Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Ons protocol beschrijft methoden voor efficiënte expressie en zuivering van FAH domein met eiwitten, maar ook eiwitten in het algemeen. FHD protein-1 speelt een regulerende rol in de TCA-cyclus en het energiemetabolisme van mitochondriën. We waren in staat om FHD-1 downregulatie te koppelen aan cellulaire senescentie en informatie over enzymactiviteit en eiwitstructuur zijn over het algemeen nodig om moleculaire mechanismen achter waargenomen fenotypen te begrijpen.

Het belangrijkste voordeel van het uitdrukken van eiwitten via IPTG inducible vectorsystemen is dat alle methoden relatief goedkoop en gemakkelijk te vestigen zijn in elk laboratorium. Door het gebruik van poly-histidine type eiwitten in combinatie met nikkel NTA agarose harsen, de immense selectiviteit van affiniteit chromatografie kan worden gebruikt tegen lage kosten. Voor de meeste doeleinden kan eiwit verkregen op deze kwaliteit al voldoende zijn.

FPLC aan de andere handen, is een gevestigde en algemene methode met verschillende voordelen in vergelijking met andere methoden. Voeg eerst vijf tot 10 nanogram plasmide in 100 microliter van competente BL21-DE3 pLysS E.coli bacteriën op ijs. Tik iets op de buis om de inhoud te mengen.

Houd de bacteriën op ijs voor 30 minuten, zachtjes tikken op de buis om de paar minuten. Verwarm een thermoshaker tot 42 graden celsius. Plaats de buis met de bacteriën in het apparaat en verwarm gedurende 90 seconden.

Plaats de buis vervolgens onmiddellijk op ijs. Voeg na vijf tot tien minuten op ijs 600 microliters van NZCYM-medium toe en plaats de buis in een bacteriënbrocator. Schud de buis bij gemiddelde snelheid gericht langs de schudden richting op 37 graden Celsius voor een uur.

Na incubatie, plaat 200 microliters van de bacteriële cultuur op een 10 centimeter LB agar plaat met de selectie antibiotica van keuze. Kweek de bacteriën op de LB agar plaat in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius 's nachts. Na succesvolle kolonievorming, kies een enkele kolonie en verspreid het in vijf milliliter NZCYM met de geselecteerde antibiotica.

Cultuur in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius 's nachts. Na succesvolle bacteriële groei, versterken van de bacteriën in 250 milliliter, 500 milliliter of een liter partijen medium, afhankelijk van de vraag naar eiwit hoeveelheid. Dan, cultuur van de bacteriën, in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius voor twee tot drie uur.

Teken na incubatie een monster voor fotometrische analyse. Als de optische dichtheid op 600 nanometer 0,4 heeft bereikt, moet u 200 micromolar toepassen tot één millimolar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid. Na drie tot vijf uur meer in de bacteriën incubator op 37 graden Celsius eiwit expressie is uitgeput.

Oogst de bacteriële pellet via centrifugatie op 5.000 keer G gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en bevries de pellet bij min 20 graden Celsius voor korte opslag. Voor elke 250 milliliter originele bacteriële suspensie, breng vijf milliliter van de geselecteerde buffer aan op de bacteriële pellet.

Voeg 10 microliter bèta-mercaptoethanol per vijf milliliter toegepaste buffer toe. Gebruik een Pasteur pipet van 10 milliliter om de pellet mechanisch in ophanging te dwingen door krassen en pipetten. Breng alle ophanging over naar een buis van 50 milliliter.

Dan sonicate de schorsing. Vervolgens centrifuge gedurende 30 minuten op hoge snelheid bij vier graden Celsius. Filter de supernatant achtereenvolgens met filterunits op ijs.

Bereid een lege plastic of glazen kolom door het te bevestigen aan een stabiele retainer en wassen met nikkel NTA lopende buffer. Voor elke 10 milliliter eiwit suspensie van toepassing 500 microliter nikkel NTA agarose drijfmest op de kolom. Vul de kolom volledig met nikkel NTA lopende buffer ervoor te zorgen niet te verstoren de agarose hars en laat de buffer te lopen door de zwaartekracht.

Breng vervolgens de eiwitsuspensie aan op de kolom en laat het monster door de zwaartekracht lopen. Nadat het monster is doorgegeven, vul de kolom met nikkel NTA lopende buffer. Plaats een UV transparante cuvette onder de kolom en verzamel een milliliter nikkel NTA elutie buffer.

