Name: Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hoe u tumororganoïden genereert uit genetisch gemanipuleerde muismodellen van prostaatkanker. Deze methode omvat dissectie van het urogenitale systeem en een stap-voor-stap protocol voor orgaanoïdcultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken het Calvin Kuo-laboratorium aan de Stanford-Universiteit voor het feit dat HEK293 cellen stabiel zijn getransventeerd met HA-Mouse Noggin-FC of HA-Mouse Rspo1-FC. We willen ook Dr. Dean Tang bedanken voor het toestaan van toegang tot de fluorescerende dissectie Microscoop in zijn laboratorium. Dit werk werd gesteund door CA179907 tot D.W.G. van het National Cancer Institute. Gedeelde bronnen bij Roswell Park uitgebreid Kankercentrum werden ondersteund door National Institutes of Health Cancer Center ondersteuning Grant CA016056.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).</li>
<li>Furth, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+expression+in+transgenic+mice+by+a+tetracycline-responsive+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).</li>
<li>Aranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+directionality+in+the+Cre-LoxP+site-specific+recombination+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway.</a> Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).</li>
<li>Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+and+spatially+regulated+somatic+mutagenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice.</a> Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+for+controlling+the+timing+and+order+of+engineered+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice.</a> Genesis. 56 (8), 23242(2018).</li>
<li>Brocard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporally+controlled+site-specific+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).</li>
<li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+mouse+cancer+models%3A+a+maze+of+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2019%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2019.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. , (2019).</li>
<li>Bluemn, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+Receptor+Pathway-Independent+Prostate+Cancer+Is+Sustained+through+FGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling.</a> Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+p53+and+Rb+deficiency+in+a+conditional+mouse+model+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer.</a> Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+prostate%3A+a+basic+anatomical+and+histological+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Bosnian+Journal+of+Basic+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li>
<li>Callis, G., Sterchi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+Bone%3A+Literature+Review+and+Practical+Study+of+Various+Decalcifying+Agents%2C+Methods%2C+and+Their+Effects+on+Bone+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology.</a> The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).</li>
<li>Dardenne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Myc+Induces+an+EZH2-Mediated+Transcriptional+Program+Driving+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).</li>
<li>Blattner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOP+Mutation+Drives+Prostate+Tumorigenesis+In+Vivo+through+Coordinate+Regulation+of+PI3K%2FmTOR+and+AR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling.</a> Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).</li>
<li>Agarwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële relaties om openbaar te maken.

Kritische stappen binnen het protocol voor prostaat tumor dissectie en organoïde generatie Verwijdering van niet-prostaatweefsel en fijne dissectie van de muis prostaat tumor is cruciaal voor de optimale generatie van kanker organoïden omdat zowel niet-prostaat epitheelcellen en normale prostaat epitheelcellen organoïden zullen genereren. Voor vaste prostaattumoren specifiek, het is cruciaal om te isoleren gebieden van levensvatbare tumor te verwijderen van besmetting met necrotisch weefsel dat het aa...

