Name: Het injecteren van gryllus krekel eieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Leer een injectietechniek voor krekeleieren om embryonale en larvale ontwikkeling te bestuderen. Deze methode ondersteunt RNA-interferentie en genomische manipulatie in neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek dat in dit project werd gerapporteerd, werd gesteund door een institutionele ontwikkelings prijs (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Grant Number P20GM10342 to HH3, en door NSF Award nummer IOS-1257217 aan Cge.

1. hardware instellen en voorbereiden van materialen
Opmerking: Zie tabel 1 en tabel met materialen voor de bereiding van oplossingen, reagens en apparatuurgegevens.
<ol><li>Stel een ontleed Microscoop in om eieren te zien en de injectienaald te geleideren. (Figuur 1a toont een ontleed Microscoop uitgerust met fluorescentie.) Fluorescentie vermogen is voordelig maar niet noodzakelijk.</li>
	<li>Plaats een 3-assige micro manipulator om de injectienaald op zijn plaats te manoeuvreren (Figuur 1a).</li>
	<li>Stel een micro injector met slang en een naald houder in om kleine hoeveelheden materiaal te injecteren (Figuur 1a). Gebruik desgewenst een voetpedaal dat niet in de afbeelding wordt weergegeven.</li>
	<li>Ontwerp en maak een stempel om putten te maken voor eieren (figuur 1c) door de inverse van het gewenste patroon af te drukken, hetzij met een 3D-printer of een laser graveur. Opmerking: De getoonde 3D gedrukte voorbeeld stempel is 4,5 cm x 5 cm met 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm uitsteeksels voor het maken van individuele putten. Meer informatie over het maken van een verscheidenheid aan aanpasbare mallen zijn elders gepubliceerd16.</li>
	<li>Bereid 10x injectie buffer, HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS), en een Stock Solution van Tetramethylrhodamine dextran kleurstof en bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid experimentele oplossingen voor die geïnjecteerd moeten worden, zoals dsRNA, crispr/Cas912, transposeer bare elementen, in vitro afgetopte mRNA7,8, farmacologische agentia17, zfns of Talens9.</li>
	<li>Plaats plakband op meerdere lagen standaard labtape op een glazen Microscoop glijbaan om een perron van 1 mm of meer boven de glazen glijbaan te maken, die gebruikt zal worden voor het vasthouden van naalden voor de beoordeling.</li>
	<li>Bereid een cricket container van ongeveer 40 cm x 60 cm in grootte met een deksel met een mesh-bedekte opening voor luchtcirculatie.</li>
	<li>Voeg voedsel, water en opvang materialen toe.</li>
	<li>Voeg enkele tientallen gezonde mannelijke en vrouwelijke volwassen krekels. Identificeer volwassen cricket door de aanwezigheid van vleugels. Opmerking: Een bereik van post-imaginale leeftijden kan de Eier opbrengsten verhogen. De dichtheid van krekels moet relatief hoog zijn om voldoende eieren te kunnen verzamelen voor een experiment, maar niet zo druk dat kannibalisme voorkomt. Bijvoorbeeld, ongeveer twee dozijn gezonde krekels, met een ruwweg gelijke mannelijke/vrouwelijke verhouding, in een container van de hierboven genoemde grootte moet voldoende zijn om over te verzamelen 200 eieren in een één tot twee h periode. Krekels kunnen op kamertemperatuur worden gehouden, maar ontwikkeling en gedrag zal optimaal zijn als krekels worden gehandhaafd in een warme (23.5 – 26 °C), vochtige (40-60% relatieve vochtigheid) incubator.</li>
</ol>2. naalden voor injectie maken
<ol><li>Gebruik borosilicaatglas capillairen met gloeidraad (Zie de tabel met materialen voor de details van de maat). Bereid de pull naalden op dezelfde dag, of tot een paar dagen voordat de injecties zijn voltooid.</li>
	<li>Plaats een capillair glas in de puller, midden het glas op de gloeidraad en draai de knoppen vast om het glas op zijn plaats te zetten.</li>
	<li>Stel de temperatuur van de trekker in de buurt van de glazen helling temperatuur (-5 °c tot + 10 °c).</li>
	<li>Gebruik een één-stap, hoog-warmte protocol om een lange taper met een kleine opening te trekken, maar vermijd het smelten van de uiteinden gesloten. Opmerking: Als u bijvoorbeeld de pipet-trekker gebruikt die gedetailleerd is in de tabel met materialen die zijn uitgerust met een doos gloeidraad, gebruikt u de volgende parameters voor glas met een helling temperatuur van 478: Heat 478; Pull 45; Vel 75; Del 120. De optimale omstandigheden voor het vervaardigen van een naald met de in Figuur 2b getoonde vorm moeten door elke gebruiker empirisch worden bepaald.</li>
