DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering
October 8th, 2019
Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.
Dit protocol beschrijft het verzamelen van massieve gegevens uit eiwit-DNA bindende microarray voor primase, een enzym dat zich van voorbijgaande aard bindt aan specifieke DNA-sequenties en op zijn beurt de vorming van RNA-primers katalyseert. Deze video zal bespreken hoe microarray-technologie kan helpen bij het herdefiniëren van primase sequentieherkenningssites en hoe een hoge doorvoerbenadering de klassieke biochemie kan complimenteren. Deze techniek combineert twee benaderingen: primase DNA bindende microarray en primase activiteit test.
De microarray levert enorme gegevens van primase binding aan DNA-sequenties, waar als de biochemische test geeft informatie over RNA primer vorming door DNA primase. De geteste enzymatische activiteit is afhankelijk van het inzicht van het microarray-experiment en de lagere doorvoer in zijn aard. Het verband tussen de efficiëntie van binding, DNA-sequentieselectie en de activiteit van het enzym wordt onderzocht.
Identificatie van sequentiebepaling met behulp van microarray, stelt ons in staat om nauwkeurige conclusies te trekken op basis van enorme gegevens van de microarray. Deze aanpak is tot nu toe gebruikt om DNA-bindende sequenties van transcriptiefactoren te beschrijven. Transcriptiefactoren zijn statische eiwitten die zich nauw binden aan DNA.
Het aantonen van de procedure zal Stefan Ilic zijn. Om deze procedure te beginnen, maak de microarray-dia voor nat door deze in een coplinpot te plaatsen met 0,01%Triton-X 100. En draaien op een lab rotator, voeg 125 rpm voor vijf minuten.
Pipette de blokkerende oplossing in een plastic doos. Verwijder vervolgens de microarray-dia uit de coplin-pot. Gebruik een fijne doekje om de niet-DNA-kant en randen van de dia aan te drijven.
Plaats de microarray langzaam in de plastic doos. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur met langzaam schudden. Daarna was je de glijbaan één keer met 0,01%Tween-20 in PBS.
Op een lab rotator bij 125 rpm gedurende vijf minuten. Verwijder de Tween-20 en spoel de glijbaan één keer af met 0,01%Triton-X 100 in PBS op een labdrammer bij 125 tpm gedurende twee minuten. Breng de glijbaan vervolgens snel over naar een coplin-pot met PBS.
Stel eerst de PMB-kamer samen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de dia in de aangewezen ruimte. Gebruik een pincet om het naar beneden en naar links te duwen.
Plaats de siliciumpakking op de top, zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd met het onderste deel van de PBM-kamer. Sluit vervolgens de kamer en draai de schroeven diagonaal aan. Pipette het eiwitbindingsmengsel in elke put van de pakking.
Vervolgens, incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Om te beginnen, pipet 0,05%Tween-20 in PBS in de PBM-kamer om de glijbaan kort te wassen. Verwijder met behulp van een vacuüm-aspirator de oplossing uit de putten van de kamer en wees erop dat u de DNA-vlekken niet aanraakt.
Herhaal dit, was de glijbaan kort met PBS. En gebruik het vacuüm om de oplossing uit de putten van de kamer te verwijderen terwijl je voorzichtig bent om de DNA-vlekken niet aan te raken. Voeg vervolgens Alexa 488 geconjugeerde anti-Zijn Antibodie toe aan elke put van de PBM-kamer.
Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Daarna, kort wassen van de dia in de PBM kamer door het toevoegen van een paar druppels van 0,05% Tween-20 in PBS in elke put. En gebruik de vacuüm aspirator om de oplossing te verwijderen uit de putten van de kamer, voorzichtig om niet aanraken van de DNA-vlekken.
DeG-kamer demonteren en de schuif verwijderen. Spoel de glijbanen twee keer in 0,05%Tween-20 in PBS, met elke spoeling van drie minuten. Spoel vervolgens de glijbanen twee keer in PBS, waarbij elke spoeling elk drie minuten duurt.
En één keer in dubbel gedestilleerd water gedurende drie minuten. Droog de glijbanen met perslucht. En bewaar ze in een donkere diadoos tot ze klaar zijn om te scannen.
Gebruik een microarrayscanner om de chip te scannen met een excitatie van 495 nanometer en een emissie van 19 nanometer. En verzamel de mediane fluorescentie intensiteit. In deze studie pi doorvoer primase profilering wordt gebruikt om de primase bindende sites in kaart te brengen, met inbegrip van die moeilijk, zo niet onmogelijk te observeren met behulp van klassieke instrumenten.
Belangrijk is dat pi throughput primase profilering het mogelijk maakt om het traditionele begrip van primase binding sites opnieuw te bekijken. Vooral pi doorvoer primase profilering onthult bindende specificiteiten in aanvulling op bekende 5'GTC3'herkenning sequenties, wat leidt tot veranderingen in de functionele activiteiten van T7 DNA primase. Namelijk, twee groepen van sequenties worden geïdentificeerd.
Sterke bindende DNA-sequenties die TG in de flanken en zwakke bindende DNA-sequenties bevatten die AG in de flanken bevatten. Er werden geen primase binding aan DNA-sjablonen gevonden die 5'GTC3' misten in hun sequenties. De primase DNA-herkenningsplaatsen die specifieke kenmerken bevatten, zoals TG-rijke flanken, verhogen de primase DNA-binding tot 10 keer.