Sinds de late jaren 1980, de mogelijkheid om genen te veranderen door homologe recombinatie heeft sterk gevorderd de studie van biologische systemen1. Indusgebonden, weefsel-, of cel-specifieke promotor systemen en sitespecifieke recombinases, zoals CRE-loxp, heeft geavanceerde genetische studies door het faciliteren van controle over genetische modificaties zowel temporeel als ruimtelijk2,3, 4. De combinatie van deze genetische strategieën heeft een breed scala aan experimentele modelsystemen5,6,7gecreëerd.
Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een integraal instrument om te beoordelen hoe individuele genen of groepen van genen van invloed zijn op de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren. In preklinisch kankeronderzoek zijn GEMMs de meest fysiologisch relevante en rigoureuze methode om kankerontwikkeling, progressie en behandeling8te bestuderen. Ons laboratorium is gespecialiseerd in het genereren en karakteriseren van kanker GEMMs.
De hoogst gediagnosticeerde niet-cutane kanker onder mannen in de Verenigde Staten is prostaatkanker (PCa). De meerderheid van de patiënten met PCa heeft een ziekte met een laag risico en een hoge overlevingskans, maar de overlevingskansen dalen drastisch wanneer ziekte wordt gediagnosticeerd in gevorderde stadia of als gerichte hormonale therapie progressie induceert naar agressieve, niet-curabele PCa subtypen9,10. Ons laboratorium heeft GEMMs ontwikkeld die gebruik maken van floxed allelen van één of meer tumor suppressor genen. Recombinatie en verlies van tumor suppressor genexpressie komt specifiek voor in de prostaat omdat we een transgen hebben geïntroduceerd met CRE of downstream van de probasin Promoter geactiveerd alleen in prostaat epitheelcellen11, 12. we hebben ook onze gemms gefokt om een CRE reporter transgen genaamd MT/mg, die induceert tomaat fluorescerende eiwit expressie in cellen ontbreekt CRE en groene fluorescerende proteïne (GFP) expressie in cellen met CRE13. Terwijl de presentatie van deze methode en onze representatieve resultaten tonen GEMMs we studeren in ons laboratorium, dit protocol kan worden gebruikt voor het genereren van prostaatkanker organoïden van elke muismodel. Echter, zoals uitvoerig besproken in onze representatieve resultaten sectie, we hebben geconstateerd dat bepaalde tumor kenmerken zijn optimaal voor prostaatkanker organoïde generatie.
In het afgelopen decennium, nieuwe methoden voor het kweken van cellen uit weefsels van epitheliale oorsprong heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons vermogen om te modelleren orgel systemen in vitro14,15. De term "3D-celcultuur" is toegeschreven aan de technieken die betrokken zijn bij het tot stand brengen en onderhouden van organoïden, die in het algemeen kunnen worden gedefinieerd als structuren die bestaan uit cellen die secundaire architectuur assembleren, aangestuurd door Orgaanspecifieke cellineage kenmerken16. Deze nieuwe methoden zijn verschillend van de klassieke 2D-celcultuur in die cellen vereisen geen transformatie of vermoralisatie voor langetermijngroei; Zo kunnen 3D-culturen van normale cellen worden vergeleken met zieke cellen. Dit is vooral waardevol bij kankeronderzoek waarbij normale celcontrole culturen meestal niet beschikbaar zijn. Daarnaast vormen organoïden spontaan secundaire weefsel architecturen met geschikte gedifferentieerde celtypen, waardoor ze een beter modelsysteem zijn om kanker in vitro te begrijpen dan 2D cellijnen17. Ons laboratorium heeft 3D organoïde lijnen gemaakt van tumor probleem geïsoleerd van onze PCA gemms om onze in vivo gegevens aan te vullen en experimenten uit te voeren die niet haalbaar zijn in gemms.
In dit artikel presenteren we geschreven en visuele protocollen voor de volledige obductie van PCa GEMMs, inclusief dissectie van verschillende muizen prostaat lobben en gemetastaseerde laesies. We beschrijven en tonen een stap-voor-stap methode voor het genereren van organoïden van muizen prostaattumoren op basis van een protocol eerder gepubliceerd door Drost et al. voor het afleiden van organoïden van normale muis prostaat epitheelweefsel18.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles</td><td>Becton Dickinson</td><td>Z192430</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral buffered formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12+++</td><td>Gibco</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>30216623</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Board</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-1</td><td></td></tr><tr><td>EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td><td>Manufactured by Trevigen</td><td>Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory</td><td>Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Sigma</td><td>25-060</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Epidermal growth factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>25-005</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Precision balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>30216561</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel #23</td><td>World Precision Instruments</td><td>504176</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #7, 16 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500238</td><td></td></tr><tr><td>Single-edge carbon razor blade</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Y-276632 (Rock Inhibitor)</td><td>APExBIO</td><td>A3008</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van tumor organoïden uit genetisch gemanipuleerde muismodellen van prostaatkanker