	<li>Schuine naald tips ter voorbereiding van de injecties.</li>
	<li>Bevochtig het vlak van de draaiende molen van de beveler (Figuur 2a) met druipend water. Gebruik ofwel omgekeerde osmose (RO) of diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld gedistilleerd water.</li>
	<li>Plaats de getrokken naald in de beveler en draai naar een hoek van 20 °.</li>
	<li>Verlaag de naald totdat deze het slijp vlak en de schuine kant 2 tot 3 minuten aanraakt.</li>
	<li>Beoordeel de schuine kant door de afgeschuinde naald op een dubbele kleefband te plaatsen die is vastgehouden aan een glazen Microscoop-dia.</li>
	<li>Plaats de schuif die de naald vasthoudt op het podium van een samengestelde microscoop die is uitgerust met een camera-en beeldverwervings software.</li>
	<li>Verkrijg een afbeelding van de naaldpunt met behulp van een 20x-doelstelling.</li>
	<li>Gebruik de imaging software om de inwendige lumen diameter van de naald net proximale te meten met de afgeschuurd opening (figuur 2c). De optimale grootte is 10 μm + 2 μm.</li>
	<li>Gooi naalden met een opening onder 8 μm en boven 12 μm weg.</li>
	<li>Bewaar de naalden in een bakje met een deksel om te voorkomen dat ze stoffig worden. Gebruik een strook wax of soortgelijk materiaal om de naalden van de bodem van de container te verheffen om te voorkomen dat de uiteinden worden gebroken (figuur 2D).</li>
</ol>3. inzameling en bereiding van eieren
<ol><li>Maximaliseer het aantal eieren dat wordt gelegd door krekels van een vochtig legmateriaal (waterflesjes, eiergerechten) 's nachts of gedurende ten minste 8 – 10 uur te ontnemen voordat u eieren probeert te verzamelen. Opmerking: Aangezien vrouwtjes de mogelijkheid hebben om inwendig sperma op te slaan, kan een anders getimede procedure nodig zijn als zorgvuldig getimede bemesting experimenteel essentieel is18.</li>
	<li>Maak 40 mL van 1% agarose in water en giet in een 10 cm petrischaaltje.</li>
	<li>Plaats een ei-goed stempel op het oppervlak van de agarose voordat het stolt.</li>
	<li>Verwijder de stempel, zodra de agarose is gestijgd, om de putjes te onthullen (figuur 1c).</li>
	<li>Vul de agarose-goed plaat met HBS met 1% Penicillaire/streptomycine.</li>
	<li>Plaats de deksel op de schaal, wikkel in Parafilm en bewaar bij 4 °C. Opmerking: Gerechten kunnen een paar dagen worden bewaard bij 4 °C, maar moeten vóór gebruik worden opgewarmd tot kamertemperatuur om condensatie te voorkomen.</li>
	<li>Maak een ei-collectie schotel voor krekels om eieren te leggen door het vullen van een 35 mm petrischaaltje met witte Speeltuin zand (Figuur 1b). Opmerking: Het in de inhoudstafel gespecificeerde zand is van de juiste korrelgrootte. Als de zandkorrels te groot zijn, zal het zand de eieren beschadigen.</li>
	<li>Bedek de eierschaal met een vierkant van een papieren handdoek die ongeveer 18 cm x 18 cm is en plaats op de bovenkant van het gerecht met zand. Door deze papieren handdoek Bedek je het gevulde gerecht met kraanwater.</li>
	<li>Kantel de petrischaal en Knijp zachtjes in de top om overtollig water te verwijderen.</li>
	<li>Plooi de hoeken van het papieren handdoekenrek onder de schaal en plaats de eierschaal in het omgekeerde deksel, waardoor de papieren handdoek afdekking op zijn plaats blijft.</li>
	<li>Plaats de eierschaal in de kreeften emmer en laat de volwassen vrouwtjes eieren voor een tot twee uur oviposit. Opmerking: De relatief korte tijd hier zorgt ervoor dat alle eieren vergelijkbaar in het stadium van ontwikkeling op het moment van de injectie zal zijn. Als injectie voordat cellularisatie belangrijk is, injecties moeten plaatsvinden binnen 14 h van ei leggen19.</li>
	<li>Ondertussen, laat de agarose schotel (vanaf stap 3,6) te verwarmen tot de kamertemperatuur ter voorbereiding op het houden van eieren voor injectie.</li>
	<li>Verwijder de eiopvangschaal, die nu vers gelegde eieren bevat, uit de krekel emmer, en verwijder het deksel van de papieren handdoek. Plaats een zeef met een poriegrootte van 0,5 – 1 mm in een bekerglas met een inhoud van ten minste 500 mL (Figuur 1b).</li>
	<li>Spoel de inhoud van de eierschaal (zand en eieren) in de zeef onder zacht stromend kraanwater en laat de zandkorrels door het zeefgaas in het water in het bekerglas vallen, maar verlaat de cricket eitjes in de zeef korf.</li>
