Name: Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer hoe je fysiologische 3D-spheroïden genereert uit patiëntcellen voor high-throughput screening van anti-neoplastische geneesmiddelen. Deze methode ondersteunt precisiegeneeskunde door patiëntspecifieke therapieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt voornamelijk ondersteund door de DOD OCRP Early loopbaan onderzoeker Award W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD onderzoeker geïnitieerd Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center voor ovariële kanker en Michigan ovariële kanker Alliantie. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder het awardnummer P30CA046592. CMN wordt ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship onder Grant No. 1256260. MEB wordt ondersteund door het departement onderwijs Graduate Assistance in gebieden van National Need (GAANN) Fellowship.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22All+cancers+Source%3A+Globocan%22">All cancers Source: Globocan</a>. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).</li>
<li>Prasad, V., Mailankody, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+and+Development+Spending+to+Bring+a+Single+Cancer+Drug+to+Market+and+Revenues+After+Approval%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval.</a> JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+Medicine+Based+Approach+to+Model+Patterns+of+Chemoresistance+and+Tumor+Recurrence+Using+Ovarian+Cancer+Stem+Cell+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids.</a> Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).</li>
<li>Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer Stem Cells.</a> New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Characterization+of+an+In+Vitro+Model+of+Ovarian+Cancer+Stem-like+Cells+with+an+Enhanced+Proliferative+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity.</a> Cancer Research. 76, 150-160 (2016).</li>
<li>Páez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Dormancy%3A+A+Model+of+Early+Dissemination+and+Late+Cancer+Recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence.</a> Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).</li>
<li>Ahmed, N., Stenvers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+Know+Ovarian+Cancer+Ascites%3A+Opportunities+for+Targeted+Therapy-Based+Translational+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Microenvironment+in+Human+Tumor+Xenografted+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models.</a> Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).</li>
<li>Huang, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+cell+culture+system+for+high-throughput+perfusion+three-dimensional+cell+culture-based+assays%3A+Effect+of+cell+culture+model+on+the+results+of+chemosensitivity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays.</a> Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biotechnology+for+Wellness+Industries%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).</li>
<li>Murphy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+alternative+in+vivo+drug+screening+methodology%3A+a+single+mouse+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis.</a> Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+Xenograft+models%3A+An+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+drug+delivery+systems+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening.</a> Genes. 9, (2018).</li>
<li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Practical+Guide+to+Hydrogels+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture.</a> Nature Methods. 14, 69-81 (2016).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> Journal of Control Release. , (2012).</li>
<li>Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMehta%2C+P+%22Cancer+Stem+Cells%3A+Methods+and+Protocols%22">Cancer Stem Cells: Methods and Protocols</a>. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stable+small+cell+number+three-dimensional+ovarian+cancer+spheroids+using+hanging+drop+arrays+for+preclinical+drug+sensitivity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays.</a> Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Tumor+Evolution+via+Genomic+Profiling+of+Individual+Tumor+Spheroids+in+a+Malignant+Ascites%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites.</a> Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).</li>
<li>Pulaski, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+alemtuzumab+as+an+anti-myeloid+cell+antiangiogenic+therapy+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 7, 49(2009).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).</li>
<li>Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+arrays+for+high-throughput+single-cell+analysis+of+spatial+patterns+and+biomarker+expression+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D.</a> Scientific Reports. 7, 41160(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het 384-well Hanging drop Plate-platform voor 3D-spheroid-formatie is een eenvoudig te implementeren tool voor elke celbiologie of Kankerbiologie Labs. Dit fysiologisch platform maakt de studie van cellijnen, evenals, primaire patiënt monsters binnen fysiologisch relevante 3D-culturen mogelijk, terwijl het een hoge doorvoer van drugs screening toestaat. Het platform zorgt er ook voor dat de cultuuromstandigheden sterk instelbaar zijn, waardoor een strakke controle over de dichtheden, celcocultuurverhoudingen, extracellul...

