Name: Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer correlative licht- en volume-elektronenmicroscopie om mitochondriën en endoplasmatisch reticulum in cellen te visualiseren na genetische modificatie. Deze methode onthult 3D-organelverdeling en interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door het KBRI Basic Research Program door het Korea Brain Research Institute gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen en ICT (19-BR-01-08), en de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Korea Government (MSIT) (No. 2019r1a2c1010634). SCO1-APEX2 en HRP-kdel plasmiden werden vriendelijk aangeboden door Hyun-WoO Rhee (Seoul National University). De gegevens van TEM werden verworven bij Brain Research core facilities in KBRI.

1. celcultuur met patroon raster cultuur schotel en celtransfectie met SCO1-APEX2 en HRP-KDEL plasmide vector
<ol><li>Zaad 1 x 105 HEK293T cellen door ze in 35-mm glazen rooster bodem cultuur gerechten te plaatsen in een bevoficeerde atmosfeer met 5% Co2 bij 37 °C in Dulbecco's gemodificeerde EAGLE'S medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml penicillaire, en 100 U/mL streptomycine.</li>
	<li>De dag na het zaaien van de cellen, wanneer ze zijn gegroeid tot 50%-60% confluency, introduceren de SCO1-APEX210 en HRP-kdel12 plasmide cellen met behulp van transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-kdel plasmide DNA 0,5 μg per 3 μL transfectie-reagens).</li>
</ol>2. lichte microscopie van cellen die groeien op gedessineerde cultuur gerechten en DAB-kleuring voor APEX2 en HRP
<ol><li>Bij 16-24 h na transfectie, verwijder alle kweekmedia en voeg onmiddellijk 250 μL warme (30-37 °C) fixatie oplossing (tabel 1) toe door voorzichtig pipetteren. Verwijder onmiddellijk de fixatie oplossing en vervang deze door 1,5 mL verse fixatie oplossing. Incuberen op ijs voor 60 min, en was driemaal gedurende 10 min elk in 1 mL ijskoude 0,1 M natrium cacodylate buffer (tabel 1). Let op: aldehyde dampen zijn uiterst giftig. Voer alle werkzaamheden uit onder een geventileerde rook afzuigkap.</li>
	<li>Voeg 1 mL koude (0-4 °C) 20 mM Glycine-oplossing toe en inbroed gedurende 10 minuten op ijs gevolgd door drie Wassers van 5 min elk in 1 mL koude 0,1 M natrium cacodylate buffer.</li>
	<li>Bereid een verse 1x DAB-oplossing (3,33 mL 0,3 M cacodylate oplossing + 10 μL van 30% H2O2 + 5,67 ml koud water + 1 ml 10x DAB-oplossing).</li>
	<li>Voeg 500 μL van de vers bereide 1x DAB-oplossing (stap 2,3) toe en inincuberen op ijs gedurende ongeveer 5-45 min tot een licht bruine vlek zichtbaar is onder een omgekeerde lichtmicroscoop (Figuur 1a).</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de DAB-oplossing en spoel drie keer met 1 mL koude 0,1 M natrium cacodylate-buffer gedurende 10 minuten per stuk.</li>
	<li>Gebruik een omgekeerde Microscoop met fase contrast (of een lichtmicroscoop met lichtveld) om de DAB-kleuring te visualiseren bij een vergroting van 100x of hoger. Gebruik een markeerstift om de bodem van het glas te markeren waar het interessegebied (ROI) zich bevindt (Figuur 1b, C).</li>
</ol>3. monstervoorbereiding voor het EM-blok
<ol><li>Voer celkweek en DAB-kleuring uit zoals beschreven in stap 2.1-2.6.</li>
	<li>Post-Fix de monsters met 1 mL 2% verminderde OsO4 voor 1 uur bij 4 °c. Let op: OsO4 dampen zijn zeer giftig. Voer alle werkzaamheden uit onder een geventileerde rook afzuigkap.</li>
	<li>Bereid een nieuwe TCH oplossing (tabel 1) tijdens stap 3,2 en passeren een 0,22-μm filter. Let op: TCH dampen zijn zeer giftig. Voer alle werkzaamheden uit onder een geventileerde rook afzuigkap.</li>
