Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Onderzoek naar eiwit-eiwit interactie is onmisbaar voor het begrijpen van fysiologische processen op verschillende terreinen. In deze video introduceren we on-membraanverteringstechniek waarmee de onderzoekers op een handige manier een uitgebreide analyse van bindende eiwitten door MS kunnen uitvoeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de doorvoer van proteomische analyse voor ruwe immunoprecipitanten kunnen verbeteren omdat scheiding van eiwitten door polyacrylamide gel elektroforese niet nodig is.

Begin met het vervoegen van het antilichaam aan de magnetische kralen, door het anti-GFP-antilichaam met de kralen te mengen in 500 microliter van citraatfosfaatbuffer. Draai het mengsel een uur bij 50 RPM bij kamertemperatuur. En was vervolgens de geconjugeerde kralen drie keer met citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20.

Lyse transfected cellen volgens manuscript richtingen. Schraap de schotel en breng het lysaat in de 1,5 milliliter reageerbuis. Maak vervolgens vijf minuten het lysaat schoon door te centrifugeren bij 15,000 x g en verzamel de supernatant.

Bereid ongelabelde magnetische kralen door ze drie keer te wassen met 500 microliter citraatfosfaatbuffer. Verwijder na de laatste wasbeurt de buffer en voeg de cellysaat toe aan de kralen. Draai het mengsel 30 minuten op kamertemperatuur bij 50 RPM.

Voer magnetische scheiding uit op de magnetische standaard en verzamel het cellysaat. Om de doeleiwitten te binden aan de immunoglobuline geconjugeerde kralen, plaatst u de kralen gedurende vijf minuten op de magnetische standaard. Gooi de citrate buffer weg en voeg het cellysaat toe aan de kralen.

Draai het mengsel gedurende een uur bij 50 RPM. Om doeleiwitten te scheiden van de vrije niet-doeleiwitten, was de kralen drie keer met 500 microliter citraatfosfaatbuffer met 1%polysorbate 20. Voeg na de laatste wasbeurt 30 microliter citraatbuffer toe en laat de kralen vijf minuten op kamertemperatuur zitten om de doeleiwitten te ontwijken.

Om het membraan voor te bereiden, snijd PVDF membranen in 3 millimeter bij 3 millimeter stukken met behulp van chirurgische schaar die onmiddellijk voor gebruik werden gereinigd. Plaats de stukjes membraan op aluminiumfolie en voeg twee tot vijf microliter ethanol toe aan elk stuk. Voordat membranen volledig droog zijn, voeg twee tot vijf microliter van het eiwit eluent aan elk stuk en de lucht drogen totdat het membraanoppervlak wordt mat.

Breng vervolgens membranen over in buizen van 1,5 milliliter en bewaar ze op vier graden Celsius. Voeg bij gebruik onmiddellijk twee tot 30 microliter ethanol toe, waardoor ze hydrofiel worden. Verwijder de ethanol met een pipet, maar voordat de membranen drogen, volledig toe te voegen 200 microliters van DTT-gebaseerde reactie oplossing aan elke buis, en incubeer ze op 56 graden Celsius gedurende een uur.

Vervang na incubatie de reactieoplossing door 300 microliters iodoacetamide-oplossing en broed gedurende 45 minuten in het donker. Was vervolgens de membranen twee keer met gedestilleerd water en eenmaal met 2%acetonitril door minstens tien seconden te vortexen. Werken met diaphaneuze-gerelateerde acetonitril kan zeer gevaarlijk zijn.

Een masker, bril en handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het uitvoeren van de on-membraan spijsvertering procedure. Bereid trypsine volgens manuscript aanwijzingen, en voeg 100 microliters van trypsine reactie oplossing aan elk membraan. Incubeer 's nachts op 37 graden Celsius voor de spijsvertering.

Breng de reactieoplossing de volgende dag over in een schone buis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter wasoplossingen toe aan het membraan. Broed het membraan twee uur lang in op 60 graden Celsius, verzamel vervolgens de wasoplossing en meng het met de reactieoplossing. Voeg nog eens 100 microliter wasoplossing toe aan het membraan en sonisch gedurende 10 minuten.

Verzamel vervolgens de wasoplossing en meng deze met de reactieoplossing. Bedek de reageerbuis met een stuk laboratoriumfilm en maak kleine gaatjes in de film met een naald. Droog de oplossing met behulp van een vacuümconcentrator en los het residu op in 10 microliter van 2%mierenzuur.

Centrifuge de buis op 12, 000 x g gedurende drie minuten, en breng de supernatant in een monsterbuis. Analyseer het monster met behulp van een massaspectrometer gekoppeld aan een nano LC/HPLC-systeem. Met behulp van dit protocol werden 17 eiwitten geïdentificeerd in de Calpain-6 geassocieerde immunoprecipitant, 15 in de GFP-geassocieerde immunoprecipitant, en 11 werden geïdentificeerd in beide.

Het is belangrijk op te merken dat detectie van ten minste een high fidelity peptide fragment nodig is voor een positieve identificatie van een kandidaat-eiwit. Eiwitten die neergeslagen in de GFP-uitdrukkende lysaat evenals histonen, exogene en ribosomale eiwitten werden weggelaten uit de lijst. Het wassen van de membranen vóór tryptische spijsvertering met gedestilleerd water en 2%acetonitril is de belangrijkste stap in de procedure van on-membraanvertering over eiwitten.

Volgens deze methode is het mogelijk om co-neerslag van doeleiwit te bevestigen door andere experimenten uit te voeren, zoals immunoprecipitatie en westerse vlekanalyse. Deze eenvoudige methode stelt de onderzoekers in staat om de nieuwe eiwit-eiwit interacties te verkennen met handige en hooggevoelige analyse.