Name: Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Leer bloedvaten labelen in de hersenen en hypofyse van teleost vissen via cardiale perfusie met DiI-fixatief. Deze efficiënte methode met Oryzias latipes helpt onderzoekers vasculaire anatomie en neuronale interacties bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Medaka Kanda voor de demonstratie van cardiale doorbloeding met fixatieve oplossing in, mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor hulp bij Medaka veeteelt, en de heer Anthony Peltier voor illustraties. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad van het onderzoek van Noorwegen, toelage nummer 248828 (digitaal leven het programma van Noorwegen).

Alle dieren behandeling werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor de zorg en het welzijn van onderzoek dieren aan de Noorse Universiteit voor levenswetenschappen, en onder toezicht van erkende onderzoekers.
1. voorbereiding van instrumenten en oplossingen
<ol><li>Bereid DiI voorraad oplossing oplossen van 5 mg DiI kristal in 1,5 mL plastic buis met 1 mL 96% EtOH. Vortex voor 30 s en blijf bedekt met aluminiumfolie. Opmerking: De DiI stockoplossing kan gedurende enkele maanden in het donker worden bewaard bij-20 °C.</li>
	<li>Bereid de vis houder (Figuur 1a) door het snijden van een stuk polystyreen tot 5 cm lengte, 3 cm breed, en 2 cm dikte, en lijmen aan een 9 cm-diameter plastic schaal. Maak een 3 cm boot vormig gat met een scalpel mes in het polystyreen.</li>
	<li>Bereid het perfusing systeem voor (Figuur 2) door een 30-50 cm lange plastic bril aan het uiteinde van de naald toe te voegen.</li>
	<li>Bereid 40 mL verse 4% Paraformaldehyde oplossing (door) door verdunning van 10 mL 16%-systeem met 30 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een plastic buis van 50 mL.</li>
	<li>Bereid 10 mL fixatief/DiI oplossing door 1 mL DiI stockoplossing te verdunnen in 9 mL vers bereide 4%-gewerkte in een plastic buis van 10 mL. Houd in het donker tot het gebruik. Opmerking: De DiI kristallen die niet opgelost kunnen worden bewaard in de Stock Solution Tube, en nieuwe ethanol kan worden toegevoegd aan nieuwe DiI voorraad oplossing voor te bereiden (zie stap 1,1).</li>
	<li>
Bereid 50 mL tricaine (MS-222) voorraad.
	<ol>
<li>Los 200 mg Tricaine poeder op in 48 mL H2O. Voeg 2 ml 1 M Tris base (pH 9) toe. Pas aan pH 7 met 1 M HCl aan en bewaar bij-20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun 5 mL Tricaine voorraad in 50 mL schoon water in een klein glas.</li>
	<li>Maak een paar 5 cm glazen pipetten (Figuur 2) door een glazen capillair te rekken met een pipet-trekker volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>2. dissectie en doorbloeding
Opmerking: Het is een toxische vluchtige verbinding, waardoor de dissectie en de bloeding in een kap of in een geventileerde ruimte moeten worden uitgevoerd, en de gebruiker moet een gas masker dragen.
