Het injecteren van gryllus krekel eieren

Deze techniek dient als een fundamentele methode voor experimenten ontworpen om de embryonale of larve ontwikkeling van de krekel te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het flexibel is en verschillende soorten experimentele benaderingen zal ondersteunen, zoals die met behulp van RNA-interferentie of genomische manipulatie. Het aantonen van de procedure zal Hadley Wilson Horch zijn, de hoofdonderzoeker in het laboratorium.

Om te beginnen deze procedure nat de draaiende molen vlak van de schuine kant met druipend water. Plaats de getrokken naald in de schuine kant en draai deze in een hoek van 20 graden. Laat de naald zakken tot hij de slijpplaat aanraakt en twee tot drie minuten afschuift.

Beoordeel de schuine kant door het plaatsen van de schuine naald op dubbele plak tape die is gehecht aan een glazen microscoop dia. Plaats de dia op het podium van een samengestelde microscoop uitgerust met een camera en beeldacquisitiesoftware. Verkrijg een afbeelding van de naald met behulp van een 20x doelstelling.

Gebruik de beeldsoftware om de binnendiameter van de naald te meten, net proximaal tot de afgeschuinde opening. Gooi naalden weg met een opening kleiner dan acht micrometer of groter dan 12 micrometer. Maak eerst 40 milliliter van 1% agarose in water en giet het in een petrischaal van 10 centimeter.

Plaats een ei goed stempel op het oppervlak van de agarose voordat het stolt. Zodra de agarose is gestold, verwijder de stempel om de putten te onthullen. Vul vervolgens de agarose goed plaat met HBS met 1%penicilline streptomycine.

Leg het deksel op de schaal, wikkel het in Parafilm en bewaar het op vier graden Celsius. Vul hierna een petrischaaltje van 35 millimeter met wit speelterreinzand om een eierinzamelschaal te maken voor de krekels om er eieren in te leggen. Bedek de eierschaal met een papieren handdoek vierkant gesneden tot ongeveer 18 bij 18 centimeter.

Vul met kraanwater door de papieren handdoek. Dan, kantel de petrischaal en knijp voorzichtig de top om overtollig water te verwijderen. Stop de hoeken van de papieren handdoek vierkant onder de schotel en plaats het ei schotel in een omgekeerde deksel die zal helpen houden de papieren handdoek op zijn plaats.

Plaats het eischotel in de krekelbak en laat de volwassen vrouwtjes de eieren een tot twee uur oviposit. Laat ondertussen de agarose schotel op kamertemperatuur warmen ter voorbereiding op het vasthouden van de eieren voor injectie. Als je klaar bent, haal je de eierschaal, die nu vers gelegde eieren bevat, uit de krekelbak.

Verwijder de papieren handdoek en plaats een zeef met een porie grootte tussen 0,5 en een millimeter over een beker. Spoel de inhoud van de eierlegschaal in de zeef onder zacht stromend kraanwater. De zandkorrels zullen door de zeef gaas in het bekerglas hieronder vallen, terwijl de krekeleieren in de zeefmand blijven.

Vul een container met omgekeerd osmosewater en leg deze in een lade. Keer de zeef over de container en tik het tegen de schotel om de eieren los te maken in het water. De eieren zinken naar de bodem van de container.

Gebruik vervolgens een schaar om de punt van een P1000 pipettip af te snijden om een opening van ongeveer drie millimeter in diameter te maken. Plaats deze tip op een P1000 pipetter, en gebruik het om de eieren van de container naar de agarose eivormgebak. Met behulp van plastic pincet, line-up van de eieren in de agarose putten.

Elk ei zal zinken naar de bodem van een individuele put. Bedek de petrischaal met een deksel tot het klaar is om te injecteren. Om te beginnen, plaats de schotel van eieren onder de ontledende microscoop en selecteer een lage vergroting van ongeveer 10x.

Maak 1,5 microliter injectieoplossing met 20 microliter laadtips en een P10-pipet en steek de laadpunt in het brede uiteinde van de injectienaald. Verdrijving van de injectieoplossing in de injectienaald. Steek de naald in de injectiebehuizing en draai aan, zodat de naald goed en stevig in de behuizing wordt gestoken.