	<li>Verwijder het fixeermiddel en spoel driemaal met 1 mL gedistilleerd water gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Plaats de cellen in 1 mL van eerder bereide en gefilterde TCH oplossing gedurende 20 minuten bij RT.</li>
	<li>Spoel de cellen driemaal met 1 mL gedistilleerd water gedurende 5 minuten per RT.</li>
	<li>Stel de cellen een tweede keer bloot aan 1 mL van 2% osmium tetroxide in gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Verwijder het fixeermiddel en spoel driemaal met 1 mL gedistilleerd water gedurende 5 minuten per RT. Voeg 1 mL 1% uranylacetaat (waterig) toe en laat 's nachts bij 4 °C in het donker.</li>
	<li>Was de cellen driemaal in 1 mL gedistilleerd water gedurende 5 minuten per RT.</li>
	<li>Pre-warme Walton-lood aspartaat oplossing (tabel 1) in een oven bij 60 °c gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Beits de cellen met de lood aspartaat oplossing van Walton door 1 ml van de voorverwarmde lood aspartaat oplossing toe te voegen en plaats vervolgens 30 minuten in een oven bij 60 °c.</li>
	<li>Spoel de cellen driemaal met 1 mL gedistilleerd water gedurende 5 minuten per RT.</li>
	<li>Inincuberen in een gesorteerde reeks van 2 mL ethanol aliquots (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) voor 20 min elk op RT.</li>
	<li>Decanteren het ethanol en inbroed 30 min in 1 mL 3:1 ethanol: laag Viscositeits mengsel bij RT.</li>
	<li>Verwijder het medium en voeg 1 mL 1:1 ethanol: laag Viscositeits mengsel medium toe. Inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Verwijder het medium en voeg 1 mL 1:3 ethanol: laag Viscositeits mengsel medium toe. Inincuberen gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Verwijder het medium en voeg 1 mL 100% laag-viscositeit insluitings medium toe en incuberen 's nachts.</li>
	<li>Sluit het monster in 100% insluitings mengsel met lage viscositeit en incuberen gedurende 24 uur bij 60 °C.</li>
	<li>Bereid 90-nm dikke delen met behulp van een ultramicrotome.</li>
	<li>Let op het rooster onder TEM bij 200 kV.</li>
</ol>4. seriële snij-en montage op indium-tin-oxide gecoate dekstroken voor SEM-beeldvorming
<ol><li>
Voorbereiding van de ondergrond
	<ol>
<li>Reinig indium-tin-oxide (ITO) gecoate glazen dekstroken (22 mm x 22 mm) door zachtjes te schudden in isopropanol voor 30-60 s.</li>
		<li>Verwijder de dekstroken, giet het overtollige isopropanol af en laat in een stofvrije omgeving drogen.</li>
		<li>Behandel de glazen dekstroken met ITO-coating door Glow discharge met een plasma coater gedurende 1 min. Opmerking: het activeren van het plasma verleent een hydrofiele eigenschap op het substraat oppervlak. Het creëert een zeer dun laagje water op het substraat om rimpelvorming in de secties te voorkomen wanneer de sectie aan het substraat is bevestigd.</li>
		<li>Steek de met ITO gecoate glazen dekstroken in de substraat houder en plaats deze in de mesboot.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trimmen van het monster blok en het seriensectioneren
	<ol>
<li>Steek het monster blok in de monsterhouder van de ultramicrotome en zet het in het trim blok.</li>
		<li>Gebruik een scheermesje om alle overtollige hars rond de doelpositie af te knippen (geïdentificeerd in stap 2,6, figuur 1d-G). De vorm van het blok gezicht moet trapeziumvormig of rechthoekig zijn. De voor rand en de Volg rand moeten absoluut parallel zijn (figuur 1h, I).</li>