	<li>Vul een bakje met RO water en plaats het in een bakje. Keer de zeef over de container en tik erop tegen het gerecht om de eitjes in het water te Verdoe- De eieren zinken naar de bodem van de container.</li>
	<li>Snijd de tip van een P1000 pipetpunt met een schaar om een opening van ongeveer 3 mm in diameter te maken. Plaats deze tip op een P1000 pipet en gebruik deze om de eieren van de container over te brengen naar de agarose Eier schimmel schaal, die zo weinig mogelijk water overbrengt.</li>
	<li>Gebruik plastic pincet om eieren op te maken in agarose Wells gevuld met HBS plus 1% penicilline/streptomycine. Elk ei zal zinken naar de bodem van een individu goed. Dek af met de Petri schaaldeksel tot u klaar bent om te injecteren.</li>
</ol>4. bereid de micro injector voor
<ol><li>Bevestig de micro injector aan een perslucht of gasbron (dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van perslucht of N2). Opmerking: Als u een draagbare luchttank gebruikt, vult u deze in ten minste 75 psi. De tank zal de luchtdruk tijdens de injecties verliezen en moet mogelijk worden aangevuld; injecties worden moeilijk onder 40psi.</li>
	<li>Zet de micro injector aan. Stel de injectie tijd in op 0,17 s en druk tot 10 – 15 psi. Opmerking: De precieze druk die nodig is, hangt af van de opening van de naald en moet empirisch worden bepaald voor elke injectie ronde en/of nieuwe naald die wordt gebruikt.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de balans knop van de micro injector op 0 wordt gedraaid (doorgaans volledig linksom) en dat de micro injector onder druk staat en in de injectie modus.</li>
</ol>5. injecties
<ol><li>Filtreer ongeveer 500 μL 10x injectie buffer met een 1 mL spuit en een spuit filter van 0,45 μm.</li>
	<li>Meng injectie reagentia (de details die volgen zijn voor de injectie van dsRNA bereid zoals beschreven in12). Opmerking: Het kan raadzaam zijn om verschillende besturingselementen te ontwerpen en uit te voeren, vooral wanneer men deze techniek voor het eerst leert. Poking eieren zonder te injecteren, injecteren buffer + kleurstof alleen, of injecteren buffer + Dye + een controle reagens (zoals eGFP dsRNA) zijn allemaal goede testen van hoe storend verschillende elementen van het injectie protocol zou kunnen zijn. Zie Figuur 3 voor de overlevingskansen van een aantal verschillende besturingselementen.</li>
	<li>Beginnen met een 4 mL dsRNA aliquot.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL van de gefilterde 10x injectie buffer toe aan het dsRNA aliquot.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL 50 mg/mL tetramethyl Rhodamine dextran kleurstof voorraadoplossing toe. Gebruik in plaats daarvan fenolrood als u werkt aan een ontleed bereik zonder fluorescentie.</li>
	<li>Bewaar alle materialen op ijs voor de duur van de injectie periode.</li>
	<li>Laad de injectie oplossing in een injectienaald met 20 mL laad tips en een P10 pipet.</li>
	<li>Trek een injectie oplossing van 1,5 mL op en steek de laadpunt in het brede uiteinde van de injectienaald.</li>
	<li>Werp de oplossing zo ver mogelijk naar beneden in de naald en Elimineer luchtbellen door zachtjes te flikken; Let op dat u de naald niet breekt.</li>
	<li>Plaats het Gerecht van eieren onder de ontsnij Microscoop en selecteer een lage vergroting van ongeveer 10x (1x vergroting bekeken door 10x oogdoelstellingen).</li>
	<li>Steek de naald in de injectie behuizing en draai deze vast. Opmerking: Zorg dat de naald goed en stevig in de behuizing is gestoken. Om dit te doen, trek het brede uiteinde van de naald terug uit de metalen behuizing, het brengen van de Silicon tubing in de behuizing met het. Stel de silicium slang zo in dat het glas uiteinde van de naald net buiten het silicium uitsteekt. Als dit niet gebeurt, kan de Siliconen slang worden geknepen tussen het glas en de metalen behuizing, waarbij het uiteinde van de naald wordt geblokkeerd.</li>
	<li>Plaats voorzichtig de injectie behuizing met een bijgevoegde naald in de micro manipulator. Wees u bewust van het scherpe uiteinde van de naald en wees voorzichtig dat het niet in de oppervlakken wordt geraakt en gebroken.</li>
	<li>Terwijl het kijken naar zowel de eieren en de naald door de Microscoop, verplaats de naald in de buurt van de eieren in de linkerbovenhoek van het rooster van de schotel.</li>