Steek vervolgens voorzichtig de injectiebehuizing in de micromanipulator, voorzichtig om niet te breken of gewond te raken door de naald. Terwijl het bekijken van zowel de eieren als de naald door de microscoop, beweegt u de naald dichtbij X in de hoogste linkerhoek van het schotelrooster. Laat de naald zakken totdat de punt de HBS plus penicilline streptomycine gebufferde oplossing in de schotel binnenkomt.

Centreer de naald in het gezichtsveld en beweeg de eierschaal, zodat de naald is een paar millimeter dichter bij de rand van de schotel dan de eieren. Stel hierna de microscoop op het filter dat geschikt is voor Rhodamine om de fluorescentie in de naald te observeren en zich te concentreren op de punt. Draai op de microinjector langzaam de balansknop met de klok mee totdat de injectieoplossing uit de naald in de suspensieoplossing begint te lekken.

Draai vervolgens de knop tegen de klok in iets totdat de kleurstof gewoon stopt met lekken uit de naald. Met de naald nog gecentreerd in het gezichtsveld, verplaats de schotel zodat de naald wordt gericht op het ei dat eerst moet worden geïnjecteerd. Pas de vergroting aan op ongeveer 50x, zodat een enkel ei het grootste deel van het gezichtsveld vult.

Gebruik zowel de micromanipulator als de hand op de eierschaal om de naald in positie te brengen voor de injectie. Gebruik de micromanipulator om de naald vooruit te helpen en steek de punt in het eerste te injecteren ei, om de naald op 20 tot 30% van de eilengte van het achterste uiteinde van het ei loodrecht op de lange as van het ei te steken. Injecteer de oplossing met het injectievoetpedaal of de injectieknop op de microinjector.

Een kleine bolus van fluorescerend materiaal in het ei zal wijzen op een succesvolle injectie. Trek hierna de naald uit het ei. Als het ei onbedoeld bij het intrekken van de naald uit zijn put wordt getild, gebruikt u kleine tangen om het ei terug in de put te duwen terwijl u de naald intrekt.

In deze studie worden krekeleieren geïnjecteerd met behulp van een techniek die dient als een fundamentele methode in vele experimenten, waaronder maar niet beperkt tot, RNA interferentie en genomische manipulatie. De overlevingskans is een belangrijke parameter voor het beoordelen van het succes van dit experiment. De meeste dode eieren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door het zicht als de dooier en embryonale weefsel in het ei beginnen te klonteren ongelijk, en uiteindelijk het grootste deel van de dooier zal migreren naar een kant van het ei.

Wanneer beoordeeld na vier tot zes dagen, meer dan 85% van de niet-geïnjecteerde eieren overleefd, terwijl eieren geïnjecteerd met experimentele reagentia over het algemeen had een lagere overlevingskans. Controle voor alle aspecten van de injectie zelf, met inbegrip van de naaldpunctie, de introductie van kleurstof en buffer, of de aanwezigheid van voertuig of dubbelstrengs RNA, is vereist om de ware effecten van de experimentele manipulatie geprobeerd te begrijpen. De manier waarop men beoordeelt de fenotypische resultaten van de injectie hangt af van wat werd geïnjecteerd.

Bijvoorbeeld, fenotypische veranderingen als gevolg van specifieke mRNA knockdowns kan duidelijk zijn op het bruto anatomie niveau. Als aan de andere kant een cDNA codering van een EGFP gelabeld histone 2B gen onder de controle van een G.bimaculatus actin promotor wordt ingevoegd in de cricket genoom met behulp van piggyback transposase, wordt het mogelijk om elke kern in het ei te visualiseren met behulp van fluorescentie om de EGFP tagged hist 2B eiwit te prikkelen. Het aanpassen van de balans zodat de naalden niet verstoppen is een kritieke stap in deze procedure.

Het kan nodig zijn om verschillende aanpassingen te maken na de daaropvolgende injecties, omdat dooier soms klompen de naald tip. De krekel is een hemimetabolous insect dat basaal takken tot goed bestudeerde holometabolous insecten zoals Drosophila. Het bestuderen van cricket ontwikkeling zal ons helpen meer te begrijpen over evolutie en ontwikkeling in het dierenrijk.

Deze techniek vergt enige oefening. We raden aan controle-injecties te oefenen tot de overlevingskans vier of vijf dagen na de injectie ten minste 80% is