Name: Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer de P3-amputatiemethode bij volwassen muizen om blastemavorming en intramembraneuze ossificatie te bestuderen. Dit model helpt onderzoekers regeneratieprocessen in zoogdieren analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van het Muneoka Lab en het Texas Institute for genomic Medicine (TIGM). Dit werk werd gesteund door Texas A & M University.

<ol><li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Paediatric+Journal%22%5BJournal%5D)">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li>
<li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalangeal+regrowth+in+rodents%3A+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li>
<li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarlson%2C+BM+%22Principles+of+Regenerative+Biology%22">Principles of Regenerative Biology</a>. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li>
<li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+%28Mus%29+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li>
<li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li>
<li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%3A+The+Official+Journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li>
<li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Trauma%22%5BJournal%5D)">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li>
<li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+And+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li>
<li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li>
<li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+Tip+Regeneration%3A+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
<li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ%3A+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure van volwassen muis distale P3 amputatie, fluorescerende immunohistochemische kleuring om blastema vorming en intramembraneuze ossificatie te visualiseren en te onderzoeken, en sequentieel in-vivo μCT scanning om Identificeer botmorfologische, volume-en lengte wijzigingen na amputatie. P3-amputatie is een uniek, procedureel eenvoudig en reproduceerbaar model om een Pro-regeneratieve wondomgeving te analyseren die blastema-vorming activeert. Bovendien biedt het P3-ci...

Zoogdieren, met inbegrip van mensen en muizen, hebben de capaciteit om de toppen van hun cijfers te regenereren na distale amputatie van de Terminal falanx (P3)1,2,3. Bij muizen is de regeneratie reactie amputatie-niveau afhankelijk; in toenemende mate van proximale cijfers wordt een geleidelijk verzwakte regeneratieve respons weergegeven totdat volledig regeneratief falen bij amputaties Romeinse en proximale naar de P3-nagel matrix4,5,6 , 7 , 8. P3-regeneratie wordt gemedieerd door de vorming van een blastema, gedefinieerd als een populatie van prolifererende cellen die morfogenese ondergaan om de geampuleerde structuren te regenereren9. De vorming van een blastema om de door amputatie verloren structuren te regenereren, een proces dat epimorfe regeneratie wordt genoemd, onderscheidt de P3-regeneratie respons op multi weefselniveau van de traditionele weefselherstel na blessure6, 10. P3-regeneratie is een reproduceerbaar en procedureel eenvoudig model om complexe regeneratieve processen te onderzoeken, waaronder wondgenezing11,12, bot histolysis11,12, revascularisatie13, perifere zenuw regeneratie14, en blastemal conversie naar bot via intramembraneuze ossificatie15.
Uit eerdere studies met immunohistochemie is gebleken dat de blastema heterogeen, avasculair, hypoxisch en zeer proliferatief is11,13,15,16. Na de distale P3-amputatie wordt de vroege blastema in eerste instantie geassocieerd met het P3-periosteum en endosteum en wordt gekenmerkt door een robuuste proliferatie en ontluikende osteogenese grenzend aan het botoppervlak15. Na botdegradatie en wondsluiting wordt de heterogene blastema gevormd door het samenvoegen van periostehoudende en endosteal geassocieerde cellen, gevolgd door de differentiatie van blastemale componenten, waaronder bot via intramembraneuze ossificatie 15.
Botreparatie in reactie op letsel treedt meestal op door endochondrale ossificatie, d.w.z. via een initiële kraakbeenachtige Callus die een sjabloon vormt voor daaropvolgende botvorming17,18. Lange botintramembraneuze ossificatie, d.w.z. botvorming zonder kraakbeen middel, wordt vaak geïnduceerd met behulp van complexe afleid inrichtingen of chirurgische fixatie19,20. De Digit-regeneratie respons is een preklinisch model dat voordelen biedt ten opzichte van conventionele intramembraneuze ossificatie modellen: 1) het vereist geen externe of interne fixatie post letsel om intramembraneuze ossificatie te stimuleren, 2) het is uitgevoerd met 4 cijfers van elk dier, waardoor monsters worden gemaximaliseerd terwijl het dier gebruik wordt geminimaliseerd, en 3) sequentiële in vivo microcomputer tomografie (μCT) analyse kan met gemak en snelheid worden uitgevoerd.
In de huidige studie tonen we het gestandaardiseerde P3-amputatie vlak om een reproduceerbare en robuuste regeneratie respons te bereiken. Daarnaast demonstreren we een geoptimaliseerd fluorescentie immunohistochemie protocol met behulp van paraffine secties om de vorming van blastema, revascularisatie in de context van regeneratie en de blastemal conversie naar het bot via intramembraneuze ossificatie. We demonstreren ook het gebruik van sequentieel in-vivo μCT om veranderingen in botmorfologie, volume en lengte in hetzelfde cijfer te identificeren in het verloop van de regeneratie. Het doel van dit protocol is om de vorming van zoogdieren blastema na amputatie te onderzoeken en om 2 technieken, fluorescentie immunohistochemie en sequentieel in vivo μCT te demonstreren, voor de studie van intramembraneuze botregeneratie.