<ol><li>Bereid de dissectie gereedschappen met inbegrip van kleine schaar, en een scherpe en een sterke Tang voor dissectie.</li>
	<li>Vul de spuit met de voor bereide oplossing van de DiI door deze in de 50 mL Tube te plaatsen en op te stellen. Plaats vervolgens de naald met de bril aan het uiteinde van de spuit (Figuur 2).</li>
	<li>Bevestig de spuit op de Bank met behulp van verschillende stukjes tape geplaatst in verschillende richtingen, pas de positie van de Microscoop en de stoel om een goede positie voor de dissectie te verkrijgen en voor het indrukken van de spuit zuiger (Figuur 1B). Opmerking: In dit protocol, de elleboog wordt gebruikt om druk op de spuit zuiger, maar andere mogelijkheden opties kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, bijstand van een andere persoon.</li>
	<li>Euthanaseren de vis met een overdosis van tricaine door het plaatsen van de vis in de oplossing bereid in stap 1,7. Wacht 30 s en test de reflexen van de vis door te grijpen zijn caudale Vin met de Tang. De vis kan worden gebruikt wanneer het is gestopt met reageren op de stimuli.</li>
	<li>Plaats de vis in de vis houder met zijn buik naar boven en pin een naald in het uiteinde van het hoofd en een ander boven de staart om de vis op zijn plaats te houden.</li>
	<li>Open de voorste buik met de schaar door horizontaal snijden van de oppervlakkige laag van de huid.</li>
	<li>Met behulp van een tang, verwijder de huid boven het hart tot een duidelijke toegang tot het ventrikel en de bol arteriosus is voorzien (Figuur 3).</li>
	<li>Voeg een glazen pipet toe aan het uiteinde van het capillair en breek het uiteinde van de glazen pipet. Opmerking: Het gat van de gebroken Tip moet groot genoeg zijn om de vloeistof uit te laten, maar nog steeds klein genoeg om gemakkelijk in het weefsel. De glazen pipet kan worden hergebruikt indien niet gebroken of verstopt.</li>
	<li>Breng het glas pipet dicht bij het ventrikel en voeg de druk om de spuit zuiger met de elleboog om de vloeistof uit te dwingen.</li>
	<li>PIN de hart ventrikel met de glazen pipet terwijl het toevoegen van druk op de spuit.</li>
	<li>Direct na, geperforeerd de sinus venosus met een tang om het bloed om de circulatie te verlaten. Opmerking: Het hart ventrikel wordt kwetsbaarder als gevolg van de fixatief. Het wordt ook minder rood als het bloed wordt verdund met de fixatief/DiI oplossing.</li>
	<li>Van het ventrikel, past u de hoek van het glas pipet om de ingang van de bol arteriosus te vinden. Breng de pipet opening in de bol arteriosus zoals weergegeven in Figuur 2en voeg meer druk toe aan de spuit. Opmerking: De bol arteriosus is transparant en het weefsel is elastisch. Bij het vervangen van bloed met DiI/fixatief, de glazen pipet in het hart moet meer zichtbaar worden en door het toevoegen van druk, de grootte van de bol arteriosus moet uitbreiden. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er voldoende druk is gebruikt om al het bloed te vervangen door de fixatief/DiI oplossing, en dat alle bloedvaten zijn bereikt. Vaak als het succesvol is, provoceert het GAASje spiercontracties en de vis zal bewegen.</li>
	<li>Doorgaan met het toevoegen van druk op de spuit voor 30-60 s nog steeds het houden van de glazen pipet in de bol arteriosus.</li>
	<li>Verwijder de glazen pipet en de naalden van de vis.</li>
	<li>Ontleden de hersenen en de hypofyse, en broeden weefsels in verse 4%-gedenkplaats in PBS voor 2 h in het donker bij kamertemperatuur. Opmerking: Dissectie van de hersenen en de hypofyse eerder is beschreven in detail op twee verschillende manieren door Fontaine et al.26 en Ager-Wick et al.27. Vanwege de fixatie, het weefsel wordt heel hard en de fragiele verband tussen de hersenen en de hypofyse kan worden gebroken. Na dissectie, kan de post fixatie verwerking ook overnachten bij 4 °C worden uitgevoerd.</li>
	<li>Spoel het weefsel tweemaal in PBS voor 10 min voor de voorbereiding voor de beeldvorming. Opmerking: Het weefsel kan vervolgens worden gemonteerd tussen dia en deksel slip met afstandhouders tussen en montage medium voor confocale beeldvorming (Zie Figuur 4), of een deel met een vibratome, zoals beschreven in detail in Fontaine et al.26 voor de montage tussen glij-en Afdekstrook voorbeeld vorming met een stereomicroscoop (Zie Figuur 4).</li>
</ol>

<ol><li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Health+and+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li>
<li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li>
<li>Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+PJ+%22Brain+energy+metabolism+in+Fundamental+neuroscience%22">Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience</a>. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).</li>
<li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts%2C+with+special+emphasis+on+flatfish+%28Pleuronectiformes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li>
<li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li>
<li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+median+eminence%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22General+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168(1965).</li>
<li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li>
<li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li>
<li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li>
<li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li>
<li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li>
<li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li>
<li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acetone%2C+methanol%2C+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure%2C+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li>
<li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+fixation+methods%3A+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Vibrational+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li>
<li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetic%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790(2018).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159(2018).</li>
<li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29+reveals+a+putative+novel+developmental+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li>
<li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions%3A+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Cardiale transfusie met DiI eerder is gebruikt om de bloedvaten label in verschillende modelsoorten24, met inbegrip van Teleost Fish13.