Verrassend genoeg verhogen ze ook de lengte van nieuw gevormd RNA. Belangrijk is dat hoge doorvoer primase profilering stelt ons in staat om te observeren en kwantificeren van de variabiliteit in primer lengte in relatie tot de volgorde van de DNA-sjabloon. Bij het uitvoeren van deze procedure moeten de wasstappen subtiel zijn.
En buffers moeten componenten bevatten die de primase op het DNA hebben geregistreerd. Ook wordt een drempel van futiele bindende gebeurtenissen biochemisch bepaald. Daarom is de analyse van de microarray onvoldoende.
Methoden zoals een oppervlakteplasmaresonantie en gelverschuivingstesten kunnen de bindende affiniteit van primase bepalen om de DNA-sequenties te selecteren. Mijn lab implementeert machine learning voorspellingsmodellen om primase sequentiedeterminanten te detecteren die productieve primers opleveren die kunnen worden uitgebreid met DNA polymerase. In het tijdperk van big data, een implementatie van statistische methoden om big data te analyseren, zal de techniek zeker helpen om specifieke DNA-sequenties beter te karakteriseren en de sequentieherkenning te koppelen aan de activiteit van primase.
Iedereen die met straling werkt, moet een grondig inzicht hebben in de regelgeving en gevaren die gepaard gaan met het gebruik van ioniserende straling. Moet een opleiding volgen en moet werken met veiligheidsuitrusting.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een high-throughput methode voor het analyseren van de bindings- en katalytische eigenschappen van DNA primase met behulp van protein-DNA binding microarrays. De techniek combineert microarray technologie met biochemische analyses om inzichten te verschaffen in primase sequentie herkenning en RNA primer vorming.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleculair Biologie
- Genetica
Achtergrond
- DNA primase synthetiseert RNA primers op template DNA.
- Het begrijpen van primase bindingspatronen is cruciaal voor het ophelderen van zijn functie.
- High-throughput methoden kunnen traditionele biochemische benaderingen verbeteren.
- Microarray technologie maakt massale gegevensverzameling mogelijk over protein-DNA interacties.
Doel van het Onderzoek
- Om primase sequentie herkenningsplaatsen te herdefiniëren.
- Om bindingsefficiëntie te linken met enzymatische activiteit.
- Om high-throughput profilering te gebruiken voor een uitgebreide analyse.
Gebruikte Methoden
- Protein-DNA binding microarray experimenten.
- Biochemische analyses om RNA primer vorming te meten.
- High-throughput primase profilering (HTPP) methodologie.
- Gegevensanalyse om bindingspatronen te correleren met enzymactiviteit.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van specifieke DNA sequenties gebonden door primase.
- Correlatie tussen bindingsefficiëntie en RNA primer synthese.
- Massale gegevensverzameling verbetert het begrip van primase functie.
- Inzichten in de relatie tussen DNA sequentie selectie en enzymactiviteit.
Conclusies
- High-throughput methoden leveren waardevolle inzichten in enzymgedrag op.
- Het linken van bindingsgegevens met katalytische activiteit is essentieel voor het begrijpen van primase.
- Deze benadering kan worden toegepast op andere enzymen voor soortgelijke analyses.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput primase profiling (HTPP) enables scalable characterization of DNA sequence recognition by primase, linking binding specificity to functional output in RNA primer synthesis. This approach supports target validation in nucleic acid enzymology by providing quantitative, reproducible data on enzyme-DNA interactions that inform mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by correlating binding strength with enzymatic processivity, aiding portfolio triage for replication-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining primase recognition sequences and flanking context effects on binding strength.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative correlation of binding efficiency with RNA primer length and enzyme processivity.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying sequence determinants that yield productive primers extendable by DNA polymerase.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by mapping primase binding sites across thousands of DNA sequences.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through microarray-based binding data and concurrent activity measurements.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by combining PBM and primase activity assay in a scalable HTPP workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking primase sequence recognition to functional outcomes in Okazaki fragment formation.
- Preclinical Model Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by connecting DNA binding specificity to RNA primer synthesis activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by using binding and activity data to inform go/no-go decisions in replication-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
HTPP integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing scalable, quantitative insights into primase-DNA interactions that inform enzymatic function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through massive data on primase binding to DNA sequences.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs by correlating microarray binding data with RNA primer formation measurements.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that help teams compare binding strength across sequence variants and link to enzymatic activity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how sequence-specific binding influences functional primer synthesis in DNA replication.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project application in nucleic acid enzymology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in primase-DNA recognition.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding and activity measurements across diverse DNA sequences.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in replication-targeted drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative linking of binding efficiency to primer synthesis activity.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein-DNA interaction assays, microarray handling, and fluorescence detection.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microarray scanner, PBM chamber, and vacuum aspiration system.
- Cross-team standardization requirements for buffer composition, washing stringency, and fluorescence threshold setting.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primases from different organisms or engineered variants.
- Practical limitations supported by source material: washing steps must be subtle to preserve binding signals, and buffers must contain components that maintain primase-DNA interaction during assay.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