Wereldwijde kankergerelateerde sterfte bereikte een tol van 9.800.000 sterfgevallen in 20181, met de nadruk op de noodzaak voor de ontwikkeling van verbeterde Therapeutics. Helaas, de kosten van het ontwikkelen van kanker drugs neemt toe, met de ontwikkeling van een enkele drug kost ongeveer 650.000.000 USD2 wijst op de noodzaak van verbeterde strategieën voor de ontwikkeling van nieuwe anti-kanker drugs. Kanker stamcellen (CSCs), die worden gekenmerkt door verhoogde chemoresistance3, de capaciteit om zichzelf te verlengen, en het vermogen om nieuwe tumoren zaad4 worden verondersteld te zijn verantwoordelijk voor tumor recidief4, metastase5, en chemoresistance4,6, die allemaal bijdragen aan de kwaadaardige capaciteit van de tumor en dus de hoge dood tol. Bij eierstokkanker worden deze cellen verrijkt in de maligne ascites vloeistof in de peritoneale Holte, een aandoening die gepaard gaat met slechte klinische uitkomsten1. Als gevolg van de kwaadaardige capaciteiten van CSCs, is er een duw geweest om nieuwe CSC-targeting te ontwikkelen die in combinatie met traditionele chemotherapieën wordt gebruikt. Er zijn verschillende uitdagingen die gepaard gaan met de ontwikkeling van CSC-targeting op drugs, waaronder: 1) moeilijkheden bij het uitbreiden en onderhouden van CSCs in vitro; 2) schaarste van de patiënt monsters; 3) fysiologische relevantie van het cultuurplatform; en 4) heterogeniteit in geneesmiddel gevoeligheid tussen patiënten. Dit protocol schetst de implementatie van een 3D-cultuurplatform met hoge doorvoer dat elk van deze uitdagingen kan overwinnen. Met name dit systeem zorgt voor een snelle geneesmiddelen screening met behulp van kleine aantallen patiënt-afgeleide ovariële CSCs, en is zeer vatbaar voor downstream analysetechnieken. Hoewel ideaal voor het bestuderen van ovariële kanker en CSCs, is ons platform ook waardevol bij het bestuderen van andere kankers en gedifferentieerde celtypen in complexe 3D-omgevingen.
Complexe 3-dimensionale (3D) modellen zijn essentieel in het bestuderen van de tumor micro Environment (TME), dat is een 3D-niche opgebouwd uit kankercellen, niet-kanker ondersteunende cellen, en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten4. Deze 3D-omgeving resulteert in unieke celmorfologie, celceldeling en celmatrix interacties, celdifferentiatie, Celmigratie, celdichtheid en diffusie gradiënten in vergelijking met traditionele 2D-celkweek in vitro4. Al deze factoren culmineren in differentiële drug Response binnen 3D-culturen, exposeren verhoogde drug resistentie en fysiologische relevantie7,8. Vanwege de rol van de 3D-TME in CSC-differentiatie en chemoresistance, is het essentieel om te schermen voor CSC-targeting op drugs in fysiologische micro-omgevingen. Verbetering van de fysiologische relevantie van CSC drug screening platforms heeft het potentieel om patiënt specifieke drug screening te verbeteren, ontwikkeling van geneesmiddelen, formulering van behandelingsstrategieën, en uiteindelijk klinische uitkomsten. Het is net zo belangrijk dat het platform dat wordt gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen een hoge doorvoer is en compatibel is met downstream-analysemethoden om kosten, tijd en klinische Vertaal tijd van veelbelovende medicijnen te minimaliseren9.
Op dit moment, het complex TME is het best onderhouden voor drug screening toepassingen door middel van in vivo modellen zoals Murine syngenic tumor modellen, cellijn-afgeleide xenografts, en patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen12, als ze bieden fysiologisch Voorwaarden. Echter, de lage doorvoer aard van deze modellen, evenals de kosten, tijd en technische vaardigheden sets die ze nodig hebben beperkt hun nut in snelle, hoge doorvoer drug screening toepassingen13. Als alternatieven voor deze in vivo modellen, veel in vitro 3D-modellen met behulp van hydrogels8, cultuur binnen microfluïdische apparaten of ' Organ-on-a-chip ' apparaten10,14, en niet-aanhandige culturen3,8 zijn ook ontwikkeld, vanwege hun lage barrière voor toegang in termen van kosten, tijd en vereiste vaardigheden.
Hydrogel cultuur platforms zijn voordelig in de fijne controle die wordt geboden over de matrix samenstelling, mechanische eigenschappen en matrixstructuur15; echter, ze kunnen remmen hoge dichtheid celcultuur14. Bovendien kan het oogsten van cellen uit hydrogels de downstreamanalyse compliceren, als gevolg van mogelijk schadelijke effecten van oogstmethoden15. Microfluïdische apparaten, aan de andere kant, zijn Microscale apparaten die het mogelijk maken voor output detectie binnen hetzelfde apparaat en voor celkweek op fysiologisch relevante weegschalen met minimale consumptie van reagentia, verminderde reactietijd, geminimaliseerd afval, en Rapid Diffusion14. Deze kenmerken maken ze veelbelovende platforms voor het onderzoeken van drug toxiciteit, werkzaamheid, en farmacokinetiek. Echter, de uitdagingen van efficiënte, kwantificeerbare, reproduceerbare en gebruiksvriendelijke 3D-celcultuur, evenals, omvangrijke en dure pompsystemen hebben beperkt microfluïdische toepassingen in high-throughput Research10. Efficiënte detectie opstellingen en mogelijk moeilijke implementatie op verschillende terreinen hebben ook de wijdverbreide acceptatie van microfluïdische systemen10belemmerd.
In tegenstelling tot het ontstaan van sferoïden in niet-aanhangende omstandigheden in roterende mixers (nutators), Ultra-Low-bevestigings platen en hangende druppels worden geen door de gebruiker gedefinieerde matrix componenten opgenomen. Deze methodologieën zijn vooral relevant voor het bestuderen van ovariële kanker, aangezien de niet-aanhandende omstandigheden representatief zijn voor de omstandigheden waarin sferoïden binnen de peritoneale holte5groeien. Binnen deze niet-aanhangende kweekmethoden is aangetoond dat nutator en hangende valsspheroids een hogere verdichting, herinrichting en chemoresistance vertonen in vergelijking met sferoïden die in uiterst lage bevestigings platen worden gegenereerd, wat suggereert dat er meer fysiologische relevantie16,17,18,19. Door de toegenomen capaciteit voor screening met hoge doorvoer van kleinere goed groottes en minimale vereiste celaantallen is spheroid-generatie in hangende drop platen een ideaal platform voor geneesmiddelen screening. Hier presenteren we een instelbaar 3D-fysiologisch platform in 384-goed hangende druppel platen, die gemakkelijk te implementeren en zeer vatbaar zijn voor downstream-analyse, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drug screening van eierstokkanker en ovariële CSCs.
Ons 3D-fysiologisch platform biedt alle voordelen van 3D-cultuur, waaronder fysiologische celcelcontacten, diffusie gradiënten, celdichtheden en natuurlijk geproduceerde ECM-eiwitten, die kunnen bijdragen aan realistische geneesmiddel responsen16, 17,18,19. Bovendien kunnen we, door deze sferoïden te genereren met door de patiënt afgeleide CSCS, patiënt specifieke reacties op drugs1 vaststellen met veel technische replicaten tegelijkertijd, om heterogeniteit te overwinnen die kan worden gevonden binnen de tumor van de patiënt voorbeelden20. Bovendien is aangetoond dat 3D-cultuur het onderhoud van de CSC-populaties3,16 verbetert en dus representatief is voor de verrijkte CSC-populaties in de ascites7. Dit gecombineerd met eenvoudige downstream analyse, met inbegrip van flow cytometrie analyse van de levensvatbaarheid en CSC-verhoudingen zorgt voor een optimale evaluatie van CSC targeting drug werkzaamheid. Ten slotte is dit fysiologisch platform compatibel met Imaging op meerdere tijdstippen tijdens het experiment, evaluatie van celdood en proliferatie, celorganisatie en morfologie met immunohistochemie, oplosbare signalering met ELISA op geconditioneerde medium, celfenotypes met Flowcytometrie en genexpressie na PCR.