Controleer de optische dichtheid van het monster op 280 nanometer ten opzichte van een blanco monster. Optimaal geeft het monster een optische dichtheid van meer dan 2,5 weer. Aangezien FAHD-eiwitten en nikkel NTA elutiebuffer neerslaan bij het bevriezen en ontdooien, dialyseert het eiwit tegen een andere buffer 's nachts op ijs met behulp van een microliter DTT per 100 milliliter dialysebuffer.

Stel een FPLC-systeem in en was de kolom met vijf kolomvolumes van 20% ethanol, gevolgd door vijf kolomvolumes water. Nadat u de kolom in evenwicht hebt gebracht, past u het dialyseerde monster toe op de kolom en verzamelt u de stroom door. Stel een verloopeution in.

Nadat het verloop is voltooid, wordt u uitgevoerd met een hoge zoutbuffer totdat er geen pieken meer worden gedetecteerd over het bereik van één kolomvolume. Start een micro-plaatlezer en equilibrate gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius. Bereid een milliliter van een 20 millimolar oplossing van een substraat te worden getest in enzym test buffer.

Volgens het pipettingschema in het tekstprotocol, bereid het enzym leeg en monster putten door pipet 90 microliters van enzym test buffer in de putten met vijf microliters van enzym oplossing. Bereid vervolgens het substraat leeg en monster putten door pipet 95 microliters van enzym test buffer in de putten. Breng vlak voor het meten vijf microliters enzymtestbuffer aan op de zes lege putten.

Breng vijf microliter van de 20 millimolar substraatoplossing aan op de monsterputten. Gebruik een multi-channel pipet op 50 microliter instelling om voorzichtig mengen de putten. Steek vervolgens de plaat in de microplaatlezer en meet elke put op 255 nanometer.

Ten slotte voert u de analyse uit in een spreadsheet. Twee voorbeelden LB agar platen na optimale en niet-optimale transformatie worden hier afgebeeld. Te veel bacteriële kolonies geven ofwel aan dat twee veel bacteriën werden verguld of dat de antibiotica kunnen worden verlopen.

Te weinig bacteriële kolonies kunnen erop wijzen dat ofwel niet genoeg plasmide werd gebruikt voor de transformatie of dat te veel antibiotica werden gebruikt om de bacteriën te selecteren. De bacteriële pellet die het uitgedrukte eiwit in milligramhoeveelheden bevat, wordt geoogst en expressie wordt geverifieerd via SDS-pagina. Sommige problemen kunnen optreden tijdens dit anders eenvoudige proces, met inbegrip van de eiwitten vormen opname lichamen of het eiwit niet wordt uitgedrukt.

Als een His-tag wordt gebruikt om het eiwit tag, affiniteit chromatografie met nikkel NTA agarose is een eenvoudige en goedkope capture methode elimineren van de meerderheid van de verontreinigingen. Als er geen tag wordt gebruikt, kan een combinatie van ammoniumsulfaatneerslag en een opeenvolgende hydrofobe uitwisselingschromatografie het eiwit ook scheiden van de meerderheid van andere eiwitten. Het eiwit wordt verder gescheiden van restantenbesmettingen door ionuitwisselingschromatografie gevolgd door de chromatografie van de grootteuitsluiting om een voldoende zuiver eiwit te verkrijgen.

Geen van de beschreven methoden is moeilijk in het bijzonder. Maar alle methoden vereisen training. Eerste pogingen kunnen mislukken, maar de experimenten zullen slagen na een aantal extra aanpassingen.

Alle hier gepresenteerde methoden zijn algemene methoden van eiwitzuivering. Hoewel gespecialiseerd voor FAHD-eiwitten, kan het protocol worden aangepast aan elk eiwit dat men zou willen zuiveren. Recombinant menselijke FAHD-1 is verkregen door de beschreven methoden en hoge resolutie x-ray structuren massaal bijgedragen aan ons begrip van FAHD-1 door functionaliteit die fungeert als beide, decarboxylase en hydrolase.

Bacteriën die in dit werk worden gebruikt zijn veiligheidsstammen en niet gevaarlijk. Algemene veiligheidshandleidingen zijn van toepassing op alle chemicaliën en FPLC-kolommen moeten met zorg worden behandeld.