<table><tbody><tr><td>Protein Block Serum Free</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>Klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>Mouse anti-PCNA antibody</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>1:2000 verdunning</td></tr><tr><td>Rat anti-CXCR4 antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB21651</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>1:800 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>1:400 verdunning</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>Surgipath Decalicifier 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Klaar voor gebruik</td></tr><tr><td>CD-1 Female Mouse</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>8-12 weken oud</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en intramembraneuze ossificatie van zoogdier blastema te onderzoeken

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen distale terminale falanx (P3) amputatie, een procedureel eenvoudig en reproduceerbaar zoogdier model van epimorfe regeneratie, dat blastema-vorming en intramembraneuze ossificatie omvat, geanalyseerd door fluorescentie immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie (μCT). De zoogdier regeneratie is beperkt tot amputaties die het distale gebied van de terminale falanx (P3) dwars doorkruisen; cijfers geampuleerd op meer proximale niveaus niet te regenereren en ondergaan fibrotische genezing en littekenvorming. De regeneratie respons wordt gemedieerd door de vorming van een proliferatieve blastema, gevolgd door botregeneratie via intramembraneuze ossificatie om de geampuleerde skelet lengte te herstellen. P3 amputatie is een preklinisch model om epimorfe regeneratie bij zoogdieren te onderzoeken, en is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van therapeutische strategieën om fibrotische genezing te vervangen door een succesvolle regeneratieve respons. Ons protocol maakt gebruik van fluorescentie immunohistochemie op 1) Identificeer vroege en late blastema celpopulaties, 2) Bestudeer revascularisatie in de context van regeneratie, en 3) onderzoek intramembraneuze ossificatie zonder de noodzaak van complexe botten stabilisatie apparaten. We demonstreren ook het gebruik van sequentiële in-vivo μCT om afbeeldingen met een hoge resolutie te maken om morfologische veranderingen na amputatie te onderzoeken, en om volume-en lengte veranderingen in hetzelfde cijfer te kwantificeren tijdens de regeneratie. Wij geloven dat dit protocol een enorm nut biedt om zowel epimorfe als weefsel regeneratieve reacties bij zoogdieren te onderzoeken.

Volwassen muis regenereert P3-cijfers bij 6/7 DPA(afbeelding 2a-D), 9 DPA(figuur 2e-H) en 10 DPA (figuur 2i-L) waren immunogekleurd met antilichamen tegen Runx2, OSX en pcna om intramembraneuze botten te visualiseren en immunobevlekt met antilichamen tegen CXCR4 en vWF om de vorming van blastema te visualiseren. Representatief μCT-weergave van de cijfers die zijn gescand vóór de amp...

