Met behulp van zebravis larven om de pathologische gevolgen van hemorragische beroerte studie
June 5th, 2019
Hier presenteren we een protocol om hersenletsel te kwantificeren, bewegings tekorten en neuroinflammation na bloeden in de hersenen in zebravis larven, in de context van de menselijke intracerebrale bloeding (ICH).
Deze methode biedt een gratis preklinische benadering voor het bestuderen van de onmiddellijke cellulaire reactie op bloed in de hersenen na een hemorragische beroerte, een zeer ernstige aandoening waarvoor we geen specifieke medicijnen beschikbaar hebben voor patiënten. In tegenstelling tot knaagdiermodellen, stellen de transparantie van zebravissenlarven ons in staat om cellulaire reacties in de hersenen van levende intacte dieren in realtime te observeren met behulp van fluorescerende microscopie. Om te beginnen, gebruik maken van een thee zeef om alle bevruchte embryo's te verzamelen van natuurlijke paaien in fokdozen geproduceerd uit een mannelijke en een tot twee vrouwelijke volwassen zebravissen.
Breng 100 embryo's over naar elk petrischaaltje met standaard E3 embryomedium. Incubeer bij 28 graden Celsius en stadium volgens de standaard richtlijnen. Verwijder na zes uur bevruchting dode en onbevruchte embryo's uit de schaal met behulp van een Pasteur pipet en zet de gerechten terug in de couveuse.
Gebruik na 24 uur na de bevruchting, onder een helderveldstereoscoop, scherpe ultradunne dissectie-tangen om embryo's te decorioneren voor de behandeling met Atorvastatine. Voeg vervolgens 30 milliliter E3-embryomedium toe aan twee schone petrischaaltjes, een voor behandeling en de andere voor controle. Verwijder 60 microliter embryowater uit de behandelingsschaal en voeg 60 microliter van 0,5 millimolar Atorvastatine toe om 80% van de larven te krijgen.
Breng met behulp van een Pasteur pipet 100 embryo's in zo min mogelijk water naar elk gerecht. Broed de twee gerechten op 28 graden Celsius. Op elk moment na 50 uur na de bevruchting, onder de microscoop gebruik maken van een Pasteur pipet om zorgvuldig te scheiden bloedingen vis van niet-bloedingen populaties en de overdracht van de larven naar nieuwe gerechten met verse E3 media.
Om het gemakkelijker te maken om bloedingspositieve larven te scheiden, u vis gebruiken zonder pigment of vis die fluorescerend eiwit in rode bloedcellen uitdrukken. Op de derde dag, onder een fluorescerende microscoop scherm de larven om de expressie van fluorescerend eiwit te garanderen. Vul vervolgens de lichtplaatmontagekamer met E3-media met 0,2% MS-222 voor verdovening.
Breng met behulp van een Pasteur pipet een enkele druppel met één tot zes larven over op een droog petrischaaloppervlak voor montage. Gebruik een pipet om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Voeg een druppel van 1,5% lage smelt toe van het 45 graden Celsius warmteblok aan de larven en gebruik een 800 micrometer montagecapillaire om de larven eerst het hoofd omhoog te trekken.
Als de positionering niet nauwkeurig is, verdrijft u de larven uit de agarose en zet u opnieuw op. Laat de capillaire afkoelen en steek vervolgens in de lichtplaatkamer. Druk op de ZEN-beeldsoftware continu om de larven te oriënteren en druk op het verwerven van z-stack beelden van het hoofd tussen de ooglenzen.
Genereer op het tabblad verwerking een maximale intensiteitsprojectieafbeelding van elke z-stack. Om willekeurig te selecteren voor beweeglijkheidstest, breng 24 larven na anesthesie over in verse E3-media en laat de dieren herstellen van anesthesie. Nadat larven volledig hersteld zijn van anesthesie, met behulp van een pipet met de eindsnijoverdracht herstelde larven in E3-medium zonder methyleenblauw.
Plaat een larve in een milliliter per put van een 24 put plaat. Laad de plaat in de camerakamer. Pas in de EthoVision XT tracking software de experimentinstellingen aan om een witte lichtge schrikroutine in te stellen om spontaan zwemmen te verhogen en beweging gedurende 10 minuten te testen.
Herhaal de voortbeweging test op 96 en 120 uur post-fertilizatine. Beoordeling van de dood van hersencellen met behulp van een transgene alomtegenwoordige bijlage in V M veneuze reporter lijn resulteert in duidelijke duidelijke clusters van stervende cellen in bloedingen larven die afwezig zijn in alle niet-bloedinglarven aangegeven door groene fluorescentie Bright-field beelden tonen de aanwezigheid van hersenbloedingen. Stervende cellen werden waargenomen in zowel Atorvastatine en bubble head modellen voor bloedingen larven.
De morfologie van de MPEG1 positieve macrofagen veranderingen in intracerebrale bloeding positieve larven als de cellen vast te stellen in actieve afgeronde amoeboid vorm. Deze geactiveerde afgeronde cellen werden na verloop van tijd gecontroleerd om een verhoogde fagocytische respons van de alomtegenwoordige annexin afgescheiden Annexin V M veneuze uitdrukken stervende cellen in intracerebrale bloeding positieve larven te tonen. Hersenbloeding wordt geassocieerd met een significante afname van de beweeglijkheid op 72 en 96 uur na de bevruchting in vergelijking met intracerebrale bloeding negatieve broer of zus controles.
Beweeglijkheid op 120 uur na de bevruchting herstelt tot in de buurt van baseline niveaus. Het belangrijkste aspect van deze procedure is om er zeker van te zijn dat de larven grondig worden onderzocht op de aanwezigheid of afwezigheid van hersenbloedingen voordat u overgaat tot de fenotyperingstesten. Dit model kan ook worden gebruikt voor screening van geneesmiddelen om te bepalen of fenotype ernst kan worden verbeterd na een bloeding, een aanpak die ons kan leiden tot het identificeren van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen in de toekomst.
Deze techniek stelt ons in staat om de cellulaire reacties onmiddellijk na een bloeding in de hersenen te verkennen tijdens een tijdspunt dat is zo berucht moeilijk om te studeren voor nu. Hoewel geen van de in dit protocol beschreven reagentia of instrumenten specifiek gevaarlijk is, moeten standaardzorg en voorzorgsmaatregelen overal worden genomen wanneer u chemische stoffen, scherpe stoffen of lasers gebruikt.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het kwantificeren van hersenletsel, locomotieve tekorten en neuro-inflammatie bij zebravislarven na intracerebrale bloeding (ICH), een kritieke medische toestand bij mensen. Door gebruik te maken van de transparantie van zebravislarven, is real-time observatie van cellulaire reacties in een levend hersenmodel na een hemorragische beroerte mogelijk.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neuro-inflammatie
- Herstel na beroerte
Achtergrond
- Intracerebrale bloeding (ICH) is een ernstige medische toestand zonder specifieke behandelingen.
- Zebravislarven dienen als een innovatief model om hersenreacties te bestuderen vanwege hun transparantie.
- Real-time beeldvorming biedt inzicht in cellulaire dynamica na hersenletsel.
- Het onderzoek maakt gebruik van fluorescente microscopie om neuro-inflammatie en andere cellulaire reacties in de hersenen te beoordelen.
Doel van het onderzoek
- Om een pre-klinisch model te ontwikkelen voor het bestuderen van de cellulaire reactie op hemorragische beroerte.
- Om de effecten van ICH op locomotie en neuro-inflammatie te onderzoeken.
- Om mogelijke geneesmiddelkandidaten te onderzoeken voor het verminderen van de effecten van ICH.
Gebruikte methoden
- Het belangrijkste platform dat wordt gebruikt, is fluorescente microscopie voor het beeldvormen van cellulaire reacties.
- Zebravislarven zijn het biologische model, met een focus op hersenletsel door geïnduceerde bloedingen.
- Belangrijke tijdlijnen omvatten embryoverzameling, toediening van behandeling en daaropvolgende beeldvorming op bepaalde uren na bevruchting.