		<li>Steek de monsterhouder op de arm van de ultramicrotome en plaats het diamantmes in de meshouder. Steek de ITO glas dekstroken in de lint drager en klem de drager met de hendel (figuur 1J). Stel de lint drager in de mesboot en vul de mesboot met gefilterd gedistilleerd water (figuur 1k).</li>
		<li>Pas de draag positie aan met de glijbaan van het mes door de hendel van de houder voorzichtig te duwen om de rand van het ITO-glas in de buurt van het mes te zetten (figuur 1L).</li>
		<li>Na het snijden van de sectie, stop het snijproces, en open langzaam de klemschroef van de buis en afvoer van de water boot (debiet van één druppel water per seconde).</li>
		<li>Na voltooiing van het lint-verzamelingsproces, verwijder het substraat met de hendel van de klem inrichting en droog het lint (afbeelding 1M).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. beeldvorming in de SEM en uitlijning van de SEM-beeld stapel
<ol><li>Monteer de met ITO gecoate dekslip op aluminium met kleverige Carbon tape. Sluit het glasoppervlak en het oppervlak in de stub af met kleverige koolstof tape en vervolgens met een dikke koolstof laag van 10 nm (figuur 1N).</li>
	<li>Observeer de met ITO gecoate dekslip in een veld emissie SEM bij een lage acceleratie spanning van 5 kV en een geschikte werkafstand voor de efficiënte verzameling van BSEs.</li>
	<li>Importeer de seriële afbeeldingen in de afbeelding J software (Fiji)13 met behulp van de virtuele stack optie. Open een nieuwe TrakEM14en importeer de afbeeldingsstapel in trakem. Klik met de rechtermuisknop en kies het menu Uitlijnen .</li>
	<li>Selecteer vervolgens het afbeeldings bereik (van de eerste afbeelding tot de laatste afbeelding). Voltooi de automatische uitlijning, sla de uitgelijnde gegevensset op en kies exporteren om een platte afbeelding te compileren van het geselecteerde afbeeldings bereik (van de eerste afbeelding tot de laatste afbeelding). Sla ten slotte de platte afbeeldingsgegevens op in AVI-indeling in het hoofdmenu van afbeelding J. Opmerking: aanvullende film 1 en aanvullende film 2 tonen respectievelijk de SEM-afbeeldings stack en bijgesneden afbeeldings stack.</li>
</ol>6. segmentatie van mitochondriën en ER van seriële beelden
<ol><li>Start de 3dmod in IMOD15 -software en open afbeeldingsbestanden.</li>
	<li>In het ZaP-venster, teken de contour van de mitochondriën en ER met behulp van de middelste muisknop.</li>
	<li>Als u het gesegmenteerde volume wilt visualiseren, opent u het venster model weergave (aanvullende film 3).</li>
</ol>

<ol><li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li>
<li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care%3A+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Qualitative+Studies+on+Health+and+Well-being%22%5BJournal%5D)">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
<li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li>
<li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923(2015).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).</li>
<li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het bepalen van de cellulaire lokalisatie van specifieke eiwitten bij een nanometer-resolutie met EM is cruciaal om de cellulaire functies van eiwitten te begrijpen. Over het algemeen zijn er twee technieken om de lokalisatie van een doel proteïne via EM te bestuderen. Een daarvan is de immunogold-techniek, die sinds 1960 in EM is gebruikt, en de andere is een techniek die recent ontwikkelde genetisch gecodeerde tags16bevat. Traditionele immunogold-technieken hebben antilichamen geconjugeerde goud...

Mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER) zijn membranen gebonden cellulaire organellen. Hun verbinding is noodzakelijk voor hun functie, en eiwitten met betrekking tot hun netwerk zijn beschreven1. De afstand tussen de mitochondriën en ER is gerapporteerd als ongeveer 100 nm met behulp van Lichtmicroscopie2; echter, recente super-resolution microscopie3 en elektronenmicroscopie (em)4 studies hebben aangetoond dat het aanzienlijk kleiner, bij ongeveer 10-25 nm. De resolutie die is bereikt in superresolutie microscopie is lager dan EM, en specifieke labeling is noodzakelijk. EM is een geschikte techniek om een voldoende hoge-resolutie contrast te bereiken voor structurele studies van de verbindingen tussen mitochondriën en ER. Een nadeel is echter de beperkte z-as-informatie, omdat de dunne delen ongeveer 60 Nm of dunner moeten zijn voor conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Voor voldoende EM-z-asbeeldvorming kan drie-dimensionale elektronenmicroscopie (3DEM) worden gebruikt5. Dit impliceert echter de voorbereiding van honderden dunne seriële secties van hele cellen, wat erg lastig werk is dat slechts een paar bekwame technologen onder de knie hebben. Deze dunne delen worden verzameld op fragiele formvar filmomhulde One-hole TEM roosters. Als de film breekt op één gird, is seriële beeldvorming en volume reconstructie niet mogelijk. Serie Block-face scanning electron microscopie (sbem) is een populaire techniek voor 3dem die gebruik maakt van destructief en bloc snijden in de Scanning Electron Microscoop (SEM) vacuümkamer met ofwel een diamantmes (dik-sbem) of een gerichte ionen straal (FIB-SEM) 6. omdat deze technieken echter niet beschikbaar zijn op alle faciliteiten, raden we array computertomografie7 aan met behulp van Serial snij en SEM. In array tomografie worden seriële secties die met behulp van een ultramicrotome worden afgesneden, overgebracht naar een glazen afdekplaat in plaats van een TEM-raster en gevisualiseerd via Lichtmicroscopie en SEM8. Om het signaal voorbeeld vorming met Backscatter Electron (BSE) te verbeteren, gebruikten we een en bloc EM-kleurings protocol met osmium tetroxide (OsO4)-vaste cellen met osmiofiele thiocarbohydrazide (tch)9, waardoor we beelden kunnen verkrijgen zonder dubbele kleuring na inbedding.
Bovendien, de mitochondriale marker SCO1 (cytochroom c oxidase assembly eiwit 1) – ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)10 moleculaire tag werd gebruikt om te visualiseren van mitochondriën op het em-niveau. APEX2 is ongeveer 28 kDa en is afgeleid van soja ascorbaat peroxidase11. Het werd ontwikkeld om de gedetailleerde locatie van specifieke eiwitten op het EM-niveau te tonen, op dezelfde manier dat groen fluorescerend eiwit-gelabeld eiwit wordt gebruikt in lichte microscopie. APEX2 zet 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) om in een onoplosbaar osmiofiele polymeer op de plaats van de tag in aanwezigheid van de cofactor waterstofperoxide (H2O2). APEX2 kan worden gebruikt als alternatief voor traditionele antilichaam etikettering in EM, met een eiwit lokalisatie door de gehele diepte van de hele cel. Met andere woorden, het APEX2-Tagged eiwit kan worden gevisualiseerd door specifieke osmication11 zonder immunogold labeling en permeabilization na Ultra-cryosnijden. Mierikswortelperoxidase (HRP) is ook een gevoelige tag die de H2O2-afhankelijke polymerisatie van DAB in een gelokaliseerd precipitaat KATALYSEERT, waardoor em-contrast wordt gegeven na behandeling met OsO4. De ER-doel peptide sequentie HRP-KDEL (Lys-ASP-glu-Leu)12 werd toegepast om er binnen een hele cel te visualiseren. Om ons protocol te evalueren van het gebruik van genetische Tags en en bloc-kleuring met gereduceerde osmium en TCH (rOTO-methode), met behulp van het osmication-effect op hetzelfde moment, vergeleken we het membraan contrast met en zonder het gebruik van elk genetisch label in rOTO en bloc-kleuring. Hoewel 3dem met array computertomografie en DAB-kleuring met Apex en HRP respectievelijk zijn gebruikt voor andere doeleinden, is ons protocol uniek omdat we array computertomografie hebben gecombineerd voor 3dem en DAB-kleuring voor mitochondriën en er-labeling. Concreet toonden we vijf cellen met en zonder APEX-Tagged genen in dezelfde sectie, die hielp bij het onderzoeken van het effect van de genetische modificatie op cellen.