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputatie is een preklinisch model voor het onderzoeken van zoogdier epimorfe regeneratie en een krachtig instrument voor het identificeren van kritische cel populaties en mechanismen die endogene regeneratie controle. Het P3-model maakt het mogelijk om vroege en late blastemalcelpopulaties, de studie van revascularisatie tijdens regeneratie en het onderzoek naar intramembraneuze ossificatie zonder complexe vereisten voor botstabilisatie te identificeren. Het aantonen van de procedure met mij zal Osama Qureshi, Alyssa Falck, en Katherine Zimmel, technicus, en Regina Brunaeur, een Research Assistant Professor allemaal uit ons laboratorium.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een acht tot 12 weken oude CD-1 muis, Breng zalf op de ogen van het dier en plaats de muis onder een 10X dissectie microscoop. Gebruik chirurgisch povidon jodium en 70% ethanol om de cijfers van elke achterpoot te steriliseren en microscissors te gebruiken om het haar weg te knippen van de chirurgische plaats. Breng een microliter van actuele bupivacaine lokaal aan om de chirurgische site te verdoven en speel voorzichtig een achterpoot om het mediale cijferoppervlak bloot te leggen.Vervolgens houdt u de scalpel in een hoek parallel aan het vetpad, gebruik een steriele nummer 10 scalpel om de distale punt van de terminale falanx van cijfers twee en vier te amputeren. Breng een extra microliter van bupivacaine lokaal aan op elk geamputeerd cijfer en breng de muis terug naar een schone kooi om de wonden te laten genezen zonder wondverband en met controle tot volledige recumbency. Om een succesvol P3 amputatievlak te garanderen, houdt u de scalpel parallel aan het vetkussen tijdens de amputatie en voert u micro-CT-scans uit om de juiste amputatielengte te bevestigen.Gebruik op het juiste experimentele eindpunt een scalpel om het cijfer halverwege het middelste falanxbot te verbreken bij ongeveer het tweede ventrale vetpadinspringing. Breng het weefsel over op een 20-milliliter scintillatie flacon met 10 milliliter vers gebufferd zinkformal fixatiemiddel gedurende 24 tot 48 uur. En gebruik een microtome om vier tot vijf micrometer dikke delen van elk cijfer te verwerven, waarbij de plakjes in een waterbad van 38 tot 41 graden Celsius worden geplaatst, aangevuld met een histologische lijmoplossing zoals ze worden verkregen.Leg vervolgens de plakjes vast op kleefplaten en plaats de dia's op een schuifwarmer van 37 graden Celsius om te drogen. Wanneer de dia's zijn gedeparaffiniseerd dompel de monsters onder in een kleurpot van een geschikte antigeen retrieval oplossing, en verwarm de dia's tot 95 graden Celsius gedurende 25 minuten ervoor te zorgen dat koken niet optreedt. Aan het einde van de incubatie, laat de pot te komen tot kamertemperatuur, en leg de dia's plat in een een-inch diep overdekte plastic schuifdoos met bevochtigd tissue papier aan de basis.Voeg 100 microliter voorverwarmde proteinase K toe aan elk monster. Bedek elke dia met een kleine strook parafilm om ervoor te zorgen dat de secties niet droog worden. Verwijder na 12 minuten bij 37 graden Celsius voorzichtig de paraffinefilm en laat de glijbanen voorzichtig uitlekken op tissuepapier om overtollige blokkeringsoplossing te verwijderen.Voeg vervolgens 100 tot 200 microliters van de primaire antilichaamoplossing toe die van belang is voor elke dia. Breng de locaties terug naar de bevochtigingskamer bedekt met paraffinefilm voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend na het wassen van de glijbanen in TRIS-gebufferde zoutoplossing plus TWEEN of TBST label de dia's met een passende secundaire antilichaamoplossing voor een 45 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de dia's in TBST en laat ze drogen. Gebruik vervolgens 100 microliters van anti-fade montagemedium om coverslips zorgvuldig op de gedroogde glijbanen te plaatsen en bewaar de glijbanen 's nachts plat bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om het montagemedium te laten drogen. Voor sequentiële in vivo micro-computertomografie of micro-CT outfit de micro-CT imager met buizen om zuurstof te laten stromen in en uit de micro-CT dierenkamer, ervoor te zorgen dat de uitstromende zuurstof is uitgerust met een actieve kool filter om de isoflurane val.Stel de Voxelsize in op 10,5 micrometer op 55 piekkiptenspanning en 145 microamps met 1.000 projecties per 180 graden en continue rotatie met een integratietijd van 200 milliseconden, wat resulteert in een maximum van 213 segmenten per scan. Wanneer de scanner klaar is, plaats dan voorzichtig de verdoofde muis in de micro-CT dierenkamer met de achterste ledematen cijfers gerangschikt in plat, sluit associatie ventrale kant omhoog met de linkerpoot aan de linkerkant en rechts aan de rechterkant van het scanplatform. Breng vervolgens chirurgische tape aan om de cijfers voorzichtig op hun plaats te zetten.Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier voordat u de scan initieert. Na het scannen, breng het dier terug naar een schone kooi met controle tot volledige recumbency, en laat tot enkele uren voor micro-CT beeldreconstructie. Voor analyse van de gereconstrueerde 3D-botafbeelding, met behulp van de software die met de micro-CT wordt geleverd, zet u de afbeeldingsbestanden om naar een reeks DICOM-bestanden.Wanneer alle bestanden zijn geconverteerd, downloadt u de DICOM-serie in één map met behulp van een batchbestandsdownloader in een webbrowser. Laad de BoneJ-plug-in in de map ImageJ-plug-in. Sleep en zet de map met de DICOM-bestandsreeks naar de ImageJ-balk om de bestanden te openen.Er wordt een 16-bits afbeeldingsstapel geopend die alle grijze waarden weergeeft. Als u alleen bot wilt weergeven, klikt u op Afbeelding aanpassen en Drempelwaarde. Schuif de bovenste drempelbalk naar rechts en pas de onderste drempelbalk aan totdat alleen het bot rood is gemarkeerd.De lagere drempelwaarde zal ongeveer 10.000 tot 13.000 zijn bij een maximale signaalintensiteit van 32, 767. Klik op Toepassen en klik in het nieuwe dialoogvenster op Zwarte achtergrond. Klik vervolgens op OK. Er wordt een acht-bits afbeelding met zwart-witwaarden gegenereerd.Met het wit dat overeenkomt met het bot. Teken een rechthoek rond het P3-bot om deze te selecteren en de stapel te dupliceren. Als u een 3D-afbeelding wilt genereren, klikt u op Plug-ins en 3D-viewer en gebruikt u het gereedschap uit de vrije hand om het te verwijderen bot te omcirkelen.Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Selectie vullen om onnodige bot uit de afbeelding bij te snijden. Als u het botvolume van de 3D-rendering wilt kwantificeren, opent u de BoneJ-plug-in en selecteert u Volumefractie. Er verschijnt een resultatenvenster en het botvolume wordt weergegeven in millimeters.Als u de botlengte van de 3D-rendering wilt kwantificeren, gebruikt u het gereedschap ImageJ-multipunt. Als u een afbeelding van de 3D-weergave wilt vastleggen, klikt u op Weergave en maakt u een momentopname. Sla de afbeelding vervolgens op als een TIF- of JPEG-bestand.In deze beelden werden delen van een volwassen muis die P3-cijfer regenereert immunostained met antilichamen om intramembraneuze botregeneratie en blastemavorming te visualiseren op dag zes tot zeven, negen en tien na amputatie. Hier worden representatieve micro-CT-renderings van cijfers getoond die vóór de amputatie en op verschillende tijdstippen in de loop van de regeneratie met oriëntatiepunten worden gebruikt om lengtemetingen te identificeren. Het muiscijfermodel is een krachtig systeem voor het analyseren van een pro-regeneratieve wondomgeving die blastemavorming activeert wanneer het op een distaal niveau wordt geamputeerd.Omgekeerd, proximale amputatie van de cijfers dient als een modelsysteem voor het onderzoeken van regeneratieve falen en een site voor het testen van strategieën voor het verbeteren van regeneratie.