Aangezien DiI rechtstreeks wordt geleverd aan het endothelial celmembraan door middel van doorbloeding in de vasculatuur, is het mogelijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen door de DiI concentratie in de fixatie oplossing te verhogen. Bovendien, de fluorophore biedt intense kleuring wanneer opgew...

Bloedvaten spelen een essentieel onderdeel van het gewervelde lichaam als ze de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen te verstrekken aan alle organen. Ook, sinds de ontdekking van hun betrokkenheid bij de ontwikkeling van kanker1, hebben ze veel aandacht gekregen in klinisch onderzoek. Hoewel een aantal publicaties de mechanismen hebben onderzocht die de groei en de morfogenese van de bloedvaten mogelijk maken, en een groot aantal genen belangrijk voor hun vorming zijn geïdentificeerd2, nog veel te begrijpen met betrekking tot de interactie tussen cellen of weefsels en het circulerende bloed.
Visualisatie van bloed vasculatuur in de hersenen en de hypofyse is belangrijk. Neuronen in de hersenen vereisen een hoge toevoer van zuurstof en glucose3, en de hypofyse bevat tot acht belangrijke hormoon-producerende cel typen die de bloedtoevoer gebruiken om het signaal van de hersenen te ontvangen en hun respectieve hormonen te sturen naar verschillende rand organen4,5. Terwijl in zoogdieren, de portal-systeem aan de basis van de hypothalamus de mediaan van de eminentie, verbindt de hersenen en de hypofyse6, zoals een duidelijke bloed brug is niet beschreven in Teleost vis. Inderdaad, in teleosts, preoptics-hypothalamic neuronen rechtstreeks project hun axonen in het pars nervosa van de hypofyse7 en meestal innervate de verschillende endocriene cel types direct8,9. Echter, sommige van deze neuronen hebben hun zenuwuiteinden gelegen in de extravascular ruimte, in de nabijheid van bloedvaten10. Daarom is het verschil tussen Teleost vissen en zoogdieren is niet zo duidelijk, en de relatie tussen het bloed vasculatuur en de hersenen en de hypofyse cellen vereist een groter onderzoek in Teleost vis.
Zebravis heeft, in vele aspecten, een anatomisch en functioneel vergelijkbaar vasculaire systeem aan andere gewervelde soorten11. Het is uitgegroeid tot een krachtig gewervelde model voor cardiovasculair onderzoek vooral dankzij de ontwikkeling van verschillende transgene lijnen waar componenten van het vasculaire systeem zijn gelabeld met TL-reporter eiwitten12. Nochtans, kan de nauwkeurige anatomie van de bloedsomloop tussen soorten, of zelfs tussen twee individuen variëren die tot de zelfde soort behoren. Daarom kan visualisatie van de bloedvaten van hoge rente ook in andere Teleost soorten waarvoor Transgenesis tools niet bestaan.