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16200</td><td>Gebruik alleen in afzuigkap</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMS</td><td>19210</td><td>Gebruik alleen in afzuigkap</td></tr><tr><td>Sodium cacodylate</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 4 % waterige oplossing</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>Gebruik alleen in afzuigkap</td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td></tr><tr><td>Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Gevaarlijke chemische stof</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>35 mm gerasterde dekglasschotel</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Formvar koolstof gecoat koperrooster</td><td>Ted Pella</td><td>01805-F</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>SIGMA</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime; -diaminobenzamidine (DAB)</td><td>SIGMA</td><td>D8001</td><td>Gevaarlijke chemische stof</td></tr><tr><td>30% Waterstofperoxide oplossing</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Kalium hexacyanoferrate(II) trihydraat</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>0.22 µm spuitfilter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbonyldihydrazide</td><td>SIGMA</td><td>223220</td><td>Gebruik alleen in afzuigkap</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>Fluka</td><td>10193426</td><td></td></tr><tr><td>L-asparaginezuur</td><td>SIGMA</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscopie</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>Indium tin oxide (ITO) gecoat glasdekjes</td><td>SPI</td><td>06489-AB</td><td>breekbaar glas</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmes</td><td>Leica</td><td>AT-4</td><td></td></tr><tr><td>Inverted lichtmicroscopie</td><td>Nikon</td><td>ECLipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscopie</td><td>Zeiss</td><td>Auriga</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriën en endoplasmisch reticulum beeldvorming door correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellulaire organellen, zoals mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER), maken een netwerk om een verscheidenheid van functies uit te voeren. Deze sterk gebogen structuren worden in verschillende vormen gevouwen om een dynamisch netwerk te vormen, afhankelijk van de cellulaire omstandigheden. Visualisatie van dit netwerk tussen mitochondriën en ER is geprobeerd met behulp van super-resolutie fluorescentie Imaging en lichte microscopie; echter, de beperkte resolutie is onvoldoende om te observeren van de membranen tussen de mitochondriën en ER in detail. Transmissie elektronenmicroscopie zorgt voor een goede membraan contrast en nanometer-schaal resolutie voor de waarneming van cellulaire organellen; het is echter uitzonderlijk tijdrovend bij het beoordelen van de driedimensionale (3D) structuur van sterk gebogen organellen. Daarom observeerden we de morfologie van mitochondriën en ER via correlatieve licht-elektronenmicroscopie (CLEM) en volume-elektronenmicroscopie technieken met behulp van verbeterde ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring. Een en bloc-kleurings methode, ultradunne seriële snede (array tomografie) en volume-elektronenmicroscopie werden toegepast om de 3D-structuur te observeren. In dit protocol, we suggereren een combinatie van CLEM en 3D elektronenmicroscopie gedetailleerde structurele studies van mitochondriën en ER uit te voeren.

In Figuur 1 wordt het schema en de werkstroom voor dit protocol beschreven. Het protocol vereist 7 dagen; afhankelijk van de tijd die is besteed aan SEM-beeldvorming, kan dit echter toenemen. Voor de celtransfectie moet de confluentie van de cellen zodanig worden geregeld dat de bodem van de gehele rooster plaat niet wordt Bedek (Figuur 1a). Een hoge celdichtheid kan de identificatie van de cel van belang tijdens lichte Microscoop en EM-observatie voorkomen. We gebruikten genetisch gelab...

