Name: Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer een protocol voor de analyse van apoptotische thymocytenopname door macrofagen met behulp van C57BL/6 muizen. Deze methode onderzoekt efferocytose-efficiëntie en het effect van specifieke remmers op het opnameproces.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in de Shao Lab wordt ondersteund door onderzoek innovatieve Award van het College of Medicine en de Junior Faculty pilot Award van het ministerie van interne geneeskunde, Universiteit van Cincinnati en Grant DK K01_095067 van NIDDK/NIH.

Experimentele muizen werden gefokt en onderhouden in onze muizen kolonie. Alle dierlijk werk werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Cincinnati.
1. voorbereiding van CFSE gelabeld apoptotic thymocyten
<ol><li>Euthanaseren twee naïeve C57/B6 muizen door CO2 inhalatie voor 10 min en ontleden om de borstholte te openen, verwijderen (pull out) de thymus met gebogen Fine-Tip Tang in weefselcultuur petrischaal met 10 ml van RPMI1640 medium.</li>
	<li>Verkrijg enkele cel schorsing door het slijpen van de hele Thymus tegen twee matte uiteinden van de Microscoop dia's en vervolgens filteren de schorsing door middel van 100 μm cel zeef.</li>
	<li>Verzamel de 10 mL Thymus suspensie in een 50 mL buis en centrifuge op 300 x g voor 5 min.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende, opnieuw op te schorten in 40 mL van 1x PBS, en Tel cel nummers met een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min en verwijder de bovendrijvende.</li>
	<li>Hersuspendeer in 20 mL van 1x PBS in een 50 mL buis als een enkele cel schorsing met maximaal 2 x 108 cellen (indien meer dan 2 x 108 cellen, de rest van de cellen opnieuw op te schorten in een andere 20 ml van 1 x PBS in een andere 50 ml buis).</li>
	<li>Maak 5 μM van CFSE in gelijk volume (20 mL) van 1x PBS in een aparte 50 mL buis door het pipetteren van 40 l van CFSE Stock Solution (2,5 mM) in 20 mL 1x PBS en meng goed door het inverteren van de buis 2-3 keer.</li>
	<li>Voeg de 20 mL CFSE van stap 1,7 in de 20 mL van de cel schorsing van stap 1,6 (de uiteindelijke concentratie van CFSE is nu 2,5 μM). Opmerking: voor elke 20 mL cel schorsing is een 20 mL CFSE buis nodig.</li>
	<li>Omkeren van de cel en CFSE mengsel buis 2-3 keer en Incubeer het mengsel in het donker bij kamertemperatuur voor een maximum van 2 min, dan stoppen met de reactie door toevoeging van 10 mL warmte-geïnactiveerde paard serum.</li>
	<li>Centrifugeer het 50 mL Tube mengsel bij 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Nota: als de CFSE etikettering succesvol is, zal de cel korrel lichtgeel van kleur worden.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de Cell pellet in 40 mL van 1x PBS en Tel de cel nummers met een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer de cel suspensie bij 300 x g voor 5 min en gooi de bovendrijvende.</li>
	<li>Was de cel pellet weer met 40 mL van RPMI1640 medium.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende en opnieuw op te schorten cellen met RPMI1640 weefselkweek medium (RPMI1640 mM HEPES, 10% FBS (warmte geïnactiveerd), 20 mM glutamine, en 1x pen/keelontsteking) bij een concentratie van 7 x 106 cellen/ml in een 100 mm weefselkweek schaal. Opmerking: als er meer cellen worden verkregen, zal een aparte 100 mm weefselkweek schotel nodig zijn.</li>
	<li>Voeg staurosporine in de cel schorsing cultuur bij een definitieve concentratie van 1 μM en cultuur voor 4 uur bij 37 ° c in een weefselkweek incubator geleverd met 5% CO2.</li>
</ol>2. bereiding van de buik macrofagen
<ol><li>Injecteren twee C57B6 muizen (of een Gene-gemanipuleerde muizen in het lab) ze intraperitoneaal met 1 mL van 3% oud thioglycollaat op dag 0.</li>
	<li>Euthanaseren de muizen op dag 5 als in stap 1,1, knippen en schil open de buikhuid, maar laat het buikvlies intact. Spoel de buikholte door snel 10 mL was buffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in de buikholte te duwen met een 10 mL spuit bevestigd met een naald van 18 G.</li>
	<li>Haal de Wash buffer langzaam met dezelfde naald/spuit, en verzamel de Wash buffer in een 50 mL Tube (details verwijzen naar Janssen Lab artikel15).</li>
	<li>Was het buikvlies sonde tweemaal met 1x PBS, hersuspendeer de buik macrofagen in RPMI1640 weefselkweek middel bij een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml en hoeveelheid 500 l in elk van de 24-Well plaat. Laat de plaat in een weefselkweek incubator voor 2 uur.</li>
	<li>Verwijder de zwevende cellen door opzuigen en vervangen met 500 l van verse cultuurmedium, tweemaal.</li>
	<li>Optioneel, voeg TAM receptor tyrosine-remmer, RXDX-106, bij concentraties aangegeven in de figuur legendes in elk goed van de macrofagen cultuur en incubeer voor een andere 2 h.</li>
</ol>3. co-cultuur van buik macrofagen met apoptotic thymocyten
<ol><li>Verzamel apoptotic thymocyten van stap 1 en was drie keer met RPMI1640 medium. De efficiëntie van apoptotic inductie kan in dit stadium gemeten worden met de Annexine V/7-AAD Kit.</li>
	<li>Distribueer 0-12 x 106 cellen (in 500 l medium) in elke put van de macrofagen culturen van Protocol #2, volgens de experimentele regeling (bijv. Zie figuur 1). Dit maakt het gehele cultuur volume van 1 mL in elk goed van de 24-goed plaat. Voeg het blokkerende antilichaam in de cultuur onmiddellijk voor de toevoeging van apoptotic thymocyten.</li>
	<li>Cultuur het cel mengsel bij 37 °C voor 4 h in een incubator van de weefselcultuur die met 5% CO2wordt geleverd.</li>
	<li>Was elk goed van de cultuur met 1x PBS (bevattend 500 μM EDTA) tweemaal om de vrij-drijft apoptotic cellen te verwijderen.</li>
	<li>Vlek de plaat-gebonden macrofagen met CD11b-PE in dit stadium.<ol>
<li>Was de plaat-gebonden macrofagen met vlekken buffer (1x PBS, 1% BSA) een keer.</li>
		<li>Voeg 200 l van de vlek buffer met 2 l CD11b-PE in elk goed toe.</li>
		<li>Incubeer de plaat bij 4 °C gedurende 20 min.</li>
		<li>Was elk goed van de plaat drie keer met de kleuring buffer.</li>
		<li>Voeg 200 l van de vlek buffer toe en ga de plaat voorbeeld analyse onder de fluorescente microscoop te werk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatief, Los de plaat-gebonden macrofagen door toevoeging van 1 mL 1% lidocaïne in PBS en incubatie voor 10 min bij 37 ° c.</li>
	<li>Maak plaat-gebonden macrofagen met REPEAT pipet los.</li>
	<li>Breng de macro-suspensie over in een individuele 5 mL ronde-onderkant FACS buis van elk goed van de 24-Well plaat.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende en voeg 200 l van de vlek buffer toe met 2 l CD11b-PE (1:200 verdunning in kleur buffer).</li>
	<li>Incubatie de cel schorsing in kleuring buffer bij 4 ° c voor 20 min.</li>
	<li>Was de cel schorsing tweemaal met kleuring buffer.</li>
	<li>Voeg 200 l van kleuring buffer en ga voor FACS analyse met een flow cytometer en analyseren voor het percentage van CFSE positiviteit macrofagen.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
<li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li>
<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
<li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+%28SLE%29+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).</li>
<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Apoptosis is een hoogst behouden celdood proces dat vele signaalcascades impliceert en proteïne uitdrukking, afscheiding, en vervoer veroorzaakt. Apoptosis wordt vaak geassocieerd met cellulaire morfologie veranderingen17. Apoptotic cellen actief vrijgeven cytokines en chemokines die aantrekken fagocyten om te migreren naar de site en initiëren van het proces van overspoeling, een uiterst complexe route onder strakke controle18. Aan de andere kant, necrotic Cell Death relea...

