Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen

Het protocol is nuttig voor het verkrijgen van kwantitatief inzicht in de temporele regulatie van virale genproducten, binnen de context van gastheercellen, vooral met betrekking tot herpesvirussen. Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van onderzoeksvragen met betrekking tot zowel gastheer als virale RNAs en eiwitten. Bovendien is deze techniek compatibel met gelijktijdige biochemische testen.

Om de cellen aan acht kamerdia's te hechten, breng 200 microliter van een inherente celsuspensie aan op elke kamer van een steriele, acht chambered slide en laat zaadgroei gedurende 12-24 uur, bij 37 graden Celsius, en 5% kooldioxide. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatant en niet-verbonden cellen, en onmiddellijk vast te stellen de cellen met voorgekoelde 4%formaldehyde in PBS op ijs, gedurende 30 minuten. Aan het einde van de fixatie, was de cellen met drie, vijf minuten wast in 200 microliters van 4 graden Celsius PBS per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, permeabiliseren van de vaste cellen met 200 microliters van voorgekoelde 0,5%Triton-X in PBS per put, gedurende 10 minuten op ijs. Verwijder aan het einde van de permeabilisatie de kamers voorzichtig zonder de schuif te kraken en spoel de cellen af met voorgekoelde PBS. Blokkeer de gespoelde cellen met voorgekoelde 4%BSA in PBS gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, gevolgd door incubatie met passende polyklonale primaire antilichaam van belang in 0,1%BSA in PBS gedurende een uur, bij vier graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie was je de cellen drie keer met verse PBS en broed de cellen uit met een passend secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorofokoeïne die compatibel is met het FISH-detecterende antilichaam gedurende een uur, bij vier graden Celsius. Na drie PBS wast zoals aangetoond, bevestig de monsters opnieuw in 4%formaldehyde in PBS gedurende 10-15 minuten voor een seconde permeablisatie zoals aangetoond. Bedek vervolgens de glijbaan met aluminiumfolie om het tl-signaal te behouden en fotobleaching te voorkomen.

En was de cellen met 2x zout natriumcitraat, voordat u 45 microliter hybridisatieoplossing toepast. Voeg na een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde kamer gedestilleerd water toe aan de antisense oligonucleotiden van belang om het denaturatievolume op 10 microliter te brengen. Ontature de oligonucleotiden op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, alvorens 35 microliter verse hybridisatieoplossing per dia toe te voegen.

Dan incubeer de monsters van 10-24 uur in de bevochtigde kamer op 37 graden Celsius, beschermd met folie. De volgende dag, was de cellen met twee, 10 minuten. 2x zout natriumcitraat wast bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt in 1X zout natriumcitraat gedurende 10 minuten, bij 25 graden Celsius.

Na de laatste wasbeurt, bevestig de cellen met voorgekoelde 4%formaldehyde in PBS, gedurende 10-15 minuten op ijs, gevolgd door drie wasbeurten met verse PBS. Vervolgens permeabiliseren van de monsters zoals aangetoond, gevolgd door incubatie met anti-dioxigenine FTC en voorgekoelde 0,1% BSA in PBS, gedurende een uur op vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBX, en bevestig de monsters met voorgekoelde 4%paraformaldehyde in PBS, gedurende 10-15 minuten op vier graden Celsius.

Na drie wasbeurten in PBS, label de kernen met 0,4 microgram per milliliter DAPI en voorgekoelde 0,5% Triton-X in PBS gedurende 15 minuten op ijs, gevolgd door drie laatste wasbeurten in PBS. Monteer dia's met fluorescerende kralen, als experimenteel relevant en in passend montagemedium. Na het verwijderen van overtollig montagemedium met steriele doekjes, verzegelen een coverslip naar elke dia met meerdere lagen van duidelijke nagellak, en gebruik een fluorescerende microscoop om een succesvolle uitvoering van het experiment te bevestigen.

Beelden kunnen dan worden genomen op een confocale microscoop om beelden van de monsters te verzamelen binnen een uur tot een week na montage, bij een 630 keer vergroting. Deze representatieve FISH en immunofluorescentie resultaten zijn semikwantitieve en bieden inzicht in oligonucleotide lokalisatie, in plaats van in vergelijkingen tussen de intensiteiten van de verschillende fluorescerende vlekken, omdat deze experimenten geen fluorescerende kraal in de dia voorbereiding. In deze experimenten waren de cytoplasmatische en nucleaire gebieden en hun ratio's verschillend voor latente en lytische KSHV geïnfecteerde cellen.

Zoals geïllustreerd in deze figuur, wordt het gebied gecontroleerd in de nucleocytoplasmatische verhouding. Wanneer KSHV DNA-replicatie wordt geremd in de lytische fase, verschuift het vroege lytische eiwit van KSHV oligonucleotide transcriptie naar een overwegend cytoplasmatische lokalisatie. KSHV polyadenylated RNA, echter, lokaliseert naar specifieke nucleaire sites, ondanks de remming van virale DNA-replicatie.

Bij het verwijderen van de kamers uit de dia's, zorg ervoor dat er zeer weinig lijm residu op het gereedschap, en gebruik ethanol om de cellen permeablize en verzwakken de lijm. Biochemische tests zoals QPCR, Western blot en high-throughput sequencing, kunnen samen worden uitgevoerd om de kwantitatieve gegevens die uit de micrografen worden verzameld, te vergroten.