<table><tbody><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>ILT25200056</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>10,000 cSt Si olie</td><td>Millipore Sigma</td><td>63148-62-9</td><td>Wordt gebruikt om de spheroid array mal te coaten om het verwijderen van weefselverwerkingsgels, zoals Histogel, uit de mal te vergemakkelijken.</td></tr><tr><td>100 mm weefselkweekschaal</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buis</td><td>Celltreat</td><td>FL4021</td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM voor Serum Vrij Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1x F12 voor Serum Vrij Medium</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Gibco</td><td>ILT10010023</td><td></td></tr><tr><td>4&rsquo;,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies Inc.</td><td>1449</td><td>Een mild enzym voor celdetachering, samengesteld uit proteolytische en collagenolytische enzymen.</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td>Resazurin kleurstof gebruikt om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen te meten op basis van hun vermogen om resazurin te reduceren tot resorufine, die sterk fluorescerend is.</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR assay kit</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1700</td><td>Kit om stam- en voorlopercellen te identificeren die hoge niveaus van aldehyde dehydrogenase uitdrukken, een indicator van kanker stamcellen. De kit bestaat uit ALDEFLUOR Reagens, DEAB, Zoutzuur, Dimethylsulphoxide, en ALDEFLUOR Assay Buffer.</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1705</td><td>Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is een remmer van ALDH iso-enzymen, gebruikt om niet-specifieke ALDH kleuring te bepalen.</td></tr><tr><td>Andor iXon x3 CCD Camera</td><td>Oxford Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotica en Antimycotica</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>APC-isotype IgG2b</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-092-217</td><td>Isotype controle om niet-specifieke kleuring van IgG2b antilichamen te kwantificeren.</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 Insulin Injectiespuiten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-113-184</td><td>Fluorescente antilichaam gericht op CD133, een kanker stamcel marker.</td></tr><tr><td>cellSens Dimension Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4394</td><td>Platinum-gebaseerde chemotherapie-middel dat functioneert als een alkylerend middel dat DNA verstoort.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale Groeifactor</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>AME3300</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - premium (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Weefselverwerkingsgel die kan penetreren en het specimen in de gel kan houden terwijl het verkleuringen rond het specimen tijdens het kleuren voorkomt.</td></tr><tr><td>Human Adipose-Derived Mesenchymal Stamcellen</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>Human Microvascular Endotheelcellen</td><td>Lonza</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrine-Selenium Supplement</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead levensvatbaarheidskit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Kit voor de detectie op basis van fluorescentie van levende (calcein-AM) en dode cellen (Ethidium Homodimer-1).</td></tr><tr><td>MEM Niet-essentiële Aminozuren</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 7.8 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 Omgekeerde Confocale Microscoop</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83 Research Omgekeerde Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Thomas Scientific</td><td>7315D35</td><td>Thermoplastische polymere strips die dienen om druppelevaporatie in zwevende druppel platen te beperken terwijl ze gasuitwisseling toestaan.</td></tr><tr><td>Perfecta 3D 384 Well Hangende Druppel Platen</td><td>3D Biomatrix</td><td>HDP1384-8</td><td>Beschikbaar via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>phalloidin AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Phalloidin is een peptide om F-actin in gefixeerde cellen fluorescent te labelen.</td></tr><tr><td>ProJet 3500 HD Max</td><td>3D Systems</td><td>-</td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Steriele DI water</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Azo kleurstof gebruikt om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen op basis van zijn vermogen om door de beschadigde membraan van dode cellen te passeren, maar niet door de intacte membraan van levende cellen.</td></tr><tr><td>VisiJet M3 Crystal</td><td>3D Systems</td><td>-</td><td>Een biocompatibel polymeer materiaal voor 3D printen.</td></tr><tr><td>Yokogawa CSU-X1 Confocale Scanner Unit</td><td>Yokogawa</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