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Dit volume elektronenmicroscopie techniek wordt gebruikt om biologische studies die de observatie van een 3D-structuur vereisen uit te voeren. Het aanbieden van een staaf, velder weergave, en voorbeeld opslag voordat de afbeelding herkansingen. Fx2 Asan heeft de padfasen ontworpen die de destabilisatie katalyseren om de elektronentest van doelstructuren te verhogen en kan worden gebruikt om een specifiek doelwit van belang te vinden.Deze deeltjes combineren het gebruik van correlerend licht en 3D elektronenmicroscopietechniek om de interacties tussen membranous organellen en gastheercellen te onderzoeken. 16 tot 24 uur na transfectie, was de cultuur voorzichtig met 250 microliter van 30 tot 37 graden Celsius fixatieoplossing. Snel vervangen van de was met 1,5 milliliter verse fixatie oplossing, en het plaatsen van de cultuur op ijs voor 30 minuten.Aan het einde van de incubatie spoelt u de cellen met drie tien minuten wasbeurten in één milliliter ijskoude 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt een milliliter ijskoude 0 tot 4 graden Celsius 20 millimolar glycine-oplossing toe aan de schotel voor een incubatie van tien minuten op ijs, gevolgd door drie vijf minuten wasbeurten met één milliliter verse, koude 0,1 molaire natriumcaodiebuffer per wasbeurt. Label vervolgens de cellen met 500 microliters vers bereide DAB-oplossing.En broeden de cellen op ijs voor ongeveer vijf tot vijfenveertig minuten. Wanneer een lichtbruine vlek zichtbaar is onder een omgekeerde lichtmicroscoop, spoel de cellen drie keer met een milliliter verse, koude 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer gedurende tien minuten per wasbeurt. Gebruik vervolgens een omgekeerde microscoop voor fasecontras om de DAB-kleuring te visualiseren bij een vergroting van 100 keer of hoger en markeer de onderkant van het glas waar het interessegebied zich bevindt.Voor elektronenmicroscoop blok monster voorbereiding, eerste post-fix de cellen met een milliliter van 2%verminderde osmium tetroxide voor een uur op vier graden Celsius. Spoel aan het einde van de fixatie de cellen af met drie wasbeurten van vijf minuten en één milliliter vers gedestilleerd water per wasbeurt. Voor de behandeling van de cellen met een milliliter gefilterde TCH-oplossing gedurende 20 minuten.Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in gedestilleerd water zoals net aangetoond en bevestig de cellen met een 30-minuten incubatie in 2%verminderde osmiumtetroxide. Aan het einde van de tweede fixatie, was de cellen drie keer met gedestilleerd water en bedek de cultuur met een milliliter waterige 1%uranylacetaat 's nachts bij 4 graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de cellen drie keer met gedestilleerd water voor het bevlekken met een milliliter van 60 graden Celsius opgewarmd Walton's lood aspartaat oplossing voor 30 minuten in een 60 graden Celsius oven.Aan het einde van de incubatie was je de cellen drie keer in gedestilleerd water. En de cultuur uitbroeden in een gesorteerde serie van 20 minuten 2 milliliter ethanol aliquots. Na de laatste blootstelling aan 100% ethanol, de cellen gedurende 30 minuten in één milliliter van drie tot één ethanol tot een lage viscositeit die het mengselmedium bij kamertemperatuur inbeslagneemt.Vervang aan het einde van de incubatie het medium door een milliliter één-op-één ethanol tot laag viscositeit inbeddingsmedium voor nog eens 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Vervang vervolgens het medium door één millilter van één tot drie ethanol tot een lage viscositeit die het mengselmedium gedurende nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur inbedding krijgt. Vervang vervolgens het medium door een milliliter van 100% lage viscositeit inbedding medium 's nachts, gevolgd door inbedding van het monster in 100% lage viscositeit inbedding mengsel voor 24 uur op 60 graden Celsius.Voor transmissie elektronen microscopie analyse, de volgende dag, gebruik maken van een ultra microtome om 90 nanometer dikke secties te verkrijgen en het raster te observeren onder transmissie elektronenmicroscopie op 200 kilovolt. Voordat u begint met de monsterbereiding, moet u 30 tot 60 seconden de indiumoxide gecoate glazen covers met zachte agitatie in isopropanol reinigen. Aan het einde van de agitatie, afvoer van de overtollige alcohol en plaats de coverslips in een stofvrije omgeving.Wanneer de covers droog zijn, gebruik dan een plasmacoater om de covers van de covers gedurende één minuut te gloeien. Steek vervolgens de covers in de substraathouder en plaats de substraathouder in de messenboot. Als u monsters wilt verkrijgen voor het scannen van elektronenmicroscopie, voegt u het ingesloten monsterblok in de monsterhouder van de ultramicrotome.En zet de houder in het trimblok. Gebruik een scheermesje om de overtollige hars rond de doelpositie weg te knippen, zodat het gezicht van het blok een trapeziumvormige of rechthoekige vorm krijgt. De voor- en achterranden moeten strikt parallel aan elkaar zijn.Het is niet eenvoudig om een groot aantal seriële secties te verwerven. Echter, je moet de voorste randen en trailing randen