 microliter extractiebuffer toe aan de resulterende pellet en opnieuw te besteden door pipetting. Niet vortex de pellet.

Plaats de buis met de geresuspendeerde pellet op ijs en uitbroed gedurende 30 minuten. Dan centrifugeren de buis gedurende 20 minuten op 21, 456 keer g in vier graden Celsius. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant door pipetting en plaats in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Dit is de nucleaire fractie. Homogenize een halfrond van de regio van belang als voorheen, behalve om 500 microliters van TEVP buffer in plaats van lysis buffer te gebruiken. Breng met behulp van een pipet van 1.000 microliter het gehomogeniseerde monster over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Centrifugeren het monster op 1.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng het naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van een 1.000 microliter pipet. Centrifugeren het monster op 10,000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de originele pellet die kernen en het grote puin bevat. Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Dit is de cytosolische fractie.

Voeg 50 microliter homogenisatiebuffer toe aan de pellet en verzwaarde door pipetting totdat er geen vast materiaal zichtbaar is. Centrifugeren het monster op 20.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over op een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Dit is de ruwe synaptosomale membraanfractie. Om de test op te zetten, verwarmt u de plaatlezer tot 37 graden Celsius en houdt u de run vast. Stel de excitatie in op 360 nanometer en emissie op 460 nanometer.

Als de 96 goed gebruikte plaat duidelijk is, stel de optiekpositie op de bodem. Als een donkere 96 put plaat wordt gebruikt, stel optica positie naar boven. Programmeer een kinetische run met een tijd van twee uur scannen om de 30 minuten.

Reconstrueren van de 20S 10X test buffer die in de kit met 13,5 milliliter ultrazuiver water. Voeg 14 microliter van 100 millimolar ATP toe aan de nu 1X buffer. Dit verbetert de proteasoomactiviteit in de monsters aanzienlijk en verbetert de betrouwbaarheid van de test.

Reconstrueren van de AMC standaard in de kit met 100 microliter van DMSO. Voer stappen uit met behulp van de AMC-standaard in het donker of bij weinig licht, omdat de standaard lichtgevoelig is. Maak een standaardcurve van AMC van een reeks hoge tot lage AMC-concentraties.

Deze curve zal worden gebruikt voor de kalibratie van de plaatlezer en de analyse van proteasoomactiviteit in de gehomogeniseerde monsters. Reconstrueren van de proteasoom subtraat in de kit met 65 microliter van DMSO. Voer deze stap ook uit in het donker of bij weinig licht, omdat het substraat lichtgevoelig is.

Maak vervolgens een een tot 20 verdunning van het proteasoom substraat in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van 20S test buffer. Voeg een genormaliseerde hoeveelheid van de gewenste monsters toe aan een 96 putplaat. Voer elk monster in tweevoud uit.

De benodigde hoeveelheid monster varieert op basis van weefselvoorbereiding. Over het algemeen is 10 tot 20 microgram voldoende voor elke subcellulaire fractie. Breng het monster goed volume tot 80 microliter met ultrazuiver water.

De toegevoegde hoeveelheid is afhankelijk van de hoeveelheid monster die is toegevoegd. In twee afzonderlijke putten, voeg 80 microliter water alleen. Dit zullen de test blanks zijn.

Voeg 10 microliter van 20S test buffer aan elke put met inbegrip van test blanks. Gebruik een repeater of geautomatiseerde pipet om een consistent testvolume in de putten te garanderen. Doe de lichten uit of ga een donkere kamer binnen.

Voeg alle 100 microliters van verdunde AMC-normen toe aan een nieuwe put met behulp van een enkele put voor elke standaard. Gebruik in het donker een repeater of geautomatiseerde pipet om 10 microliter verdund proteasoomsubstraat toe te voegen aan putten die monster- en test blanks bevatten, maar niet de AMC-standaard. Plaats de plaat in de plaatlezer en start de kinetische run.

Uitvoeren kwantificering van diverse polyubiquitine tags in verschillende subcellulaire fracties verzameld uit knaagdier hersenweefsel met behulp van een verscheidenheid van standaard westerse blotting protocollen in combinatie met unieke koppeling-specifieke polyubiquitine antilichamen. Sommige ubiquitine Westelijke blotbeelden zullen kolommen van verschillende banden verstrekken terwijl anderen uitstrijkje-als patroon met weinig of geen duidelijke lijnen produceert. Voor kwantificering van afgebeelde ubiquitine westerse vlekken, teken een doos rond de kolom die de gehele moleculaire normen ladder uitbreidt.

Pas de doos aan als ubiquitine kleuring zich door de hele ladder uitstrekt. Dit is gebruikelijk voor lysine 48 wijzigingen en varieert sterk tussen subcellulaire compartimenten. Ten slotte trek je de achtergrond af die wordt berekend als de gemiddelde optische dichtheid van de achtergrond die direct rond de kolom aan alle kanten is.

Hier is de kwantificering van proteasoomactiviteit in verschillende fracties verzameld uit de laterale amygdala van hetzelfde dier. Tijdens de in vitro proteasome activiteit test, relatieve fluorescerende eenheden gedetecteerd toegenomen van het begin tot het einde van de test in de synaptische fractie, de cytoplasmatische fractie, en de nucleaire fractie. De proteasome remmer beta-lac verhinderd RFUs van het veranderen over de sessie.

Subcellulaire verschillen werden waargenomen bij proteasoomactiviteit in de laterale amygdala van hetzelfde dier. Bij getrainde dieren werd een toename van de nucleaire proteasoomactiviteit vastgesteld ten opzichte van controles die overeenkwamen met een afname van de activiteit binnen de synaptische fractie. Cytoplasmische proteasoomactiviteit bleef bij de uitgangswaarde.

Hier worden subcellulaire verschillen in koppelingsspecifieke eiwitubiquilinting in de laterale amygdala van hetzelfde dier na het leren weergegeven. Er was een toename van de algehele alomtegenwoordigheid in de nucleaire fractie na het leren die correleerde met een afname van de cytoplasmatische fractie. Na het leren nam de lineaire alomtegenwoordigheid toe in de kernfractie, maar niet in cytoplastische of synaptische breuken.

Interessant is dat K63-alomtegenwoordigheid steeg in de nucleaire fractie na het leren, wat correleerde met een afname van de synaptische fractie. Overwegende dat K48 uniquitination steeg in de nucleaire en cytoplasmatische fracties na het leren, maar niet in de synaptische fractie. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de subcellulaire distributie en functie van andere eiwitten binnen hetzelfde dier te begrijpen.