Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Dit volume elektronenmicroscopie techniek wordt gebruikt om biologische studies die de observatie van een 3D-structuur vereisen uit te voeren. Het aanbieden van een staaf, velder weergave, en voorbeeld opslag voordat de afbeelding herkansingen. Fx2 Asan heeft de padfasen ontworpen die de destabilisatie katalyseren om de elektronentest van doelstructuren te verhogen en kan worden gebruikt om een specifiek doelwit van belang te vinden.

Deze deeltjes combineren het gebruik van correlerend licht en 3D elektronenmicroscopietechniek om de interacties tussen membranous organellen en gastheercellen te onderzoeken. 16 tot 24 uur na transfectie, was de cultuur voorzichtig met 250 microliter van 30 tot 37 graden Celsius fixatieoplossing. Snel vervangen van de was met 1,5 milliliter verse fixatie oplossing, en het plaatsen van de cultuur op ijs voor 30 minuten.

Aan het einde van de incubatie spoelt u de cellen met drie tien minuten wasbeurten in één milliliter ijskoude 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt een milliliter ijskoude 0 tot 4 graden Celsius 20 millimolar glycine-oplossing toe aan de schotel voor een incubatie van tien minuten op ijs, gevolgd door drie vijf minuten wasbeurten met één milliliter verse, koude 0,1 molaire natriumcaodiebuffer per wasbeurt. Label vervolgens de cellen met 500 microliters vers bereide DAB-oplossing.

En broeden de cellen op ijs voor ongeveer vijf tot vijfenveertig minuten. Wanneer een lichtbruine vlek zichtbaar is onder een omgekeerde lichtmicroscoop, spoel de cellen drie keer met een milliliter verse, koude 0,1 molaire natriumcaanoodylaatbuffer gedurende tien minuten per wasbeurt. Gebruik vervolgens een omgekeerde microscoop voor fasecontras om de DAB-kleuring te visualiseren bij een vergroting van 100 keer of hoger en markeer de onderkant van het glas waar het interessegebied zich bevindt.

Voor elektronenmicroscoop blok monster voorbereiding, eerste post-fix de cellen met een milliliter van 2%verminderde osmium tetroxide voor een uur op vier graden Celsius. Spoel aan het einde van de fixatie de cellen af met drie wasbeurten van vijf minuten en één milliliter vers gedestilleerd water per wasbeurt. Voor de behandeling van de cellen met een milliliter gefilterde TCH-oplossing gedurende 20 minuten.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in gedestilleerd water zoals net aangetoond en bevestig de cellen met een 30-minuten incubatie in 2%verminderde osmiumtetroxide. Aan het einde van de tweede fixatie, was de cellen drie keer met gedestilleerd water en bedek de cultuur met een milliliter waterige 1%uranylacetaat 's nachts bij 4 graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de cellen drie keer met gedestilleerd water voor het bevlekken met een milliliter van 60 graden Celsius opgewarmd Walton's lood aspartaat oplossing voor 30 minuten in een 60 graden Celsius oven.

Aan het einde van de incubatie was je de cellen drie keer in gedestilleerd water. En de cultuur uitbroeden in een gesorteerde serie van 20 minuten 2 milliliter ethanol aliquots. Na de laatste blootstelling aan 100% ethanol, de cellen gedurende 30 minuten in één milliliter van drie tot één ethanol tot een lage viscositeit die het mengselmedium bij kamertemperatuur inbeslagneemt.

Vervang aan het einde van de incubatie het medium door een milliliter één-op-één ethanol tot laag viscositeit inbeddingsmedium voor nog eens 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur. Vervang vervolgens het medium door één millilter van één tot drie ethanol tot een lage viscositeit die het mengselmedium gedurende nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur inbedding krijgt. Vervang vervolgens het medium door een milliliter van 100% lage viscositeit inbedding medium 's nachts, gevolgd door inbedding van het monster in 100% lage viscositeit inbedding mengsel voor 24 uur op 60 graden Celsius.

