Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

Ons protocol biedt een eenvoudige maar robuuste aanpak om concurrerende mechanismen tussen verschillende stammen van Vibrio fischeri-bacteriën te identificeren en te karakteriseren. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die verschillende antibioticaresistentiegenen en fluorescerende eiwitten coderen die differentiële selectie en visuele discriminatie van elke bacteriestam in een gemengde cultuur mogelijk maken. Om te beginnen, gebruik maken van een steriele tandenstoker om de cellen schraap van de agar plaat in de grootte van een rijstkorrel.

Resuspend de cellen in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met een milliliter LBS bouillon. Om de celklontjes op te breken, drukt u ze in de zijkant van de buis en vervolgens krachtig op en neer. Sluit de buis en vortex gedurende één tot twee seconden en herhaal of de celklontjes nog zichtbaar zijn totdat het monster visueel uniform is.

Herhaal deze voorbereidingsstappen van celschrapen tot vortexen voor alle monsters. Meet en noteer de optische dichtheid op 600 nanometer voor alle monsters. Om een nauwkeurige OD-meting te verkrijgen, verdun de monsters tot 10-voudig met behulp van LBS-bouillon.

Normaliseer vervolgens elk monster naar de gewenste OD 600. Om de referentiestam en de stam van de concurrent in een één-op-één-verhouding te mengen, voegt u 100 microliter van elke stam toe die is genormaliseerd tot OD 1.0 tot een gelabelde 1,5 milliliter centrifugebuis en vortex gedurende één tot twee seconden. Als een controle, meng de referentie stam met een differentieel gelabelde versie van zichzelf en vortex ook.

Het is van cruciaal belang om de juiste startverhouding te bereiken, omdat het de uitkomst van het experiment aanzienlijk kan veranderen. Om succes te garanderen, kan deze stap optimalisatie vereisen voor een bepaalde bacteriesoort. Na het herhalen van deze stap voor elke biologische repliceren, moeten er vier biologische replica's met differentieel gelabelde referentiestammen als controles en vier biologische replica's met differentieel gelabelde referentie- en concurrentstammen.

Om cultuurvlekken te maken die na de incubatie zullen worden gebruikt voor fluorescentiemicroscopie, voeg 10 microliter van elk controle en experimenteel mengsel toe aan een petriplaat die LBS agar bevat. Nadat de vlekken volledig zijn opgedroogd op de bank, incubeer de platen op 24 graden Celsius voor 24 uur. Om cultuurvlekken te maken die zullen worden gebruikt om de kolonievormende eenheden voor elke stam aan het eind van het experiment te kwantificeren, voeg 10 microliter van elke controle en experimentele mengsels in 24 putplaten toe die één milliliter LBS agar per goed bevatten.

Nadat de vlekken volledig zijn opgedroogd, broeden de platen op 24 graden Celsius gedurende vijf uur. Om een seriële verdunning van beginnende coincubatiemengsels uit te voeren, draait u een 96-putplaat 90 graden, zodat er acht kolommen en 12 rijen zijn. Label elke rij met de stam-ID, het repliceren van het nummer en de tijd die begint met t nul.

Label de LBS agar platen aangevuld met het juiste antibioticum waarop de verdunningsreeks te herkennen, terwijl u ervoor zorgt om te bepalen welke stam elke antibioticum plaat is de selectie voor. Voeg met een multi-channel pipet 180 microliters LBS-bouillon toe aan elke put, waardoor de eerste kolom leeg blijft voor het onverdunde muntcubatiemengsel. Met behulp van een 200 microliter single channel pipet, breng 100 microliters van de coincubatie mengsel van de buis naar de eerste put van de eerste kolom, gooi dan de tip en herhaal voor alle coincubation mengsels.

Met een multi-channel pipet, overdracht 20 microliters van kolom een naar kolom twee en pipet op en neer te mengen. Gooi de tips en herhaal voor elke kolom, terwijl in overeenstemming met het aantal pipetting op en neer voor elke verdunning. Tegen het einde, elke rij zal een 10-voudige seriële verdunning van het oorspronkelijke mengsel bevatten.

Gebruik een multi-channel pipet uitgerust met acht tips om vijf microliters van elke put in een verdunningsreeks aan te trekken en spot op de Kanamycine aangevuld LBS agar plaat die selecteert voor de referentiestam. Herhaal deze stap te selecteren voor de concurrent stam spotten op de Chloramphenicol aangevuld plaat. Nadat de vlekken volledig zijn opgedroogd, plaatst u de platen in de couveuse op 24 graden Celsius.

Na de coincubation vlekken en de 24 goed platen zijn geïncubeerd voor vijf uur op 24 graden Celsius, voeg een milliliter van LBS bouillon aan elke put. Resuspend door pipetting op en neer totdat alle cellen zijn opnieuw opsuspended in overeenstemming met de kracht waarin de cellen worden geresuspended over alle replica's. Zodra elke coincubatie plek is opnieuw opgetrokken, bereid een 96 put plaat voor een seriële verdunning en LBS agar platen met de juiste antibiotica waarop de verdunning ter plaatse op dezelfde manier als eerder gedaan.

Om de seriële verdunning voor t laatste metingen in de 24 putplaten te voltooien, voert u stappen uit die worden gebruikt voor de seriële verdunning van het startenoculum en spot u elke verdunning op LBS agarplaten zoals eerder gedaan. Ga verder met het beeldvorming van de coincubation spots op de Petri platen en data-analyse zoals beschreven in het manuscript. In de experimentele behandeling zijn de referentiestam en de concurrentstam één aanwezig met een percentage van 0,5 aan het begin en einde van het experiment dat in overeenstemming is met de controlebehandeling.

Log RCI waarden waren niet statistisch verschillend van nul voor de controle behandeling of wanneer de referentie stam werd geïncubeerd met concurrent stam een. Uit deze gegevens blijkt dat er geen concurrentie was tussen de referentiestam en de druk van de concurrent. Toen de referentiestam daarentegen werd geïncubeerd met concurrent stam twee, daalde de referentiestam van een aandeel van 0,5 aan het begin tot een percentage minder dan 0,01 aan het einde van het experiment.

Bovendien waren de log RCI-waarden aanzienlijk groter dan nul toen de referentiestam werd geïncubeerd met concurrent stam twee. Samen wijzen deze gegevens erop dat het aandeel van de referentiestam is afgenomen in aanwezigheid van concurrent stam twee wat wijst op concurrentie tussen de stammen. Toen de referentiestam werd geïncubeerd met concurrent stam één, CDU's van beide stammen steeg in de loop van vijf uur en waren niet significant verschillend wat erop wijst dat er geen concurrentie opgetreden.

Ook werd ongeveer 3200% herstel waargenomen, wat statistisch gezien niet anders was dan de controle. Toen de referentiestam echter werd geïncubeerd met concurrent stam twee, waren referentiestam-CF's aanzienlijk lager dan stam twee CF's in de controle om vijf uur. Ook werd ongeveer 4% herstel waargenomen aanzienlijk lager dan de controle.

Alles bij elkaar, deze gegevens geven aan dat stam twee uit concurreerde de referentie stam door het doden van de cellen. De belangrijkste stap in deze procedure is het bereiken van de juiste startratio, omdat deze de resultaten aanzienlijk kan beïnvloeden.