Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Muis organoïde culturen lijken meer op in vivo celorganisatie dan traditionele celculturen. In kankeronderzoek, organoïden model de oorspronkelijke tumor beter dan 2D-cellijnen en kan worden gebruikt om potentiële kankertherapieën te testen in vitro om nieuwe medicamenteuze behandelingen te ontwikkelen. Voor en bloc extractie van de mannelijke muis urogenital systeem pak de vetmat aan weerszijden van de blaas en trek naar boven om de testikel bloot te leggen.

Ontleden zorgvuldig elke testikel uit de buurt van de rest van het urogenitale gebied. Til voorzichtig de blaas op, zodat het urogenitale gebied samen wordt verhoogd, waardoor de plasbuis eronder wordt blootsteld. Terwijl u de blaas vasthoudt, oriënteert u de schaar tegen de onderkant van de rugstaat om de urethra in te ringen.

Het hele urogenitale gebied komt vrij uit de buikholte. Na het verwijderen van het urogenitale systeem worden de bekkenlymfeklieren die direct achter het urogenitale systeem en aan weerszijden van de wervelkolom worden geplaatst, blootgesteld. Om de lymfeklieren te verwijderen oriënteren rechte tangen onder het lymfeweefsel en trek omhoog.

Greep vervolgens het rectum met de rechte tangen en snijd, trekken op het rectum om de hele dikke darm en dunne darm te ontrafelen om te zoeken naar uitgezaaide laesies in de mesenterische lymfeklieren. Wanneer het hele ilium is verwijderd blijven trekken op de twaalfvingerige darm om de maag bloot te stellen. Snijd de slokdarm om de maag volledig te verwijderen.

Als er gemetastaseerde laesies in de lymfeklieren worden waargenomen, ontleden u deze knooppunten zorgvuldig uit de buurt van de darm voor opslag in PBS. Wanneer de maag is verwijderd, kan de milt worden geoogst van de rugzijde van de buik voor opslag in 4%paraformaldehyde. Verwijder de lever voor opslag in PBS.

Verwijder de nieren van beide zijden van de wervelkolom, samen met eventuele nierlymfeklieren die uitgezaaide laesies bevatten. Om de borstholte bloot te leggen, snijdt u het middenrif langs de ribbenkast zorgvuldig door. De negatieve druk die vrijkomt in de borstholte zal het hart en de longen blootstellen.

Trek op het borstbeen om de borstholte verder te openen. Scan het ventrale gezicht van de borstholte langs de ribbenkast op gemetastaseerde laesies in de thoracale lymfeklieren voor dissectie indien aanwezig. Terwijl nog steeds het borstbeen, snijd de ventrale ribbenkast om toegang te krijgen tot het hart en de longen en trek op het hart te snijden onder de longen.

Om volledig te verwijderen van het hart en de longen en bloc snijd alle voorste bloedvaten in de luchtpijp. Breng het hart zorgvuldig over zonder het longweefsel of longverstastatische laesies in een container met PBS te beschadigen. Voor dissectie van de prostaattumor plaats het urogenitale gebied onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik een paar rechte tangen en een paar gebogen tangen om het urogenitale gebied op het rugoppervlak te draaien. Zoek het proximale proximale prostaatgebied dat kan worden geïdentificeerd door de roze-rode kleur van de plasbuis. Pak de plasbuis stevig vast om manipulatie van het urogenitale weefsel met de gebogen tangen mogelijk te maken.

Zoek de basis van de zaadblasels om hun zorgvuldige verwijdering mogelijk te maken. Gebruik vervolgens de gebogen kant van de tangen om de vas deferens en zoveel mogelijk vet en bindweefsel te verwijderen. Terwijl nog steeds stevig bedrijf de plasbuis en proximale prostaat regio, gebruik maken van een paar fijne puntige schaar om de blaas te verwijderen uit de plasbuis.

Houd het proximale prostaatgebied en urethra stevig met de rechte tangen grijpen het voorste prostaatgebied met de gebogen kant van de tangen om het weefsel stevig weg te trekken van de blaas en de rest van de prostaat. Plaats het voorste prostaatweefsel in PBS en lokaliseer het ventrale prostaatgebied. Verwijder het ventrale prostaatgebied op dezelfde manier.

Als het zijgebied kan worden onderscheiden van het ruggebied verwijder het laterale prostaatgebied aan beide zijden. Verwijder vervolgens het dorsale prostaatgebied en plaats het proximale prostaatgebied in 4%paraformaldehyde. Na het snijden, plaats de tumor stukken in een 15-milliliter buis van de spijsvertering buffer voor een anderhalf tot twee uur spijsvertering op 37 graden Celsius.

Aan het einde van de spijsvertering, sediment het verteerde weefsel door centrifugatie en gooi de supernatant. Veeg met de buis om de celpellet los te maken. Resuspend de cellen in een milliliter van voorverwarmde trypsine aangevuld met 10 micromolar Y-27632 ROCK remmer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatietrituraat de weefseldrijfmest vijf keer met een standaard P1000 pipetpunt. Breng de buis terug naar het waterbad voor een extra vijf minuten incubatie en trituratie. Voor matrix koepel beplating wassen de verteerde cellen in negen milliliter van koud medium, dan verzamelen van de cellen door centrifugatie.

Resuspend de cellen in een milliliter vers medium voor het tellen. En na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie opnieuw. Verdun de tumorcellen in het juiste volume van matrix.

Laat voorzichtig 200 microliter matrixceloplossing in elke put van een 55 graden Celsius opgewarmde zesputige plaat vallen. Laat de koepels twee minuten op kamertemperatuur stollen voordat u de plaat gedurende 20 minuten ondersteboven in een couveuse van 37 graden Celsius plaatst. Wanneer de koepels volledig gestolde voeg twee milliliter van prostaat organoïde medium aangevuld met androgeen R1881 en ROCK remmer aan elke put.

Breng de plaat terug naar de celkweek incubator. Fluorescerende dissectie beelden onthullen groene fluorescerende eiwitten, of GFP expressie, door vaste prostaat tumoren, wat aangeeft dat de tumorcellen Cre uitdrukken. De lever en longen van hetzelfde dier vertonen uitgezaaide tumoren die GFP uitdrukken waaruit blijkt dat deze tumoren afkomstig zijn van de primaire prostaattumor.

De bekkenlymfeklier van deze muis drukt GFP uit en niet Tomaat, wat aangeeft dat deze uitgezaaide tumor de lymfeklier heeft ingehaald en er geen normaal weefsel overblijft. Op dag één van cultuur beginnen de kleine organoïden die uit een stevige prostaattumor worden geproduceerd zich met zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen te vormen die in de tumor organoïde cultuur aanwezig zijn. Op dag zeven en daarna, wanneer de prostaat tumor organoïden volledig zijn gevormd echter, de organoïden uitdrukken GFP, maar niet Tomaat, wat suggereert dat de organoïden zijn ontstaan uit Cre-uitdrukkende tumorcellen en niet uit normale epitheliale cellen.

Op dag één van cultuur van kleine organoïden die uit vloeistof-gevulde prostaattumor worden geproduceerd zowel Tomaat als GFP-uitdrukkende cellen zijn aanwezig binnen de organoïde cultuur. Organoïden van met vloeistof gevulde prostaattumoren drukken op dag zeven en daarna echter GFP of Tomaat uit, wat aangeeft dat de organoïden gevormd zijn uit cellen die Cre niet uitdrukken. Om te blijven georiënteerd bij het oogsten van het prostaatweefsel, zich bewust zijn van de blaas en urethra posities te allen tijde.

Na hun generatie kunnen de organoïden worden gebruikt in beeldvormende toepassingen, moleculaire biologieanalyse en medicijnschermen.