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

Methoden op basis van homologe recombinatie om genen te wijzigen hebben aanzienlijk bevorderd biologisch onderzoek. Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een strenge methode om de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren te bestuderen. Ons laboratorium heeft verschillende GEMMs van prostaatkanker (PCa) ontwikkeld die geen expressie van één of meerdere tumor suppressor genen hebben met behulp van het sitespecifieke CRE-loxP of systeem en een prostaat-specifieke promotor. In dit artikel beschrijven we onze methode voor obductie van deze PCa GEMMs, voornamelijk gericht op dissectie van muis prostaattumoren. Nieuwe methoden die de afgelopen tien jaar zijn ontwikkeld, hebben de cultuur van epitheel afgeleide cellen vergemakkelijkt om orgel systemen in vitro in drie dimensies te modelleren. We ook detail een 3D-cel cultuur methode voor het genereren van tumor organoïden van muis PCa GEMMs. Pre-klinisch kankeronderzoek is gedomineerd door 2D celcultuur en cellijn-afgeleide of patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is modellen. Deze methoden ontbreken tumor micro Environment, een beperking van het gebruik van deze technieken in pre-klinische studies. Gemms zijn fysiologisch relevant voor het begrijpen van tumorvorming en kanker progressie. Tumor organoïde cultuur is een in vitro modelsysteem dat tumor architectuur en cellineage kenmerken aan. Bovendien, 3D-celkweek methoden zorgen voor groei van normale cellen voor vergelijking met tumor celculturen, zelden mogelijk met behulp van 2D-celkweek technieken. In combinatie heeft het gebruik van GEMMs en 3D-celcultuur in preklinische studies het potentieel om ons begrip van Kankerbiologie te verbeteren.

Representatieve obductie beelden van een muis met een grote vloeistof gevulde primaire prostaat tumor in de voorste prostaat regio worden weergegeven in Figuur 2a. Figuur 2Bdaarentegen vertoont representatieve obductie beelden van een muis met een grote vaste primaire prostaat tumor waarvoor individuele prostaat gebieden niet te onderscheiden zijn. Fluorescerende dissectie beelden tonen dezelfde solide prostaat tumor uit <strong...