Ons lichaam genereert 1-10 miljard apoptotic cellen op een dagelijkse basis. Zulk een groot aantal apoptotic cellen moet op een bepaalde manier worden ontruimd dat de immune reacties rustig blijven. Om de goedkeuring van apoptotic cellen tijdig te verzekeren, ontwikkelen talrijke types van weefsel ingezetene cellen en circulerende cellen mechanismen om apoptotic cellen over te spoelen1. Disfunctionele regulering van apoptosis is betrokken bij het begin en de progressie van verschillende inflammatoire aandoeningen en autoimmuniteit2. Apoptosis speelt ook een kritieke rol in de pathogenese van kankerontwikkeling en zijn verdere weerstand tegen conventionele behandelingen3,4. Verwijdering van apoptotic cellen bevordert in het algemeen een anti-inflammatoire reactie, die kan worden gekoppeld aan immunologische tolerantie5. Verstoring van apoptotic Cell klaring drives zelf-immunisatie en draagt bij tot de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten in zowel mensen als muizen6.
Wanneer de cellen apoptosis ondergaan, stellen zij de fosfatidylserine (PtdSer) van de binnen folder aan de buiten folder van het membraan bloot. PtdSer zal dan door fagocyten door oppervlakte receptoren worden erkend. Meer dan een dozijn receptoren zijn geïdentificeerd te herkennen en/of te vergemakkelijken de overspoeling van apoptotic cellen. In het algemeen zijn er ten minste drie soorten oppervlakte-receptoren die betrokken zijn bij de apoptotic cel klaring: Tethering receptoren, herkennen apoptotic cellen; kietelen receptoren, initiëren overspoeling; chaperoning receptoren, vergemakkelijken het hele proces7. TAM receptor tyrosine kinases (TAM RTKs) bestaan uit Tyro-3, AXL, en Mer en worden voornamelijk uitgedrukt door myeloïde cellen van het immuunsysteem8. De primaire functie van TAM RTKs is om te dienen als Tethering receptoren, het vergemakkelijken van de fagocyterende verwijdering van apoptotic cellen en puin. Onze groep heeft gestudeerd TAM gemedieerde apoptotic Cell klaring in de setting van de autoimmuniteit voor vele jaren. De vitamine K-afhankelijke eiwit de groeiarrestatie specifieke proteïne 6 (Gas6) en proteïne S (ProS) bindt aan en activeert de receptoren van TAM9,10. Gas6 wordt geproduceerd in het hart, nieren, en de longen. ProS wordt hoofdzakelijk geproduceerd in lever11. TAM erkent van apoptotic cellen op een zodanige wijze dat de N-terminal van Gas6/ProS bindt aan de PtdSer op een apoptotic cel en de C-terminal van Gas6/ProS bindt aan TAM-receptoren die verankerd op het oppervlak van fagocyten. Samen met de andere receptoren, overspoeling van apoptotic cellen komt12. Hoewel Mer kan binden aan zowel de ligands ProS en Gas6, vonden we dat Gas6 lijkt te zijn de enige ligand voor Mer-gemedieerde macrofagen fagocytose van apoptotic cellen, die kunnen worden geblokkeerd door anti-Mer antilichaam13. Macrofagen zijn professionele fagocyten. Snelle ontruiming van apoptotic cellen door macrofagen is belangrijk voor de remming van ontstekingen en auto-immune reacties tegen intracellulaire antigenen. Mer receptor tyrosine kinase is van cruciaal belang voor de inspoeling van de macrofagen en efficiënte klaring van apoptotic cellen14. In muis milt, Mer voornamelijk uitdrukt op de marginale zone en tastbare lichaam macrofagen13.
Het hier voorgestelde protocol beschrijft een basismethode om cel apoptosis te veroorzaken en manieren aan te tonen om het proces en de efficiency van efferocytosis te meten. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan studie efferocytosis door andere cel types in het overspoelen van apoptotic cellen van verschillende oorsprong.

<table><tbody><tr><td>Ack lysing buffer</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Frosted slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum (Heat-inactivated)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Bereid 1% buffer in 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Voeg 214,3 ml DMSO toe aan 100 mg om 1 mM stockoplossing te maken</td></tr><tr><td>Thioglycolate Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Bereid 3% thioglycolaat buffer in 1&acute;PBS, geautoclaveerd en bewaar in het donker gedurende 3 maanden.</td></tr></tbody></table>

experimentele analyse van apoptotic thymocyte overspoeling door macrofagen

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

De cel apoptosis is een natuurlijk proces en speelt een kritieke rol in embryonale ontwikkeling, homeostatische regelgeving, immune tolerantie inductie, en resolutie van ontsteking. Accumulatie van apoptotic puin in het lichaam kan leiden tot chronische inflammatoire reacties die leiden tot systemische auto-immuunziekten in de tijd. Verminderde apoptotic cel klaring is betrokken bij een verscheidenheid van auto-immuunziekten. Apoptotic klaring is een complex proces zelden ontdekt onder fysiologische omstandigheden. Het gaat om overvloedig oppervlak receptoren en signalering moleculen. Het bestuderen van het proces van apoptotic cel ontruiming biedt inzichtelijke moleculaire mechanismen en de daaropvolgende biologische reacties, die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Hier beschrijven we protocollen voor de inductie van apoptotic thymocyten, de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, en de analyse van apoptotic cel ontruiming doorstroming Cytometry en microscopie. Alle cellen zullen apoptose ondergaan in een bepaald stadium, en veel residentiële en circulerende cellen kunnen opname apoptotic puin. Daarom, het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotic cel binding en inname door vele andere soorten cellen.