	<li>Verlaag de naald totdat de tip de HBS plus 1% Penicilinein/streptomycine gebufferde oplossing in de schaal invoert.</li>
	<li>Plaats de naald in het gezichtsveld en verplaats de eierschaal zodat de naald zich een paar mm dichter bij de rand van het schaaltje bevindt dan de eieren.</li>
	<li>De weergave van het rooster van eieren met de naald niet belemmeren.</li>
	<li>Stel de Microscoop in op het filter dat geschikt is voor Rhodamine, dus het is mogelijk om de fluorescentie in de naald te observeren en zich te concentreren op de punt van de naald.</li>
	<li>Draai de balans knop op de micro injector langzaam rechtsom totdat de injectie oplossing uit de naald in de suspensie begint te lekken. Het balans nummer op het scherm van de micro injector zal beginnen te stijgen, hoewel de numerieke waarde niet belangrijk is. Draai de knop vervolgens weer tegen de klok in, net totdat de kleurstof uit de naald lekt. Opmerking: Het is essentieel om dit evenwicht te stellen telkens wanneer een nieuwe naald wordt gebruikt. Zonder dat de balans op de juiste wijze is ingesteld, zal de micro injector gedurende enige tijd blijven injecteren nadat de injectie is geactiveerd. Het is zelfs mogelijk dat een enkele druk op de injectieknop met een onevenwichtige naald zal resulteren in de uitzetting van de gehele inhoud van de geladen naald.</li>
	<li>Met de naald gecentreerd in het gezichtsveld, verplaats de eierschaal zodat de naald gericht is op het ei dat eerst moet worden geïnjecteerd. Het wordt aanbevolen dat injecties beginnen in een hoek van het rooster van gearrangeerde eieren, bijvoorbeeld, de linker bovenhoek.</li>
	<li>Stel de vergroting in op ongeveer 50x; bij deze vergroting zal één ei het grootste deel van het gezichtsveld vullen.</li>
	<li>Gebruik zowel de micromanipulator als de hand op de eierschaal om de naald in positie te brengen voor de injectie.</li>
	<li>Breng de naald met behulp van de micromanipulator en steek de punt van de naald in het eerste ei dat moet worden geïnjecteerd.</li>
	<li>Steek de naald met een lengte van 20 – 30% van het achterste (blunter) uiteinde van de Egg (Figuur 1e), loodrecht op de lange as van de Egg.</li>
	<li>Injecteer de oplossing ofwel met de injectie voetpedaal of de injectieknop op de micro injector. Een kleine bolus van fluorescerende stof in de Egg geeft een geslaagde injectie aan (figuur 1d). Opmerking: Het is niet ongewoon dat sommige dooier tijdens de injectie uit de Egg worden uitgeworpen (Figuur 1f), en dit geeft niet noodzakelijkerwijs aan dat het geïnjecteerde ei niet levensvatbaar is.</li>
	<li>Trek de naald uit de Egg. Als het ei onbedoeld uit zijn goed wordt getild bij het terugtrekken van de naald, gebruik dan kleine tang om het ei terug in zijn put te duwen terwijl de naald wordt teruggetrokken.</li>
	<li>Als de naald verstopt tijdens de injectie, verwijder de naald uit de Egg en, houd de naald ondergedompeld in de HBS plus 1% Penicillaire/streptomycine oplossing die de eieren bedekt, Wis de verstopte naald met behulp van de Clear -functie of door de injectie te duwen Knop.</li>
	<li>Als u dezelfde naald blijft gebruiken, herhaalt u de injectieprocedure voor zo veel mogelijk eieren. In eerste, dit kan slechts ongeveer 20 of 30 eieren, maar zal toenemen tot meer dan 100 met de praktijk.</li>
	<li>Als de naald verstopt raakt en niet kan worden gewist, gooi de naald dan weg, vul een nieuwe naald en begin opnieuw (d.w.z., keer terug naar stap 5,7).</li>
	<li>Bewaar de schaal van de ingespoten eieren in een warme incubator (23,5 – 26 °C) die licht vochtig is (om de verdamping te minimaliseren) totdat de embryo's de gewenste ontwikkelingsfase voor de analyse hebben bereikt.</li>
	<li>Ten minste elke 24 uur, eieren verwijderen die niet langer levensvatbaar zijn (Figuur 3a, B) en de suspensie oplossing vervangen door verse HBS plus 1% Penicileen/streptomycine.</li>
	<li>Twee tot drie dagen na de injectie, breng de eieren door voorzichtig pipetteren of met een plastic Tang naar papieren handdoeken bevochtigd met HBS plus 1% Penicillaire/streptomycine in een hard plastic petrischaaltje om de ontwikkeling in de warme, vochtige incubator voort te zetten.</li>
	<li>De eieren controleren en eieren verwijderen die elke dag niet meer levensvatbaar zijn (Figuur 3a, B).</li>
</ol>

