Name: Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer een on-membraan verteringstechniek voor massaspectrometrie-analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze methode verhoogt de doorvoer door polyacrylamide gelelektroforese overbodig te maken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd deels gesteund door Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI subsidie nummer 15K09418 (TM), een onderzoeksbeurs van Kanehara Ichiro Medical Science Foundation en een onderzoeksbeurs van Suzuken Memorial Foundation (all to TM).

1. immunoprecipitatie
Opmerking: we gebruikten niet-natriumdodecylsulfaat (SDS) lysisbuffer en citraat elutie, zoals beschreven in de volgende secties. Het gebruik van een alternatieve in-House immunoprecipitatie-techniek kan echter ook van toepassing zijn voor het bereiden van LC-MS/MS-monsters.
<ol><li>Transfect gekweekte cellen met vectoren coderen van een epitoop tag alleen of een fusie-eiwit. Voor het verwerven van representatieve gegevens, overdracht J774 cellen (1 x 106) met vectoren coderen groene fluorescerende proteïne (GFP) alleen of GFP-gesmolten Capn6 (calpain-6 gen) met behulp van cationische liposomen.</li>
	<li>Geconjugeerde antilichamen tegen magnetische kralen.<ol>
<li>Meng voor dit doel ANTIGFP-antilichamen (2 μL/reactie) met magnetische kralen (25 μL/reactie) in 500 μL citraat fosfaatbuffer (24,5 mM citroenzuur, 51,7 mM dibasisch natriumfosfaat; pH 5,0) in een proefbuisje van 1,5 mL.</li>
		<li>Draai het mengsel met 50 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de IgG-geconjugeerde kralen driemaal met citraat fosfaatbuffer met 0,1% polyoxyethyleen (20) polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een geschikte lysisbuffer. Voor het verwerven van representatieve gegevens, Lyse de getransverteerde cellen gedurende 30 minuten op ijs in 400 μL lysisbuffer (50 mM tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poly (oxyethelene) octylfenyl ether) bevattende 40 μmol/L fenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg/mL leupeptine, 50 μg/ mL aprotinin, 200 μmol/L natrium orthovanadaat en 1 mM ethyleenglycol tetraazijnzuur (EGTA) in 1,5 mL reageerbuisjes 24 uur na trans fectie.</li>
	<li>Wis het lysaat door gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 15.000 x g en verzamel het supernatant.</li>
	<li>Preclear het lysaat. Voeg ongelabelde magnetische parels (25 μL/reactie) toe in een 1,5 mL reageerbuisje. Was de kralen driemaal met 500 μL citraat fosfaatbuffer. Na het verwijderen van citraat fosfaatbuffer in de laatste wasbeurt, voeg de cel lysaat over de magnetische kralen. Draai het mengsel met behulp van Rotator bij 50 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats de reageerbuis op een magnetische standaard gedurende 5 minuten voor magnetische scheiding en verzamel het cellenlysaat. Het gebruik van de door de fabrikant aangewezen magnetische standaard wordt aanbevolen.</li>
	<li>Bind de doel eiwitten aan de geconjugeerde kralen. Plaats de immunoglobuline (IG) G-geconjugeerde parels op een magnetische standaard gedurende 5 minuten voor magnetische scheiding, gooi de citraatbuffer weg en voeg vervolgens de cellysaat toe aan de afgescheiden kralen.</li>
	<li>Draai het mengsel met 50 rpm gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Scheid de doel eiwitten van vrije niet-doelwit eiwitten. Was de kralen driemaal met behulp van 500 μL citraat fosfaatbuffer met 0,1% polyoxyethyleen (20) polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraat. Voeg na de laatste wasbeurt 30 μL citraat buffer (pH 2 – 3) toe en inincubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de doel eiwitten te Elderen. Opmerking: als herstel van de immunoprecipitatie onvoldoende is, kan het gebruik van alternatieve epitoop Tags, zoals vlag of zijn, de efficiëntie verbeteren. Als de efficiëntie van de elutie ontoereikend is, kan het gebruik van andere eluanten, zoals een SDS-based oplossing, de efficiëntie verbeteren.</li>
</ol>2. op-membraan vertering van eiwitten
Opmerking: het gebruik van eiwit vrije materialen en apparatuur is noodzakelijk om besmetting met exogene eiwitten te voorkomen. Bovendien wordt aanbevolen dat de bediener een chirurgisch masker en handschoenen draagt om verontreiniging door menselijke eiwitten te voorkomen.
<ol><li>Snijd PVDF-membranen in stukjes van 3 mm x 3 mm met behulp van een chirurgische schaar die met methanol is afgeveegd en onmiddellijk vóór gebruik is gedroogd.</li>
	<li>Voeg 2 – 5 μL ethanol toe op de stukjes PVDF-membraan op schone aluminiumfolie.</li>