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

Muis organoïde culturen lijken meer op in vivo celorganisatie dan traditionele celculturen. In kankeronderzoek, organoïden model de oorspronkelijke tumor beter dan 2D-cellijnen en kan worden gebruikt om potentiële kankertherapieën te testen in vitro om nieuwe medicamenteuze behandelingen te ontwikkelen. Voor en bloc extractie van de mannelijke muis urogenital systeem pak de vetmat aan weerszijden van de blaas en trek naar boven om de testikel bloot te leggen.Ontleden zorgvuldig elke testikel uit de buurt van de rest van het urogenitale gebied. Til voorzichtig de blaas op, zodat het urogenitale gebied samen wordt verhoogd, waardoor de plasbuis eronder wordt blootsteld. Terwijl u de blaas vasthoudt, oriënteert u de schaar tegen de onderkant van de rugstaat om de urethra in te ringen.Het hele urogenitale gebied komt vrij uit de buikholte. Na het verwijderen van het urogenitale systeem worden de bekkenlymfeklieren die direct achter het urogenitale systeem en aan weerszijden van de wervelkolom worden geplaatst, blootgesteld. Om de lymfeklieren te verwijderen oriënteren rechte tangen onder het lymfeweefsel en trek omhoog.Greep vervolgens het rectum met de rechte tangen en snijd, trekken op het rectum om de hele dikke darm en dunne darm te ontrafelen om te zoeken naar uitgezaaide laesies in de mesenterische lymfeklieren. Wanneer het hele ilium is verwijderd blijven trekken op de twaalfvingerige darm om de maag bloot te stellen. Snijd de slokdarm om de maag volledig te verwijderen.Als er gemetastaseerde laesies in de lymfeklieren worden waargenomen, ontleden u deze knooppunten zorgvuldig uit de buurt van de darm voor opslag in PBS. Wanneer de maag is verwijderd, kan de milt worden geoogst van de rugzijde van de buik voor opslag in 4%paraformaldehyde. Verwijder de lever voor opslag in PBS.Verwijder de nieren van beide zijden van de wervelkolom, samen met eventuele nierlymfeklieren die uitgezaaide laesies bevatten. Om de borstholte bloot te leggen, snijdt u het middenrif langs de ribbenkast zorgvuldig door. De negatieve druk die vrijkomt in de borstholte zal het hart en de longen blootstellen.Trek op het borstbeen om de borstholte verder te openen. Scan het ventrale gezicht van de borstholte langs de ribbenkast op gemetastaseerde laesies in de thoracale lymfeklieren voor dissectie indien aanwezig. Terwijl nog steeds het borstbeen, snijd de ventrale ribbenkast om toegang te krijgen tot het hart en de longen en trek op het hart te snijden onder de longen.Om volledig te verwijderen van het hart en de longen en bloc snijd alle voorste bloedvaten in de luchtpijp. Breng het hart zorgvuldig over zonder het longweefsel of longverstastatische laesies in een container met PBS te beschadigen. Voor dissectie van de prostaattumor plaats het urogenitale gebied onder een dissectiemicroscoop.Gebruik een paar rechte tangen en een paar gebogen tangen om het urogenitale gebied op het rugoppervlak te draaien. Zoek het proximale proximale prostaatgebied dat kan worden geïdentificeerd door de roze-rode kleur van de plasbuis. Pak de plasbuis stevig vast om manipulatie van het urogenitale weefsel met de gebogen tangen mogelijk te maken.Zoek de basis van de zaadblasels om hun zorgvuldige verwijdering mogelijk te maken. Gebruik vervolgens de gebogen kant van de tangen om de vas deferens en zoveel mogelijk vet en bindweefsel te verwijderen. Terwijl nog steeds stevig bedrijf de plasbuis en proximale prostaat regio, gebruik maken van een paar fijne puntige schaar om de blaas te verwijderen uit de plasbuis.Houd het proximale prostaatgebied en urethra stevig met de rechte tangen grijpen het voorste prostaatgebied met de gebogen kant van de tangen om het weefsel stevig weg te trekken van de blaas en de rest van de prostaat. Plaats het voorste prostaatweefsel in PBS en lokaliseer het ventrale prostaatgebied. Verwijder het ventrale prostaatgebied op dezelfde manier.Als het zijgebied kan worden onderscheiden van het ruggebied verwijder het laterale prostaatgebied aan beide zijden. Verwijder vervolgens het dorsale prostaatgebied en plaats het proximale prostaatgebied in 4%paraformaldehyde. Na het snijden, plaats de tumor stukken in een 15-milliliter buis van de spijsvertering buffer voor een anderhalf tot twee uur spijsvertering op 37 graden Celsius.Aan het einde van de spijsvertering, sediment het verteerde weefsel door centrifugatie en gooi de supernatant. Veeg met de buis om de celpellet los te maken. Resuspend de cellen in een milliliter van voorverwarmde trypsine aangevuld met 10 micromolar Y-27632 ROCK remmer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.Aan het einde van de incubatietrituraat de weefseldrijfmest vijf keer met een standaard P1000 pipetpunt. Breng de buis terug naar het waterbad voor een extra vijf minuten incubatie en trituratie. Voor matrix koepel beplating wassen de verteerde cellen in negen milliliter van koud medium, dan verzamelen van de cellen door centrifugatie.Resuspend de cellen in een milliliter vers medium voor het tellen. En na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie opnieuw. Verdun de tumorcellen in het juiste volume van matrix.Laat voorzichtig 200 microliter matrixceloplossing in elke put van een 55 graden Celsius opgewarmde zesputige plaat vallen. Laat de koepels twee minuten op kamertemperatuur stollen voordat u de plaat gedurende 20 minuten ondersteboven in een couveuse van 37 graden Celsius plaatst. Wanneer de koepels volledig gestolde voeg twee milliliter van prostaat organoïde medium aangevuld met androgeen R1881 en ROCK remmer aan elke put.Breng de plaat terug naar de celkweek incubator. Fluorescerende dissectie beelden onthullen groene fluorescerende eiwitten, of GFP expressie, door vaste prostaat tumoren, wat aangeeft dat de tumorcellen Cre uitdrukken. De lever en longen van hetzelfde dier vertonen uitgezaaide tumoren die GFP uitdrukken waaruit blijkt dat deze tumoren afkomstig zijn van de primaire prostaattumor.De bekkenlymfeklier van deze muis drukt GFP uit en niet Tomaat, wat aangeeft dat deze uitgezaaide tumor de lymfeklier heeft ingehaald en er geen normaal weefsel overblijft. Op dag één van cultuur beginnen de kleine organoïden die uit een stevige prostaattumor worden geproduceerd zich met zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen te vormen die in de tumor organoïde cultuur aanwezig zijn. Op dag zeven en daarna, wanneer de prostaat tumor organoïden volledig zijn gevormd echter, de organoïden uitdrukken GFP, maar niet Tomaat, wat suggereert dat de organoïden zijn ontstaan uit Cre-uitdrukkende tumorcellen en niet uit normale epitheliale cellen.Op dag één van cultuur van kleine organoïden die uit vloeistof-gevulde prostaattumor worden geproduceerd zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen zijn aanwezig binnen de organoïde cultuur. Organoïden van met vloeistof gevulde prostaattumoren drukken op dag zeven en daarna echter GFP of Tomaat uit, wat aangeeft dat de organoïden gevormd zijn uit cellen die Cre niet uitdrukken. Om te blijven georiënteerd bij het oogsten van het prostaatweefsel, zich bewust zijn van de blaas en urethra posities te allen tijde.Na hun generatie kunnen de organoïden worden gebruikt in beeldvormende toepassingen, moleculaire biologieanalyse en medicijnschermen.