Voor transmissie elektronen microscopie analyse, de volgende dag, gebruik maken van een ultra microtome om 90 nanometer dikke secties te verkrijgen en het raster te observeren onder transmissie elektronenmicroscopie op 200 kilovolt. Voordat u begint met de monsterbereiding, moet u 30 tot 60 seconden de indiumoxide gecoate glazen covers met zachte agitatie in isopropanol reinigen. Aan het einde van de agitatie, afvoer van de overtollige alcohol en plaats de coverslips in een stofvrije omgeving.

Wanneer de covers droog zijn, gebruik dan een plasmacoater om de covers van de covers gedurende één minuut te gloeien. Steek vervolgens de covers in de substraathouder en plaats de substraathouder in de messenboot. Als u monsters wilt verkrijgen voor het scannen van elektronenmicroscopie, voegt u het ingesloten monsterblok in de monsterhouder van de ultramicrotome.

En zet de houder in het trimblok. Gebruik een scheermesje om de overtollige hars rond de doelpositie weg te knippen, zodat het gezicht van het blok een trapeziumvormige of rechthoekige vorm krijgt. De voor- en achterranden moeten strikt parallel aan elkaar zijn.

Het is niet eenvoudig om een groot aantal seriële secties te verwerven. Echter, je moet de voorste randen en trailing randen volledig parallel. Plaats vervolgens de monsterhouder in de arm van de ultramicrotome.

Plaats het diamantmes in de messenhouder en vul de messenboot met gefilterd water. Druk vervolgens voorzichtig op het handvat van de houder om de draagpositie aan te passen, zodat de rand van de covers vlak bij het mes ligt. Na het verkrijgen van het monster, stop het doorsnedeproces, open langzaam de klemschroef van de buis en laat de waterboot leeglopen.

Wanneer het lintinzamelingsproces is voltooid, verwijdert u het substraat met het handvat van het klemapparaat en droogt u het lint. Het gebruik van genetisch gelabelde plasmiden die proteïnen van belang uitdrukken, maakt het mogelijk de transfected doelcellen te identificeren na het bevlekken van de getagde eiwitten. Correlative licht elektronenmicroscopie kan vervolgens worden gebruikt om de gelabelde celcultuur verder te visualiseren.

De donkere vlek die door SCO1-APEX2 wordt gegenereerd, wordt bijvoorbeeld uitsluitend waargenomen in de mitochondriale intermembraneruimte en niet in de matrixruimte van de mitochondriën. Code transfected cellen met zowel SCO1-APEX2 en HRP-KDEL plasmiden uitdrukken een zeer dicht elektronensignaal in de mitochondriale intermembrane ruimte en de endoplasmische reticulum. Er wordt echter geen endoplasmische reticulumkleuring waargenomen in cellen die alleen met SCO1-APEX2 worden doorsneden.

Voor seriële beeldvorming door het scannen van elektronenmicroscopie wordt een overzicht van het hele arraybeeld gemaakt met behulp van een backscatter elektronendetector over een groot gebied. Vervolgens wordt het gebied van belang geplaatst in het eerste deel en gepropageerd naar alle andere secties. Ten slotte wordt het interessegebied met vijf doelcellen afgebeeld met vijf nanometerafbeeldingen pixels.

Vergroting onthult gedetailleerde subcellulaire structuren zoals het Golgi-apparaat, mitochondriën en endpolasmisch reticulum. Seriële beeldvorming toont duidelijk aan dat endoplasmische reticulum-mitochondriën contacten optreden op verschillende z-vlakken. Je moet een goed begrip hebben van hoe je een specifieke doelstructuur lokaliseren met behulp van correlatief licht en elektronenmicroscopie om de effecten van een specifieke identiteitswijziging te onderzoeken.

Deze kleuringstechnieken in combinatie met volume elektronenmicroscopie kunnen worden gebruikt voor em op grotere schaal om cellulaire interacties te onderzoeken, met name in het eurovirus. Vergeet niet de glutaraldehyde, ook enteterocide en TCH zijn zeer giftig, dus zorg ervoor dat beschermende kleding te dragen en om te werken in een rookkap bij het gebruik van deze materialen.