	<li>Voordat ze volledig drogen, voeg de eluant (2 – 5 μL elk, 4 – 6 stuks per monster) toe aan de hydrofiele PVDF-membranen en lucht-droog de membranen totdat het membraanoppervlak mat wordt. Gedroogde membranen kunnen worden bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de alle membranen over in 1,5 mL plastic buizen, Voeg 20 – 30 μL ethanol toe om de membranen hydrofiel te maken en verwijder vervolgens de ethanol met behulp van een pipet.</li>
	<li>Voeg, voordat het membraan volledig uitdroogt, 200 μL dithiotreïtol (DTT)-gebaseerde reactie oplossing (80 mm NH4HCO3, 10 mm DTT en 20% acetonitril) toe en inincuberen deze bij 56 °c gedurende 1 uur.</li>
	<li>Vervang de reactie oplossing met 300 μL iodoacetamideoplossing (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamide en 20% acetonitril) en inincuberen gedurende 45 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Was de membranen tweemaal met 1 mL gedistilleerd water en eenmaal met 1 mL 2% acetonitril door vortex menging voor > 10 s.</li>
	<li>Los in de reactie oplossing (30 mM NH4HCO3 met 70% acetonitril) GELYOFILISEERDE MS-grade trypsine (tabel met materialen) op. Voeg 100 μL van de reactie oplossing met 1 μg trypsine (tafel van de materialen) (30 mm NH4hco3 met 70% acetonitril) toe en incuberen bij 37 °c 's nachts.</li>
	<li>Breng de reactie oplossing met de tryptische verteert over in een schone 1,5 ml reageerbuis met behulp van een pipet.</li>
	<li>Voeg 100 μL wasoplossing (70% acetonitril/1% trifluorazijnzuur) toe aan het membraan en inincuberen bij 60 °C gedurende 2 uur. Verzamel de wasoplossing en meng deze met de reactie oplossing. Voeg nog eens 100 μL wasoplossing toe aan het membraan en sonificeren het gedurende 10 min. Verzamel vervolgens de reinigingsoplossing en meng met de reactie oplossing.</li>
	<li>Bedek de reageerbuis met een stukje laboratorium folie en maak een paar kleine gaatjes met een naald. Droog de oplossing met een vacuüm concentrator.</li>
	<li>Los het residu op in 10 μL van 0,2% mierenzuur. Na centrifugeren (12.000 × g, 3 min bij kamertemperatuur), breng het supernatant over in een monsterbuis. Opmerking: de wast zijn de kritieke stappen van deze sectie. Tijdens een on-membraan eiwit vertering is het wassen van de membranen met de geïmmobiliseerde eiwitten na reductie en alkylatie met gedistilleerd water, gevolgd door 2% acetonitril, voor meer dan 10 sec per stuk, van cruciaal belang voor het verwijderen van de reagentia.</li>
</ol>3. LC – elektro spray ionisatie (ESI)-MS/MS-analyse
<ol><li>Activeer een ESI-MS/MS-instrument (tabel met materialen) in combinatie met een nano-LC HPLC-systeem (tabel metmaterialen). Koppel een pre-Column (tabel met materialen) en een analytische kolom (tabel met materialen).</li>
	<li>Kalibreer vóór de analyse de massaspectrometer met behulp van tryptische verteerd boviene serumalbumine opgelost in 0,2% mierenzuur, dat standaard peptiden biedt.</li>
	<li>Analyseer de samples met de positive Ion-modus en een massa bereik van 400 – 1250 m/z; vervolgens verkrijgt u tot 10 MS/MS spectra (elk 100 MS) met een massa bereik van 100 – 1600 m/z en een lineaire gradiënt van 2% – 80% acetonitril en 0,2% mierenzuur voor 80 min bij een debiet van 300 nL/min.</li>
	<li>Analyseer de uitvoergegevens met behulp van software voor eiwit identificatie (tabel met materialen) om de geassocieerde eiwitten van de kandidaat te identificeren. Voor de positieve identificatie van een kandidaat-eiwit is een detectie van ten minste één high-fidelity peptide fragment (> 95% getrouwheid) vereist.</li>
	<li>Laat de eiwitten weg die ook worden neergeprecipiteerd in GFP-uitdrukken van lysaten (transfectie van vector die een GFP-tag alleen uitdrukt) uit de lijst van kandidaat-eiwitten. Opmerking: als er weinig eiwitten in de database-analyse worden geïdentificeerd, kan wijziging van de MS/MS-acquisitie voorwaarden (bijv. het veranderen van de tijd van 100 MS elk tot 50 MS per stuk) het aantal geïdentificeerde eiwitten verhogen.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben eerder beschreven een analyse van de oxidatieve modificaties van apolipoproteïne B-100 in geoxideerde low-density lipoproteïne met behulp van LC-MS/MS voorafgegaan door een op-membraan spijsvertering techniek6. In de huidige studie, we combineerden deze techniek met immunoprecipitatie en hebben verschillende calpain-6-geassocieerde eiwitten geïdentificeerd. Deze nieuwe techniek vertegenwoordigt een handige methode voor het screenen van kandidaat-geassocieerde eiwitten. Calpain-6 is een n...

Hoewel eiwitten een constitutieve rol spelen in levende organismen, worden ze voortdurend gesynthetiseerd, verwerkt en afgebroken in de intracellulaire omgeving. Bovendien, intracellulaire eiwitten vaak fysiek en biochemisch interactie, die de functie van een of beide1,2,3beïnvloedt. Bijvoorbeeld, de directe binding van spliceosome-geassocieerde proteïne homo CWC22 met eukaryotische omzettings initiatie factor 4a3 (eIF4A3) is noodzakelijk voor de assemblage van de Exon Junction complex4. Consistent met deze, een eIF4A3 mutant die niet affiniteit voor CWC22 niet in slaagt om Exon Junction complex gestuurde mRNA splicing4te faciliteren. Zo is de studie van eiwit interacties cruciaal voor het precieze begrip van fysiologische regulering en van cellulaire functies.
Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) zijn toegepast op de uitgebreide analyse van eiwit-eiwit interacties. Bijvoorbeeld, de co-precipitatie van endogene eiwitten of exogenously introduceerde gelabelde eiwitten met hun geassocieerde eiwitten, gevolgd door MS-analyse, maakt de identificatie mogelijk van nieuwe eiwit interacties5. Een belangrijk knelpunt bij MS/MS-analyses is echter een slecht herstel van tryptische vergisters van eiwit monsters. Voor het uitvoeren van proteomische analyses op cellysaten worden in het algemeen in-gel en op membraan vergistings technieken gebruikt om MS/MS-monsters voor te bereiden. We hebben eerder een in-gel vergistings procedure vergeleken met een on-membraan vergistings techniek6, en toonden aan dat deze laatste gepaard ging met een betere sequentiedekking. Polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan kan geschikt zijn voor dit doel, omdat het mechanisch robuust en bestand is tegen hoge concentraties van organische oplosmiddelen7,8, waardoor de enzymatische vertering van geïmmobiliseerde eiwitten in aanwezigheid van 80% acetonitril9. Bovendien kan immobilisatie op een membraan conformationele veranderingen in doel eiwitten veroorzaken, wat leidt tot verbeteringen in de efficiëntie van tryptische spijsvertering10. Dienovereenkomstig hebben we in dit artikel het gebruik van Immunoprecipitation-LC/MS/MS-analyse van eiwit interacties beschreven met behulp van een verterings techniek op het membraan. Deze eenvoudige methode vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties, zelfs in niet-gespecialiseerde laboratoria.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>nanoflow high-performance liquid chromatography</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10mmID * 100mmL</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)</td></tr><tr><td>peptide standard</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>tryptic digests of bovine serum albumin</td></tr><tr><td>PP vial</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>plastic sample tube</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cooctail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot software</td><td>Sciex</td><td>5034057</td><td>software for protein identification</td></tr><tr><td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>trypsin</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>trap column</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5mmID * 1mmL</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 system</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan vergistings techniek

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Talrijke intracellulaire eiwitten communiceren fysiek in overeenstemming met hun intracellulaire en extracellulaire omstandigheden. Inderdaad, cellulaire functies grotendeels afhangen van intracellulaire eiwit – eiwit interacties. Daarom is onderzoek met betrekking tot deze interacties onmisbaar om het begrijpen van fysiologische processen te vergemakkelijken. Co-precipitatie van geassocieerde eiwitten, gevolgd door massaspectrometrie (MS) analyse, maakt het mogelijk nieuwe eiwit interacties te identificeren. In deze studie hebben we details gegeven over de nieuwe techniek van Immunoprecipitation-vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-analyse in combinatie met on-membraan vertering voor de analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze techniek is geschikt voor ruwe immunoprecipitanten en kan de doorvoer van proteomische analyses verbeteren. Gelabelde recombinant eiwitten werden neergeprecipiteerd met specifieke antilichamen; vervolgens werden immunoprecipitanten die op polyvinylideendifluoride membraan stukken werden geblopt, onderworpen aan reductieve alkylatie. Na trypsinisatie werden de verteerde proteïne residuen geanalyseerd met LC-MS/MS. met behulp van deze techniek, waren we in staat om verschillende kandidaat-geassocieerde eiwitten te identificeren. Deze methode is dus handig en nuttig voor de karakterisering van nieuwe proteïne-eiwit interacties.

Door middel van de hierboven beschreven procedure werden immunoprecipitanten geanalyseerd met LC-MS/MS (Figuur 1). Na de uitsluiting van exogenously afgeleide eiwitten (eiwitten van andere soorten en Igg's) werden 17 eiwitten geïdentificeerd in calpain-6-geassocieerde immunoprecipitanten (tabel 1) en 15 eiwitten werden geïdentificeerd in GFP-geassocieerde immunoprecipitanten ( Tabel 2). Van de calpain-6-en GFP-geassocieerde e...