- Kritische fasen omvatten het monitoren van motiliteit en het beoordelen van neuro-inflammatoire reacties gedurende meerdere dagen.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante cellulaire reacties waargenomen, inclusief clusters van stervende cellen in gebleede larvae.
- Er werd een afname in motiliteit opgemerkt na de bloeding, met gedeeltelijke herstel na 120 uur.
- Geactiveerde macrofagen vertoonden morfologische veranderingen die geassocieerd zijn met de ICH-reactie.
- Dit model maakt de beoordeling van mogelijke therapeutische interventies voor beroerte mogelijk.
Conclusies
- Dit onderzoek stelt een zebravismodel voor het bestuderen van ICH en de cellulaire implicaties daarvan vast.
- De aanpak kan geneesmiddelscreeningsinitiatieven vergemakkelijken om de resultaten na hersenbloeding te verbeteren.
- Over het algemeen bevordert het de begrip van cellulaire dynamica na hersenletsel en mogelijke herstelmechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Zebrafish larval models address a critical gap in hemorrhagic stroke research by enabling real-time visualization of cellular responses to intracerebral hemorrhage, a process difficult to capture in opaque mammalian systems. This approach supports early target validation and mechanistic de-risking by quantifying neuroinflammation, cell death, and functional deficits in a disease-relevant in vivo system. The model’s compatibility with live imaging and motility assays provides predictive confidence for screening therapeutic candidates aimed at mitigating hemorrhage-induced pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immediate cellular responses to blood in the brain, supporting target validation in hemorrhagic stroke pathways.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through conserved pathological phenotypes such as dying cell clusters and macrophage activation, which mirror human ICH responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of locomotor dysfunction and neuroinflammation, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability via staged larval populations and automated tracking (e.g., EthoVision XT), enhancing throughput for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by recapitulating key ICH consequences—neuroinflammation, cell death, and motor deficits—enabling preclinical validation of mechanism-based interventions.
- Operational Value: Allows longitudinal assessment from 72 to 120 hours post-fertilization, supporting risk-adjusted advancement decisions based on phenotypic recovery or persistence.
Pipeline & Workflow Integration
The zebrafish larval ICH model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a bridge between mechanistic insight and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of Annexin V-positive dying cells and MPEG1 macrophage morphological shifts following hemorrhage.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable motility assays at 96 and 120 hpf, providing scalable, reproducible behavioral endpoints for compound screening.
- Analytics: Yields measurable outputs including fluorescence intensity of cell death reporters, macrophage morphology changes, and locomotion tracking data, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by modeling conserved human ICH pathologies, supporting biomarker-aligned target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for mechanistic screening and target de-risking across multiple therapeutic modalities due to its non-terminal, quantifiable readouts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of hemorrhage-induced neuroinflammation and cell death.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined staging (e.g., 24 hpf decoronation, Atorvastatin treatment) and blinded hemorrhage sorting before phenotypic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early efficacy signals in a disease-relevant system, reducing late-stage biological risk in stroke drug development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that improve hemorrhage phenotypes, informing advancement based on functional recovery and cellular rescue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, embryonic staging, and fluorescent microscopy for live imaging.
- Dependent on instrumentation including light sheet or fluorescence microscopes, agarose mounting systems, and automated behavior tracking tools (e.g., EthoVision XT).
- Necessitates cross-team standardization in hemorrhage scoring and larval separation to ensure phenotypic assay validity.
- Involves adaptation considerations for pigment-free or transgenic reporter lines to enhance hemorrhage detection and signal clarity.
- Limited by larval size and throughput constraints compared to higher vertebrates, though offset by rapid generation times and optical accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Day 0: Egg Production and Collection
1:11
Day 1 - 2: Atorvastatin Treatment and ICH- and ICH+ Populations Separation
2:22
Day 3 - 5: Cell Death, Leukocyte Analysis and Motility Assay
4:24
Results: Intracerebral Hemorrhage (ICH) in Zebrafish Larvae
5:39
Conclusion