Analyse van het buikvlies macrofagen-gemedieerde overspoeling van apoptotic thymocyten. Buik macrofagen en apoptotic cellen werden voorbereid en co-Cultured zoals beschreven in het protocol. Macrofagen werden losgemaakt en gekleurd met PE geconjugeerd anti-CD11b antilichaam voor 20 min op ijs. Macrofagen werden vervolgens gewassen en verwerkt in een stroom cytometer. Zoals te zien, er is geen CFSE positieve macrofagen in de rechtsonder Kwadrant als er geen apoptotic cellen werden toegevoegd in de cultuur...

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Ons lichaam genereert elke dag één tot 10 miljard apoptotische cellen. De efficiënte klaring van deze cellen helpt bij het verwijderen van celpuin en het onderhouden van inventarissen. Deze methode kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotische cel binding en inname door vele andere fagocytische cel types.Het aantonen van deze procedure zal Yuxuan Zhen zijn, een senior technicus in mijn lab. Om thymocyten te oogsten, gebruik je na het openen van de borstholte van een naïeve C57 zwarte 6 muis gebogen fijne puntkrachten om de thymus eruit te trekken. Plaats het orgaan in een weefselkweekschotel met 10 milliliter RPMI 1640 Medium.Maal de hele thymus tegen de matte uiteinden van twee microscoopdia's en filter de resulterende weefselsuspensie door een 70 micrometercelzeef in een buis van 50 milliliter. Verzamel de thymocyten door centrifugatie en resuspend de pellet in 40 milliliter. Na het tellen, centrifugeren de cellen opnieuw en resuspend tot twee keer 10 tot de acht cellen in 20 milliliter verse PBS per 50 milliliter buis.Label de cellen met vijf micromolar CFSE in 20 milliliter PBS per buis. Keer de buizen twee tot drie keer om te mengen voordat u de thymocyten niet langer dan twee minuten uitbroedt bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie stopt u de reactie met 10 milliliter warmtegeactiveerd paardenserum en verzamelt u de cellen door centrifugatie.Resuspend de gelabelde cellen in 40 milliliter verse PBS voor het tellen en centrifugeren, gevolgd door een extra wasbeurt met 40 milliliter medium. Na de medium wasbeurt, resuspend de thymocyten op een zeven keer 10 tot de zes cellen per milliliter van weefsel cultuur medium concentratie en zaad van de cellen in een 100 millimeter weefsel kweekschotel. Voeg vervolgens staurosporine toe aan de celkweek bij een uiteindelijke concentratie van één micromolar en plaats de plaat vier uur in een weefselkweek incubator.Voor peritoneale macrofagenisolatie, injecteer twee C57 zwarte 6 muizen intraperitoneally met een milliliter van 3% ouder thioglycollate op dag nul voor het openen van de buikhuid zonder het peritoneum op dag vijf te verstoren. Om de buikholte door te spoelen, gebruik een 10 milliliter spuit uitgerust met een 18-meter naald om snel 10 milliliter wasbuffer in de holte te duwen voordat u de wasbuffer langzaam in een 50 milliliter buis spoelt. Was de buikvliesspoeling twee keer met PBS.Resuspend de buikvliesmacrofagen op een twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter van weefsel cultuur medium concentratie. Volgende zaad 500 microliter van macrofagen in elke put van een 24 put plaat en plaats de plaat in een weefsel cultuur incubator voor twee uur. Aan het einde van de incubatie, aspirate de supernatant om de drijvende cellen te verwijderen en voeg 500 microliter van weefsel cultuur medium aan elke put.Voeg onmiddellijk nul tot 12 keer 10 toe aan de zes thymocyten in 500 microliter van medium tot elke put van de cultuur en plaats de plaat vier uur in de weefselkweek incubator. Aan het einde van de incubatie, was elke put twee keer met verse PBS om alle vrij zwevende apoptotische cellen te verwijderen, gevolgd door een enkele wasbeurt met kleuring buffer. Vervolgens label de plaatgebonden macrofagen met 200 microliter kleuring buffer aangevuld met een passende anti-CD11b antilichaam per put en plaats de plaat op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.In dit representatieve experiment toonde tot 30% van de thioglycollate gestimuleerde peritoneale macrofagen een positief signaal aan in het CFSE-kanaal dat aangeeft dat deze fagocyten cfse-gelabelde apoptotische cellen hadden ingenomen. Microscopische observatie van macrofaagvergulfment van apoptotische cellen is essentieel voor het onderzoeken van de capaciteit van macrofagen om apoptotische cellen in te nemen, aangezien CFSE-positieve macrofagen zich in het kwadrant rechtsonder verspreiden als gevolg van verschillende intensiteiten die erop wijzen dat het aantal apoptotische cellen binnen individuele macrofagen anders is. Een hogere verhouding van apoptotische cellen tot macrofagen verhoogt niet alleen het aantal macrofagen dat apoptotische cellen inneemt, maar verhoogt ook het vermogen van de macrofagen om meer apoptotische cellen in te nemen.In een andere reeks experimenten werd ongeveer 15% van de macrofagen CFSE-positief toen CFSE met het label apoptotische thymocyten gedurende vier uur aan de macrofaagcultuur werd toegevoegd, wat aangeeft dat deze macrofagen de fagocytische macrofagen waren. Mer-antilichaam blokkeert macrofaag-efferocytose op een dosisafhankelijke manier en de algehele blokkade kan ongeveer 30% van de efficiëntie van de efferocytose in de huidige stand vertegenwoordigen. Bovendien verzwakt een nieuw goedgekeurde TAM-receptorremmer macrofaageefoccytose op een dosisafhankelijke manier tot een concentratie van ongeveer 100 nanomolar.Vergeet niet om het percentage van de apoptotische cellen te controleren, omdat dit getal direct van invloed is op de efficiëntie van efferocytose. De fagocytische macrofagen kunnen verder worden geanalyseerd door westerse vlek om de signaalmoleculen te onderzoeken die door engulfmentproces worden geregeld en door microscopie om de dynamiek van engulfment te bestuderen.