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Onderzoek naar eiwit-eiwit interactie is onmisbaar voor het begrijpen van fysiologische processen op verschillende terreinen. In deze video introduceren we on-membraanverteringstechniek waarmee de onderzoekers op een handige manier een uitgebreide analyse van bindende eiwitten door MS kunnen uitvoeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de doorvoer van proteomische analyse voor ruwe immunoprecipitanten kunnen verbeteren omdat scheiding van eiwitten door polyacrylamide gel elektroforese niet nodig is.Begin met het vervoegen van het antilichaam aan de magnetische kralen, door het anti-GFP-antilichaam met de kralen te mengen in 500 microliter van citraatfosfaatbuffer. Draai het mengsel een uur bij 50 RPM bij kamertemperatuur. En was vervolgens de geconjugeerde kralen drie keer met citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20.Lyse transfected cellen volgens manuscript richtingen. Schraap de schotel en breng het lysaat in de 1,5 milliliter reageerbuis. Maak vervolgens vijf minuten het lysaat schoon door te centrifugeren bij 15,000 x g en verzamel de supernatant.Bereid ongelabelde magnetische kralen door ze drie keer te wassen met 500 microliter citraatfosfaatbuffer. Verwijder na de laatste wasbeurt de buffer en voeg de cellysaat toe aan de kralen. Draai het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur bij 50 RPM.Voer magnetische scheiding uit op de magnetische standaard en verzamel het cellysaat. Om de doeleiwitten te binden aan de immunoglobuline geconjugeerde kralen, plaatst u de kralen gedurende vijf minuten op de magnetische standaard. Gooi de citrate buffer weg en voeg het cellysaat toe aan de kralen.Draai het mengsel gedurende een uur bij 50 RPM. Om doeleiwitten te scheiden van de vrije niet-doeleiwitten, was de kralen drie keer met 500 microliter citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20. Voeg na de laatste wasbeurt 30 microliter citraatbuffer toe en laat de kralen vijf minuten op kamertemperatuur zitten om de doeleiwitten te ontwijken.Om het membraan voor te bereiden, snijd PVDF membranen in 3 millimeter bij 3 millimeter stukken met behulp van chirurgische schaar die onmiddellijk voor gebruik werden gereinigd. Plaats de stukjes membraan op aluminiumfolie en voeg twee tot vijf microliter ethanol toe aan elk stuk. Voordat membranen volledig droog zijn, voeg twee tot vijf microliter van het eiwit eluent aan elk stuk en de lucht drogen totdat het membraanoppervlak wordt mat.Breng vervolgens membranen over in buizen van 1,5 milliliter en bewaar ze op vier graden Celsius. Voeg bij gebruik onmiddellijk twee tot 30 microliter ethanol toe, waardoor ze hydrofiel worden. Verwijder de ethanol met een pipet, maar voordat de membranen drogen, volledig toe te voegen 200 microliters van DTT-gebaseerde reactie oplossing aan elke buis, en incubeer ze op 56 graden Celsius gedurende een uur.Vervang na incubatie de reactieoplossing door 300 microliters iodoacetamide-oplossing en broed gedurende 45 minuten in het donker. Was vervolgens de membranen twee keer met gedestilleerd water en eenmaal met 2%acetonitril door minstens tien seconden te vortexen. Werken met diaphaneuze-gerelateerde acetonitril kan zeer gevaarlijk zijn.Een masker, bril en handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het uitvoeren van de on-membraan spijsvertering procedure. Bereid trypsine volgens manuscript aanwijzingen, en voeg 100 microliters van trypsine reactie oplossing aan elk membraan. Incubeer 's nachts op 37 graden Celsius voor de spijsvertering.Breng de reactieoplossing de volgende dag over in een schone buis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter wasoplossingen toe aan het membraan. Broed het membraan twee uur lang in op 60 graden Celsius, verzamel vervolgens de wasoplossing en meng het met de reactieoplossing. Voeg nog eens 100 microliter wasoplossing toe aan het membraan en sonisch gedurende 10 minuten.Verzamel vervolgens de wasoplossing en meng deze met de reactieoplossing. Bedek de reageerbuis met een stuk laboratoriumfilm en maak kleine gaatjes in de film met een naald. Droog de oplossing met behulp van een vacuümconcentrator en los het residu op in 10 microliter van 2%mierenzuur.Centrifuge de buis op 12, 000 x g gedurende drie minuten, en breng de supernatant in een monsterbuis. Analyseer het monster met behulp van een massaspectrometer gekoppeld aan een nano LC/HPLC-systeem. Met behulp van dit protocol werden 17 eiwitten geïdentificeerd in de Calpain-6 geassocieerde immunoprecipitant, 15 in de GFP-geassocieerde immunoprecipitant, en 11 werden geïdentificeerd in beide.Het is belangrijk op te merken dat detectie van ten minste een high fidelity peptide fragment nodig is voor een positieve identificatie van een kandidaat-eiwit. Eiwitten die neergeslagen in de GFP-uitdrukkende lysaat evenals histonen, exogene en ribosomale eiwitten werden weggelaten uit de lijst. Het wassen van de membranen vóór tryptische spijsvertering met gedestilleerd water en 2%acetonitril is de belangrijkste stap in de procedure van on-membraanvertering over eiwitten.Volgens deze methode is het mogelijk om co-neerslag van doeleiwit te bevestigen door andere experimenten uit te voeren, zoals immunoprecipitatie en westerse vlekanalyse. Deze eenvoudige methode stelt de onderzoekers in staat om de nieuwe eiwit-eiwit interacties te verkennen met handige en hooggevoelige analyse.

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video laat zien experimenten met daarop volgende analyse van eiwit-eiwit interacties door het gebruik van micro-oppervlakken met een patroon. De aanpak biedt de mogelijkheid om eiwit interacties op te sporen in levende cellen en combineert een hoge doorvoer-mogelijkheden met de mogelijkheid te extraheren kwantitatieve informatie.

In-vivo detectie van eiwit-eiwit interacties op de Micro-oppervlakken met een patroon

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

This video demonstrates co-immunoprecipitated protein complexes on a PVDF membrane for protein-protein interaction analysis. The reduced proteins from complexes were treated with trypsin to cleave the individual proteins at the smaller peptides, then, the remaining peptides were extracted from the PVDF membrane. The pulled peptide derived from both proteins in the complex was then dried and resuspended in a low concentration of formic acid for further analysis.

On-Membrane Protein Digestion to Prepare Co-Immunoprecipitated Proteins for Interaction Studies

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer een on-membraan verteringstechniek voor massaspectrometrie-analyse van eiwit-eiwit interacties. Deze methode verhoogt de doorvoer door polyacrylamide gelelektroforese overbodig te maken.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Meer video's verkennen