generation-tumor-organoids-from-genetically-engineered-mouse-models

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Organoids derived from tumors are a type of 3D cell culture model that can maintain the pathological features and organ-specific cell lineage of tumors. In the example protocol, we will see scientists generate organoids from a prostate tumor from a genetically engineered mouse model.

Preparing Organoids from Tumors: A 3D In Vitro Tumor Model

In this video, we describe the orthotopic transplantation of cultured bladder tumor organoids into the murine bladder to study the role of the organ environment on developing tumors.

Bladder Tumor Organoid Model: A Method for Orthotopic Transplantation of Bladder Organoids into Recipient Murine Bladder

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

Hier gepresenteerd is een protocol om farmacologische reacties te bestuderen in prostaat epitheel organoïden. Organoïden lijken nauw in vivo biologie en even patiënt genetica, waardoor ze aantrekkelijk modelsystemen. Prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit wild type prostates, genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker.

Prostaat-Organoid culturen als hulpmiddelen om genotypes en Mutationele profielen te vertalen naar farmacologische reacties

Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.

Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

Dit protocol biedt gedetailleerde experimentele stappen om een driedimensionale in vitro cultuur van blaastumororganoïden afgeleid van kankerverwekkende murineblaaskanker vast te stellen. Cultuurmethoden zoals passaging, genetische manipulatie en orthotopische transplantatie van tumororganoïden worden beschreven.

Cultuur, manipulatie en orthotopische transplantatie van mouse bladder tumor organoïden

Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

Organoïden die worden gegenereerd uit tumoren van patiënten worden orthotopisch in de lever van de muis geïnjecteerd. De resectie van niet-tumorachtig leverweefsel leidt tot een regeneratieve omgeving in het leverweefsel waar de tumor zich bevindt.

Een van patiënten afgeleide organoïde xenotransplantaatmodel voor hepatocellulaire kanker om de impact van leverregeneratie op tumorgroei te onderzoeken

De heterogeniteit van prostaatkanker en de resistentie tegen de behandeling blijven uitdagingen. We beschrijven een protocol voor het genereren van patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) die de belangrijkste kenmerken van de ouderlijke tumor behouden. Dit gestandaardiseerde model ondersteunt de screening van geneesmiddelen en de vooruitgang op het gebied van precisiegeneeskunde.

Oprichting en onderhoud van van patiënten afgeleide organoïden voor prostaatkanker: een gedetailleerd experimenteel protocol

Dit protocol beschrijft de generatie van een muisprostaat-organoïde-gebaseerd model dat in 2D is gekweekt. Het omvat organoïde dissociatie, celzaadvorming, differentiatie, beoordeling van de epitheelintegriteit en in-vitro infectie met uropathogene Escherichia coli. Het model biedt apicale toegankelijkheid en is geschikt voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties, waarmee het beperkingen van traditionele 3D-organoïde systemen overwint.

Generatie van een model gebaseerd op een muisprostaatorganoïde voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties

Leer hoe u tumororganoïden genereert uit genetisch gemanipuleerde muismodellen van prostaatkanker. Deze methode omvat dissectie van het urogenitale systeem en een stap-voor-stap protocol voor orgaanoïdcultuur.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Meer video's verkennen