Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Deze monsterhouder kan worden gebruikt voor het kweken van kristallen en het verzamelen van röntgendiffractiegegevens. Deze monsterhouder is gemaakt voor het gebruik op 24-well platen die op grote schaal worden gebruikt in de MX-gemeenschap. Het zeer belangrijke aspect is dat er geen manipulatie nodig is.

Een voorbeeldhouder met deze hier beschreven aspecten bestond niet eerder. Iets zien is altijd veel beter dan er alleen maar over te lezen. Door de video te bekijken, kan een potentiële gebruiker de functies en fijne kneepjes van de nieuwe monsterhouder onmiddellijk begrijpen.

Om te beginnen, maak een schoon en stofvrij oppervlak met behulp van een vochtige, pluisvrije doek. Neem een monster houder uit de doos en voorzichtig plaats, gele folie naar boven gericht, op het schone oppervlak om schade of ongewenste punctie van de achterkant COC folie te voorkomen. Het opzetten van de kristallisatie druppels op de gele folie als het zou worden gedaan op veelgebruikte cover dia's.

Plaats de druppels voorzichtig om een breuk of piercing van de folie met behulp van een pipet te voorkomen. Bij monsterhouders van type 2 en type 3 zijn twee druppels het aanbevolen maximum. Op een type 1 monsterhouder kunnen maximaal drie druppels worden geplaatst.

Draai de monsterhouder om en plaats deze op een voorgevette holte van een Linbro-achtige plaat in 24-lijfstijl. Gebruik de positioneringshulpmiddelen van de monsterhouder om deze naar zijn optimale positie te leiden. Zorg voor de juiste positie van de monsterhouder om ongewenste verdamping te voorkomen.

Door de kristallisatieplaat onder een transmissie-lichtmicroscoop te plaatsen, zonder of zonder polarisatoren, monitort kristalgroei zonder enige verstoring van het experiment. Voer cryoprotectie uit onder een transmissielichtmicroscoop. Doorboor de buitenste COC folie voorzichtig met een fijne canula.

Zorg ervoor dat de binnengele folie onaangeroerd blijft. De punctie moet direct naast de druppel die moet worden gemanipuleerd. Steek een fijne papieren lont in het geprikte gat.

Duw de lont voorzichtig naar voren totdat hij de gele polyimidefolie raakt. Houd de lont in contact met de geperforeerde folie. De lont zuigt alle overtollige oplossing weg.

De tijd die nodig is voor volledige verwijdering van vloeistof is afhankelijk van de viscositeit van de oplossingen en de samenstelling van de moederdrank. Nadat alle vloeistof is weggezogen, trek voorzichtig de papieren lont in. Denk aan de positie van de druppel, omdat het mogelijk niet zichtbaar is na verwijdering van de moeder drank.

Neem een standaard pipet om een klein volume cryo-protectant oplossing aan te brengen, met behulp van een geëxtrudeerde tip door hetzelfde gat. Om de zelfherstellende COC-folie opnieuw te verdezelen, plaatst u voorzichtig ongeveer een seconde een beschermde vinger op het gat en schuift u deze over de punctie. De lichte druk in combinatie met de verhoogde temperatuur bevordert het opnieuw verdringing van niet te grote lekke banden.

Los de ligand op in moederdrank in de gewenste concentratie in een reactiebuis. Draai de oplossing 10 minuten op 12.000 keer g om onoplosbare deeltjes te verwijderen. Gebruik indien nodig een temperatuurgecontroleerde centrifuge.

Plaats voorzichtig maximaal drie microliters ligand-bevattende oplossing in de opening tussen de COC folie en de polyimide film met behulp van een lange, geëxtrudeerde pipet tip;trek de tip. Om de zelfherstellende COC-folie opnieuw te verdezelen, plaatst u voorzichtig ongeveer een seconde een beschermde vinger op het gat en schuift u deze over de punctie. Broed het experiment enige tijd uit om verspreiding over het membraan mogelijk te maken.

De wekende tijd is sterk afhankelijk van de viscositeit van de diffusing oplossing en de componenten ervan. Herhaal de ligand weken stappen meerdere malen om vervolgens weken verschillende liganden. Als u de verstrooiing van oplosmiddelen wilt minimaliseren, verwijdert u overtollige oplossing voordat gegevens worden verzameld.

Zorg voor een stabiele, vochtigheidsgestuurde beamline omgeving met vooraf vastgestelde omstandigheden. Als u het verzamelen van diffractiegegevens bij omgevingstemperatuur in situ wilt uitvoeren, moet u de transparante COC-folie voorzichtig op het aangewezen punt optillen met tangen en afpellen. Til nu voorzichtig de monsterhouder uit de holte en steek deze onmiddellijk in een vooraf voorbereide magnetische monsterhouderbasis.

Voor deze stap is geen lijm nodig. Druk voorzichtig uit om de juiste positionering van de monsterhouder binnen de basis te garanderen. Voor monsterhouders met een verwijderbare buitenring, breng zachte druk door vast te houden aan de buitenste ring en breek deze af op de aangewezen breekpunten.

Het voorbeeld is nu klaar voor het centreren en diffractiegegevensverzameling. Monteer de monsterhouder op een beamline goniometer en zorg voor een correcte positionering van de houder. Afhankelijk van de goniometergeometrie kan de monsterhouder tot 160 graden worden gedraaid zonder schaduw te veroorzaken tijdens het diffractieexperiment.

Gebruik een papieren lont en raak voorzichtig de gele polyimide folie van de achterkant om overtollige moeder drank te verwijderen. Het voorbeeld is nu klaar voor het centreren en diffractiegegevensverzameling. Bereid u voor op het verzamelen van diffiffractiegegevens in situ bij cryogene temperatuur zoals gedaan voor omgevingstemperatuur, dompel het monster vervolgens onder in vloeibare stikstof en breng het over in een spine-compatibele flacon.

De geometrie van de monsterhouder types 2 en 3 maakt de overdracht ervan in de standaard SPINE monster flacons, die kunnen worden gebruikt voor robot-assisted monster montage. De monsterhouder type 1 en type 2 zijn ontworpen om te passen op een put van een 24-well Linbro-stijl plaat. Elke individuele monsterhouder bevat positioneringshulpmiddelen aan weerszijden van de buitenste rand om een optimale positionering op de rand van de put te garanderen.

Een 24-well Linbro-stijl plaat werd gebruikt met de type 1 monster houder om een daling te equilibrate op 293 Kelvin tegen 500 microliters van moeder drank. Kristallen van 40 tot 50 micron werden waargenomen na vijf uur met behulp van een transmissie lichtmicroscoop met of zonder een polarisator. Een monsterhouder met kippeneiwit lysozymekristallen werd in een luchtstroom met vochtigheidsgestuurde luchtstroom op HZB-MX beamline 14.3 geplaatst.

Een typische diffractieafbeelding wordt hier weergegeven. Er kan geen verhoogde achtergrondverstrooiing op het diffractiebeeld worden gedetecteerd. Het is van cruciaal belang dat verontreinigingen van de polyimidefolie worden vermeden.

Verder is het belangrijk dat de monsterhouder nauwkeurig wordt geplaatst en kristalmanipulatie zorgvuldig wordt uitgevoerd. De monsterhouder maakt het hanteren van zeer delicate kristallen mogelijk, een van de belangrijkste stappen in micromoleculaire kristallografie. Het gebruik ervan vermindert de kans op vernietiging van het monster aanzienlijk.