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De twee belangrijkste uitdagingen met deze techniek zijn de gerelateerde kwesties van optimale naald grootte en overlevingskansen. Hoewel kleinere naalden overlevingskansen verbeteren, hebben naalden met smallere lumen een grotere mate van capillaire krachten op het werk, wat het waarschijnlijker maakt dat dooier in de naald zal bewegen waardoor het verstopt is. In het beste geval kunnen blokkades eenvoudig worden gewist door een ander ei te injecteren of door de naald te verwijderen zoals hierboven beschreven. Men kan o...

Het vermogen om het genoom te wijzigen of de genexpressie in organismen te beïnvloeden is de basis voor het ontwerp van vele soorten experimenten die functionele causaliteit testen. Het is ook van cruciaal belang voor het vergelijkende en evolutionair relevante werk dat genomische en niet-genomische wijzigings technieken beschikbaar zijn in organismen buiten traditionele genetische laboratorium systemen voor diermodellen (bijv. Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis elegans). Of het nu gaat om het verlangen om de organisatorische diversiteit1 of iemands naleving van het principe van Krogh te begrijpen, dat er voor elke biologische vraag een organisme is dat het meest geschikt is voor zijn oplossing2,3, de mogelijkheid om genomen te wijzigen of invloed van de genexpressie is essentieel voor moderne experimentele ontwerpen.
De cricket gryllus krekel is een opkomend modelsysteem. Gebruikt voor de vorige eeuw in neuroethologie experimenten4, de laatste twee decennia zijn getuige geweest van een toegenomen experimentele interesse in de cricket, met name gericht op de evolutie en ontwikkeling van dit organisme5. De Cricket is een hemimetabolous insect dat basaal vertakt tot goed bestudeerde holometaboleuze insecten, zoals D. melanogaster en Tribolium castaneum6. Door zijn nuttige positie op de evolutionaire boom, zijn wetenschappers geïnteresseerd in het vragen van moderne, verfijnde experimentele vragen in dit insect, dat heeft geleid tot een groeiende interesse in het aanpassen van moleculaire gereedschappen voor het gebruik in G. krekel.
Injecties van moleculaire reagentia in Cricket eieren kunnen worden gebruikt voor genomische modificatie-experimenten en niet-genomische manipulaties van genexpressie in embryo's. Transgene G. krekel met EGFP-inserties is bijvoorbeeld gemaakt met behulp van de transposase piggybac7,8. Onderzoekers hebben met succes Knockout G. krekel gemaakt met behulp van zink-vinger nucleasen (zfns) en transcriptie Activator-achtige (tal) Effector nucleasen (Talens) om dubbel-gestrande pauzes in specifieke genomische regio's te introduceren9. Hoewel ZFNs en TALENs locatiespecifieke targeting mogelijk maken bij dieren buiten de grote vier modelsystemen, zijn deze reagentia snel overtroffen door het CRISPR/Cas9-systeem, dat eenvoudiger te gebruiken, efficiënter en zeer flexibel is10. Crispr is gebruikt in G. krekel voor de productie van Knock-out 11 evenals knock-in lijnen12,13 naast de genomische modificatie, kan dsRNA in eieren worden geïnjecteerd om mRNA-expressie op te nemen in het ontwikkelen embryo's, waardoor onderzoekers de rol van specifieke transcripten in de ontwikkeling14,15kunnen begrijpen. Enkele beperkte Details over het injecteren van Cricket eieren zijn eerder gepubliceerd12.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het injecteren van vroege G. krekel -eieren. Dit protocol is effectief en gemakkelijk aanpasbaar aan verschillende laboratorium instellingen, injectiematerialen en mogelijk aan andere insecten. Hoewel aanvullende Details voor het ontwerpen en implementeren van genomische modificatie en knockdown-experimenten elders zijn gepubliceerd12,13, zullen deze benaderingen uiteindelijk afhankelijk zijn van het injectie protocol dat hier wordt beschreven.