volledig parallel. Plaats vervolgens de monsterhouder in de arm van de ultramicrotome.Plaats het diamantmes in de messenhouder en vul de messenboot met gefilterd water. Druk vervolgens voorzichtig op het handvat van de houder om de draagpositie aan te passen, zodat de rand van de covers vlak bij het mes ligt. Na het verkrijgen van het monster, stop het doorsnedeproces, open langzaam de klemschroef van de buis en laat de waterboot leeglopen.Wanneer het lintinzamelingsproces is voltooid, verwijdert u het substraat met het handvat van het klemapparaat en droogt u het lint. Het gebruik van genetisch gelabelde plasmiden die proteïnen van belang uitdrukken, maakt het mogelijk de transfected doelcellen te identificeren na het bevlekken van de getagde eiwitten. Correlative licht elektronenmicroscopie kan vervolgens worden gebruikt om de gelabelde celcultuur verder te visualiseren.De donkere vlek die door SCO1-APEX2 wordt gegenereerd, wordt bijvoorbeeld uitsluitend waargenomen in de mitochondriale intermembraneruimte en niet in de matrixruimte van de mitochondriën. Code transfected cellen met zowel SCO1-APEX2 en HRP-KDEL plasmiden uitdrukken een zeer dicht elektronensignaal in de mitochondriale intermembrane ruimte en de endoplasmische reticulum. Er wordt echter geen endoplasmische reticulumkleuring waargenomen in cellen die alleen met SCO1-APEX2 worden doorsneden.Voor seriële beeldvorming door het scannen van elektronenmicroscopie wordt een overzicht van het hele arraybeeld gemaakt met behulp van een backscatter elektronendetector over een groot gebied. Vervolgens wordt het gebied van belang geplaatst in het eerste deel en gepropageerd naar alle andere secties. Ten slotte wordt het interessegebied met vijf doelcellen afgebeeld met vijf nanometerafbeeldingen pixels.Vergroting onthult gedetailleerde subcellulaire structuren zoals het Golgi-apparaat, mitochondriën en endpolasmisch reticulum. Seriële beeldvorming toont duidelijk aan dat endoplasmische reticulum-mitochondriën contacten optreden op verschillende z-vlakken. Je moet een goed begrip hebben van hoe je een specifieke doelstructuur lokaliseren met behulp van correlatief licht en elektronenmicroscopie om de effecten van een specifieke identiteitswijziging te onderzoeken.Deze kleuringstechnieken in combinatie met volume elektronenmicroscopie kunnen worden gebruikt voor em op grotere schaal om cellulaire interacties te onderzoeken, met name in het eurovirus. Vergeet niet de glutaraldehyde, ook enteterocide en TCH zijn zeer giftig, dus zorg ervoor dat beschermende kleding te dragen en om te werken in een rookkap bij het gebruik van deze materialen.

mitochondria-endoplasmic-reticulum-imaging-correlative-light-volume

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De CLEM techniek is aangepast aan ultrastructurele morfologie van membranen, organellen, en subcellulaire structuren die door microgeïnjecteerde moleculen analyseren. Deze methode combineert de krachtige technieken van micromanipulatie / micro-injectie, confocale fluorescentie microscopie, en elektronenmicroscopie zodat millimeter tot multi-nanometer resolutie. Deze techniek is ontvankelijk voor een groot aantal toepassingen.

Correlatieve licht-en elektronenmicroscopie (CLEM) als een hulpmiddel om gemicroinjecteerd Moleculen en hun Eukaryotische Subcellulaire Doelen Visualiseer

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Er wordt een methode beschreven waarbij quantum dot (QD) nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor correlatieve immunocytochemische studies van in epoxy ingebed weefsel van menselijke pathologie. We gebruiken commerciële antilichaamfragment-geconjugeerde QD's die worden gevisualiseerd door breedveldfluorescentielichtmicroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Een eenvoudig en uitgebreid protocol om driedimensionale details van membraancontactplaatsen tussen organellen in hepatocyten uit de lever of cellen in andere weefsels te verkrijgen.

Driedimensionale karakterisering van interorganelle contactplaatsen in hepatocyten met behulp van seriële sectie elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie, met de nadruk op de structurele kenmerken van retinale fotoreceptorterminals.

Voorbereiding van netvliesmonsters voor volume-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Leer correlative licht- en volume-elektronenmicroscopie om mitochondriën en endoplasmatisch reticulum in cellen te visualiseren na genetische modificatie. Deze methode onthult 3D-organelverdeling en interacties.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen