Met behulp van zebravis larven om de pathologische gevolgen van hemorragische beroerte studie

Deze methode biedt een gratis preklinische benadering voor het bestuderen van de onmiddellijke cellulaire reactie op bloed in de hersenen na een hemorragische beroerte, een zeer ernstige aandoening waarvoor we geen specifieke medicijnen beschikbaar hebben voor patiënten. In tegenstelling tot knaagdiermodellen, stellen de transparantie van zebravissenlarven ons in staat om cellulaire reacties in de hersenen van levende intacte dieren in realtime te observeren met behulp van fluorescerende microscopie. Om te beginnen, gebruik maken van een thee zeef om alle bevruchte embryo's te verzamelen van natuurlijke paaien in fokdozen geproduceerd uit een mannelijke en een tot twee vrouwelijke volwassen zebravissen.

Breng 100 embryo's over naar elk petrischaaltje met standaard E3 embryomedium. Incubeer bij 28 graden Celsius en stadium volgens de standaard richtlijnen. Verwijder na zes uur bevruchting dode en onbevruchte embryo's uit de schaal met behulp van een Pasteur pipet en zet de gerechten terug in de couveuse.

Gebruik na 24 uur na de bevruchting, onder een helderveldstereoscoop, scherpe ultradunne dissectie-tangen om embryo's te decorioneren voor de behandeling met Atorvastatine. Voeg vervolgens 30 milliliter E3-embryomedium toe aan twee schone petrischaaltjes, een voor behandeling en de andere voor controle. Verwijder 60 microliter embryowater uit de behandelingsschaal en voeg 60 microliter van 0,5 millimolar Atorvastatine toe om 80% van de larven te krijgen.

Breng met behulp van een Pasteur pipet 100 embryo's in zo min mogelijk water naar elk gerecht. Broed de twee gerechten op 28 graden Celsius. Op elk moment na 50 uur na de bevruchting, onder de microscoop gebruik maken van een Pasteur pipet om zorgvuldig te scheiden bloedingen vis van niet-bloedingen populaties en de overdracht van de larven naar nieuwe gerechten met verse E3 media.

Om het gemakkelijker te maken om bloedingspositieve larven te scheiden, u vis gebruiken zonder pigment of vis die fluorescerend eiwit in rode bloedcellen uitdrukken. Op de derde dag, onder een fluorescerende microscoop scherm de larven om de expressie van fluorescerend eiwit te garanderen. Vul vervolgens de lichtplaatmontagekamer met E3-media met 0,2% MS-222 voor verdovening.

Breng met behulp van een Pasteur pipet een enkele druppel met één tot zes larven over op een droog petrischaaloppervlak voor montage. Gebruik een pipet om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Voeg een druppel van 1,5% lage smelt toe van het 45 graden Celsius warmteblok aan de larven en gebruik een 800 micrometer montagecapillaire om de larven eerst het hoofd omhoog te trekken.

Als de positionering niet nauwkeurig is, verdrijft u de larven uit de agarose en zet u opnieuw op. Laat de capillaire afkoelen en steek vervolgens in de lichtplaatkamer. Druk op de ZEN-beeldsoftware continu om de larven te oriënteren en druk op het verwerven van z-stack beelden van het hoofd tussen de ooglenzen.

Genereer op het tabblad verwerking een maximale intensiteitsprojectieafbeelding van elke z-stack. Om willekeurig te selecteren voor beweeglijkheidstest, breng 24 larven na anesthesie over in verse E3-media en laat de dieren herstellen van anesthesie. Nadat larven volledig hersteld zijn van anesthesie, met behulp van een pipet met de eindsnijoverdracht herstelde larven in E3-medium zonder methyleenblauw.

Plaat een larve in een milliliter per put van een 24 put plaat. Laad de plaat in de camerakamer. Pas in de EthoVision XT tracking software de experimentinstellingen aan om een witte lichtge schrikroutine in te stellen om spontaan zwemmen te verhogen en beweging gedurende 10 minuten te testen.

Herhaal de voortbeweging test op 96 en 120 uur post-fertilizatine. Beoordeling van de dood van hersencellen met behulp van een transgene alomtegenwoordige bijlage in V M veneuze reporter lijn resulteert in duidelijke duidelijke clusters van stervende cellen in bloedingen larven die afwezig zijn in alle niet-bloedinglarven aangegeven door groene fluorescentie Bright-field beelden tonen de aanwezigheid van hersenbloedingen. Stervende cellen werden waargenomen in zowel Atorvastatine en bubble head modellen voor bloedingen larven.

De morfologie van de MPEG1 positieve macrofagen veranderingen in intracerebrale bloeding positieve larven als de cellen vast te stellen in actieve afgeronde amoeboid vorm. Deze geactiveerde afgeronde cellen werden na verloop van tijd gecontroleerd om een verhoogde fagocytische respons van de alomtegenwoordige annexin afgescheiden Annexin V M veneuze uitdrukken stervende cellen in intracerebrale bloeding positieve larven te tonen. Hersenbloeding wordt geassocieerd met een significante afname van de beweeglijkheid op 72 en 96 uur na de bevruchting in vergelijking met intracerebrale bloeding negatieve broer of zus controles.

Beweeglijkheid op 120 uur na de bevruchting herstelt tot in de buurt van baseline niveaus. Het belangrijkste aspect van deze procedure is om er zeker van te zijn dat de larven grondig worden onderzocht op de aanwezigheid of afwezigheid van hersenbloedingen voordat u overgaat tot de fenotyperingstesten. Dit model kan ook worden gebruikt voor screening van geneesmiddelen om te bepalen of fenotype ernst kan worden verbeterd na een bloeding, een aanpak die ons kan leiden tot het identificeren van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen in de toekomst.

Deze techniek stelt ons in staat om de cellulaire reacties onmiddellijk na een bloeding in de hersenen te verkennen tijdens een tijdspunt dat is zo berucht moeilijk om te studeren voor nu. Hoewel geen van de in dit protocol beschreven reagentia of instrumenten specifiek gevaarlijk is, moeten standaardzorg en voorzorgsmaatregelen overal worden genomen wanneer u chemische stoffen, scherpe stoffen of lasers gebruikt.