<table><tbody><tr><td>Fluorescent dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Stereomicroscoop met fluorescentie</td></tr><tr><td>External light source for fluorescence</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>-Toebehoren kunnen omvatten Injection Needles Holder, Input Hose (met een slangkoppeling), AC-voedingskabel, voetschakelaar, siliconenrubber afdichting-</td></tr><tr><td>mCherry filter cube</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>Filter cube voor mCherry of soortgelijke rode kleurstof zal werken</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>Gebruikt met Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Holder (Needle holder)</td><td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>Tubing to connect air source to microinjector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Egg well stamp</td><td>3D printed</td><td>custom</td><td>3D geprint op een Lulzbot Taz 5 met behulp van Poly Lactic Acid thermoplastic</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator or temperature controlled room</td><td>various</td><td></td><td>Temperatures van 23,5-26 &deg;C zijn nodig.</td></tr><tr><td>Cricket food</td><td>various</td><td></td><td>katvoer of visvlokken zijn geschikt voedsel. </td></tr><tr><td>Cricket water</td><td>vairous</td><td></td><td>Water kan in flesjes worden bewaard en aan krekels worden gegeven via wattenbolletjes</td></tr><tr><td>Cricket shelter</td><td>arious</td><td></td><td>Behuizingsmaterialen kunnen kreukvrij papieren handdoeken of eierdozen zijn</td></tr><tr><td>Glass capillary tubes</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Item no. 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm lengte, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, met filament</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Flaming/Brown</td><td>Model P-97</td><td>Gedistribueerd door Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Beveller/Micro grinder</td><td>Narishige</td><td>Model EG-45/EG-400</td><td>EG-400 omvat een microscoopkop</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>CellTreat</td><td>Product code 229693</td><td>90 mm diameter</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Witte speelzand</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB000972</td><td>Agarose GPG/LE ultrapure</td></tr><tr><td>Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers</td><td>US Kitchen Supply</td><td>Model SS-C123</td><td>Poriegrootte moet tussen 0,5 - 1,0 mm zijn</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td>Pen Strep</td></tr><tr><td>Plastic tweezers</td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Zwart Static Dissipative, 118 mm</td></tr><tr><td>Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 &micro;m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>Gebruik met 1 mL spuit</td></tr><tr><td>1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Gebruik met spuitfilter om Injection Buffer te filteren, Luer-Lok tip spuiten zouden ook werken</td></tr><tr><td>Air tank (optioneel)</td><td>Midwest Products</td><td>Air Works&reg;</td><td>Draagbare luchttank</td></tr><tr><td>Rhodamine dye</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,</td></tr><tr><td>20 mL loading tips</td><td>Eppendorf</td><td>Order no. 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu;L Microloader</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20x objective</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; software</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>Versie 4.6.2 gebruikt hier</td></tr></tbody></table>