experimental-analysis-of-apoptotic-thymocyte-engulfment-by-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

This video demonstrates a procedure for analyzing peritoneal macrophage-mediated efferocytosis of apoptotic mouse thymocytes by fluorescence microscopy.

Analysis of Efferocytosis of Apoptotic Thymocytes by Peritoneal Macrophages

This video showcases an apoptosis assay in cancer cells induced by pre-activated effector T cells. By co-culturing these cells with cancer cells marked with fluorescent nuclei, a caspase-cleavable fluorogenic substrate is added. Apoptotic cancer cells will display a different color in their nuclei, leading to dual fluorescence. This dual fluorescence is indicative of cancer cells undergoing apoptosis.

An In Vitro Assay for Studying the Cytotoxicity of Pre-Activated CD8+ T Cells against Cancer Cells

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Hierin beschrijven we een fagocytose assay met behulp van de gedispergeerde embryonale cellen van Drosophila . Het stelt ons in staat om in vivo fagocytose niveaus eenvoudig en nauwkeurig te kwantificeren en nieuwe moleculen te identificeren die nodig zijn voor de fagocytose van apoptotische cellen.

Fagocytose Assay voor Apoptotische Cellen in Drosophila Embryo's

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

We beschrijven hier een protocol om te onderzoeken van de cytotoxiciteit van pre-geactiveerde CD8+ T cellen tegen kankercellen door het detecteren van apoptotic kanker cellen via real-time microscopie. Dit protocol kan mechanismen achter myeloïde cel-geïnduceerde T cel onderdrukking onderzoeken en evalueren van de verbindingen die zijn gericht op het aanvullen van T cellen via blokkade van onderdrukkende myeloïde immuuncellen.

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen. We gebruiken flowcytometrie om Annexine V en 7-AAD dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren, waarbij we de hele cel gebruiken en scanning-elektronenmicroscopie gebruiken om de morfologie van het celmembraan te observeren.

LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan

Leer een protocol voor de analyse van apoptotische thymocytenopname door macrofagen met behulp van C57BL/6 muizen. Deze methode onderzoekt efferocytose-efficiëntie en het effect van specifieke remmers op het opnameproces.

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

Meer video's verkennen