fysiologisch patiënt afgeleide 3d-spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In dit protocol schetsen we de procedure voor het genereren van tumor sferoïden binnen 384-goed hangende druppeltjes om een high-throughput screening van anti-kankertherapieën mogelijk te maken in een fysiologisch representatieve micro-omgeving. We schetsen de vorming van patiënten afgeleide Kanker stamcel sferoïden, evenals, de manipulatie van deze sferoïden voor grondige analyse na medicamenteuze behandeling. Concreet beschrijven we de verzameling van spheroid-morfologie, proliferatie, levensvatbaarheid, geneesmiddeltoxiciteit, celfenotype en lokalisatiegegevens van cellen. Dit protocol richt zich sterk op analysetechnieken die eenvoudig worden geïmplementeerd met het 384-well Hanging drop-platform, waardoor het ideaal is voor een hoge doorvoer van drugs screening. Terwijl we benadrukken het belang van dit model in ovariële kanker studies en kanker stamcelonderzoek, de 384-well platform is vatbaar voor onderzoek van andere soorten kanker en ziekte modellen, uitbreiding van het nut van het platform om vele gebieden. Door de snelheid van gepersonaliseerde geneesmiddelen screening en de kwaliteit van screening resultaten te verbeteren door eenvoudig te implementeren fysiologisch representatieve 3D-culturen, wordt dit platform voorspeld om te helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën en patiëntspecifieke behandelstrategieën en hebben zo een brede klinische impact.