het injecteren van gryllus krekel eieren

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Het veranderen van de genfunctie in een zich ontwikkelende organisme staat centraal in verschillende soorten experimenten. Terwijl enorm krachtige genetische hulpmiddelen zijn ontwikkeld in traditionele modelsystemen, is het moeilijk om genen of boodschapper RNA (mRNA) in de meeste andere organismen te manipuleren. Tegelijkertijd zijn evolutionaire en vergelijkende benaderingen gebaseerd op een verkenning van de genfunctie in veel verschillende soorten, waardoor de ontwikkeling en aanpassing van technieken voor het manipuleren van expressie buiten de huidige genetisch Tractable Soort(en). Dit protocol beschrijft een methode voor het injecteren van reagentia in Cricket-eieren om de effecten van een bepaalde manipulatie op embryonale of larvale ontwikkeling te testen. Instructies voor het verzamelen en injecteren van eieren met afgeschuurd naalden worden beschreven. Deze relatief ongecompliceerde techniek is flexibel en mogelijk aanpasbaar aan andere insecten. Men kan verzamelen en injecteren van tientallen eieren in een enkel experiment, en de overlevingskansen voor buffer-only injecties verbeteren met de praktijk en kan zo hoog zijn als 80%. Deze techniek zal verschillende soorten experimentele benaderingen ondersteunen, waaronder injectie van farmacologische agentia, in vitro afgetopte mRNA om genen van belang te uiten, dubbel-streng RNA (dsRNA) om RNA-interferentie te bereiken, het gebruik van geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) in overleg met CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) reagentia voor genomische modificatie, en transposeer bare elementen om voorbijgaande of stabiele transgene lijnen te genereren.