adult-mouse-digit-amputation-regeneration-simple-model-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Diermodellen worden vaak gebruikt om ernstige botletsels na te bootsen in biomedisch onderzoek. Vanwege hun kleine formaat ligt het buiten de mogelijkheden van de meeste onderzoeksgroepen om gestabiliseerde botlaesies bij muizen te creëren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het vaststellen en analyseren van experimentele femorale defecten bij muizen.

A Simple Kritische-sized Femorale Defect Model in Muizen

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Een model van heterotope ossificatie voor Achilles-tenotomie en brandwonden maakt betrouwbaar onderzoek mogelijk naar door trauma geïnduceerde ectopische botvorming zonder de toepassing van exogene factoren.

Direct Mouse Trauma / Burn Model van heterotope botvorming

Hoewel muismodellen onschatbare hulpmiddelen zijn voor botweefselengineering, zijn modellen van lange botdefecten schaars. Deze behoefte motiveerde de ontwikkeling van het huidige protocol dat een vergrendelingsplaat met vier schroeven en een speciale jig gebruikt om een reproduceerbare, femorale, kritisch-grootte defect met lage morbiditeit uit te voeren en te stabiliseren.

Oprichting van een Segmentale Femorale Critical-size Defect Model in Muizen gestabiliseerd door plaatosteosynthese

Dit artikel beschrijft hoe een chirurgische methode kan worden uitgevoerd om de vorming van wondepidemis te remmen tijdens axolotl ledemaatregeneratie door de huid van volledige dikte onmiddellijk over het amputatievlak te hechten. Met deze methode kunnen onderzoekers de functionele rollen van de wondepidemis onderzoeken tijdens de vroege stadia van ledemaatregeneratie.

Remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens Axolotl Limb Regeneration

Dit protocol beschrijft een chirurgische ingreep voor het vaststellen van een diafysaire fractuur in het dijbeen van muizen, die wordt gestabiliseerd met een intramedullaire draad, voor onderzoeken naar fractuurgenezing.

Opstellen van een diafysair femurfractuurmodel bij muizen

Dit protocol demonstreert stapsgewijze details over het extraheren van de mandibulaire eerste kies in de muis. Het biedt een alternatieve methode voor onderzoekers die zich richten op kaakbotgenezing en -regeneratie.

De oprichting van een Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Een protocol voor femorale osteotomiechirurgie met behulp van interne plaatfixatie bij volwassen axolotls wordt gepresenteerd. De procedure kan worden gebruikt om vergelijkende studies uit te voeren naar de regeneratie van ledematen en de genezing van fracturen bij aquatische amfibieën.

Stabiliseren van een dijbeenosteotomie met een plaatfixatie bij Ambystoma mexicanum

In dit protocol laten we zien hoe axolotlweefsel kan worden voorbereid op atoomkrachtmicroscopie (AFM) en hoe indrukmetingen kunnen worden uitgevoerd in intact en regenererend kraakbeen van ledematen.

Atoomkrachtmicroscopie Metingen van kraakbeen in intacte en regenererende axolotl-ledematen

Het beenmergletselmodel bij muizen is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van postnatale osteogenese door middel van intramembraneuze ossificatie. Dit vereenvoudigde chirurgische protocol beschrijft de beenmergablatieprocedure voor stroomafwaartse beoordeling van nieuwe botvorming en cellulaire reacties na verwonding.

Verbeterde methodologie voor het bestuderen van postnatale osteogenese via intramembraneuze ossificatie in een beenmergletselmodel bij muizen

Het doel van deze studie was om een veilige en reproduceerbare chirurgische aanpak te standaardiseren voor het uitvoeren van een volledige transversale amputatie van de mandibula in Ambystoma mexicanum voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie.

Ontwerp en standaardisatie van een model voor mandibulair letsel voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie in het Ambystoma mexicanum model

Leer de P3-amputatiemethode bij volwassen muizen om blastemavorming en intramembraneuze ossificatie te bestuderen. Dit model helpt onderzoekers regeneratieprocessen in zoogdieren analyseren.

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken (Video) | JoVE Journal

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken

Meer video's verkennen