Spheroids gevormd met cellijnen of door de patiënt afgeleide CSCs kunnen worden gevormd met een reeks kleine celaantallen binnen hangende druppeltjes (Figuur 2a). Spheroids vormen betrouwbaar met slechts 10 cellen per put, waardoor zeldzame patiënt monsters kunnen worden beschermd. Cellen binnen deze sferoïden zijn omgeven door andere cellen in 3 dimensies zoals ze zouden zijn in vivo, waardoor fysiologisch celcelcontacten en diffusie percentages. Tumor cellen binnen de spheroïden proliferer...

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Ons protocol biedt een eenvoudige methode voor 3D-celcultuur en is zeer vatbaar voor downstream-analyse. Dit vergemakkelijkt de evaluatie van heterogene patiëntmonsters en hun specifieke medicijnreacties. Het voordeel van deze techniek is dat sferoïden kunnen worden gevormd uit kleine celnummers, waardoor zowel het behoud van schaarse primaire monsters als een hoge doorvoerscreening op patiëntspecifieke medicijnreacties mogelijk is.De opknoping drop model creëert een fysiologische omgeving met 3D-drug diffusie en doet reacties die overeenkomen met tumor stadium. Dit maakt de ontwikkeling van gerichte therapieën en patiëntspecifieke behandelingen mogelijk. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van eierstokkanker, heterogeniteit en de ontwikkeling van chemoresistentie.Het kan echter ook worden gebruikt om andere vormen van kanker en resistente celpopulaties te bestuderen. Bij het plating van sferoïden is het belangrijk om precieze volumes te pipetten. Dit zorgt voor consistentie tussen sferoïden.De sferoïden en hun respectieve druppels zijn inherent kwetsbaar en gemakkelijk verloren zonder de juiste behandeling, daarom zullen we laten zien hoe op de juiste manier plaat, onderhou

physiologic-patient-derived-3d-spheroids-for-anti-neoplastic-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Er wordt een protocol gepresenteerd voor robotisch afdrukken van kankercelsferoïden in een 96-wellsplaatformaat met hoge doorvoer met behulp van een waterig tweefasensysteem.

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

We beschrijven de evolutie van een sferoïde gebaseerde, driedimensionale in vitro model waarmee we kunnen testen van de huidige standaard voor experimentele therapie regimes voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom op cellijnen, die gericht zijn op het evalueren van therapie gevoeligheid en weerstand op primaire cellen van menselijke specimens in de toekomst.

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Een nieuwe drie-dimensionale sferoïde model gebaseerd op de heterotypische interactie van tumorcellen en stromal fibroblasten wordt vastgesteld. Hier presenteren we cocultuur van tumorcellen en stromalfibroblasten, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie om de vorming van sferoïden te visualiseren. Dit driedimensionale model biedt een relevant platform om tumor-stroma interacties te bestuderen en kankertherapieën te testen.

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer hoe je fysiologische 3D-spheroïden genereert uit patiëntcellen voor high-throughput screening van anti-neoplastische geneesmiddelen. Deze methode ondersteunt precisiegeneeskunde door patiëntspecifieke therapieën te ontwikkelen.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Meer video's verkennen