Krekels leggen gemakkelijk eieren in het vochtige materiaal en zorgen voor voldoende materiaal, zoals vochtig zand of vuil, om een groot aantal eieren te leggen. Dit is vooral effectief als krekels voor het eerst worden beroofd van eierlegmateriaal voor 8 – 10 h. eieren die in schoon zand worden gelegd, kunnen gemakkelijk worden gescheiden, opgevangen (Figuur 1b) en in op maat ontworpen Eier putten voor injectie worden geplaatst (figuur 1...

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Deze techniek dient als een fundamentele methode voor experimenten ontworpen om de embryonale of larve ontwikkeling van de krekel te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het flexibel is en verschillende soorten experimentele benaderingen zal ondersteunen, zoals die met behulp van RNA-interferentie of genomische manipulatie. Het aantonen van de procedure zal Hadley Wilson Horch zijn, de hoofdonderzoeker in het laboratorium.Om te beginnen deze procedure nat de draaiende molen vlak van de schuine kant met druipend water. Plaats de getrokken naald in de schuine kant en draai deze in een hoek van 20 graden. Laat de naald zakken tot hij de slijpplaat aanraakt en twee tot drie minuten afschuift.Beoordeel de schuine kant door het plaatsen van de schuine naald op dubbele plak tape die is gehecht aan een glazen microscoop dia. Plaats de dia op het podium van een samengestelde microscoop uitgerust met een camera en beeldacquisitiesoftware. Verkrijg een afbeelding van de naald met behulp van een 20x doelstelling.Gebruik de beeldsoftware om de binnendiameter van de naald te meten, net proximaal tot de afgeschuinde opening. Gooi naalden weg met een opening kleiner dan acht

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Schistosoma mansoni eieren zijn krachtige stimulatoren van de T-helper type 2 (Th2) immuunrespons, kenmerk van parasitaire infecties, astma en allergische ontsteking. Dit protocol maakt gebruik van S. mansoni ei injectie om een CD4 Th2 cytokine-geïnduceerde ontstekingsreactie in de long, gekenmerkt door long granuloomvorming rond het ei, eosinofilie en macrofaag alternatieve activatie te genereren.

Het gebruik van eieren van<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als een<em&gt; In vivo</em&gt; Model van Helminth veroorzaakte longontsteking

De hier beschreven methode maakt gebruik van directe injectie van entomopathogene bacteriën in de hemocoel...

Opfok en Injectie van<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven naar bacteriële virulentie beoordelen

Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.

High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel schetst basismethoden om belangrijke factoren zoals dichtheid, voerbeschikbaarheid, hydratatiebron en omgevingscontroles te standaardiseren voor het langdurig kweken van laboratoriumculturen van de eetbare krekel, Gryllus bimaculatus.

Het onderhouden van laboratoriumculturen van Gryllus bimaculatus, een veelzijdig orthopteraanmodel voor insectenlandbouw en ongewervelde fysiologie

Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van tekenembryo's. Embryo-injectie is de voorkeurstechniek voor genetische manipulatie om transgene lijnen te genereren.

Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis

Leer een injectietechniek voor krekeleieren om embryonale en larvale ontwikkeling te bestuderen. Deze methode ondersteunt RNA-interferentie en genomische manipulatie in neurobiologisch onderzoek.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Meer video's verkennen