Verschillende technieken zijn beschreven om de bloedvaten label in zowel zoogdieren en teleosts. Deze omvatten in situ hybridisatie voor vasculatuur genen, alkalische fosfatase kleuring, microangiography, en Dye injecties (voor een herziening Zie13). Fluorescerende lipophilic kationische indocarbocyanine kleurstof (DiI) werd voor het eerst gebruikt om membraanlipiden laterale mobiliteit studie als het wordt bewaard in de lipide bilayers en kan migreren door middel van het14,15,16. Inderdaad, een molecuul van DiI is samengesteld uit twee koolwaterstof ketens en chromophores. Terwijl de koolwaterstofketens in het lipide bilayer celmembraan van de cellen in contact met het integreren, blijft chromophores op zijn oppervlakte17. Eenmaal in het membraan, DiI moleculen diffuse lateraal binnen de lipide bilayer die helpt bij de vlek membraan structuren die niet in direct contact met de DiI oplossing. Het injecteren van een DiI oplossing door middel van cardiale doorbloeding, zal daarom alle endothelial cellen in contact brengen met de verbinding waardoor directe etikettering van de bloedvat. Vandaag DiI wordt ook gebruikt voor andere kleuring doeleinden, zoals enkele molecule Imaging, Fate mapping, en neuronale tracing. Interessant, bestaan verscheidene fluorophores (met verschillende golflengten van emissie) toestaand de combinatie met andere fluorescente etiketten, en de integratie evenals de laterale verspreiding van DiI kan in zowel levende als vaste weefsels voorkomen18, 19.
Formaldehyde, ontdekt door Ferdinand Blum in 1893, is op grote schaal gebruikt om de huidige dag als de voorkeur chemische stof voor weefsel fixatie20,21. Het toont brede specificiteit voor de meeste cellulaire doelstellingen en bewaart cellulaire structuur22,23. Het bewaart ook de fluorescente eigenschappen van de meeste fluorophores, en kan zo worden gebruikt om transgene dieren te fixeren waarvoor de gerichte cellen fluorescente verslaggever proteïnen uitdrukken.
In dit manuscript is een vorig protocol ontwikkeld om de bloedvaten in kleine experimentele zoogdier modellen24 te labelen, aangepast aan het gebruik in vis. De hele procedure duurt slechts een paar uur uit te voeren. Het laat zien hoe perfuse een fixatief oplossing van formaldehyde met DiI in de vis hart om direct te labelen alle bloedvaten in de hersenen en de hypofyse van het model vis Medaka. Medaka is een klein zoet water vis inheems in Azië, voornamelijk gevonden in Japan. Het is een onderzoek modelorganisme met een reeks van moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25. Daarom, de identificatie van de bloedvaten in deze soort, alsmede in andere zal toelaten om ons begrip te verbeteren over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Syringe PP/PE zonder naald</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td><td>spuiten</td></tr><tr><td>BD Precisionglide spuitnaalden</td><td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>naalden 18G (1,20*40)</td></tr><tr><td>Borosilicaatglas 10 cm OD 1,2 mm</td><td>sutter instrument</td><td>BF120-94-10</td><td>glaspipet</td></tr><tr><td>DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>LDPE buis O.D 1,7 mm en I.D 1,1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>canula</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline (PBS) oplossing</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipettrekker</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof petrischalen</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Superlijm gel</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

etikettering van bloedvaten in de teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een dii-fixatief

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Bloedvaten innervate alle weefsels in gewervelde dieren, waardoor hun overleving door het verstrekken van de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen. Het is een van de eerste organen die beginnen te functioneren tijdens de ontwikkeling. Mechanismen van de vorming van bloedvaten zijn uitgegroeid tot een onderwerp van hoge wetenschappelijke en klinische belangstelling. Bij volwassenen is het echter moeilijk om de vasculatuur te visualiseren in de meeste levende dieren als gevolg van hun lokalisatie diep in andere weefsels. Niettemin, visualisatie van de bloedvaten blijft belangrijk voor verschillende studies, zoals endocrinologie en Neurobiology. Terwijl verschillende transgene lijnen zijn ontwikkeld in zebravis, met bloedvaten direct gevisualiseerd door middel van expressie van fluorescerende eiwitten, geen dergelijke instrumenten bestaan voor andere Teleost soorten. Met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model, het huidige protocol presenteert een snelle en directe techniek om de bloedvaten label in de hersenen en de hypofyse door perfusing door het hart met fixatief met DiI. Dit protocol maakt de verbetering van ons begrip over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.

Dit protocol toont een stap voor stap procedure om de bloedvaten label in de Medaka hersenen en de hypofyse, en op hetzelfde moment vast het weefsel. Na etikettering door cardiale injectie van een fixatieve oplossing die DiI in het hart bevat, kunnen de bloedvaten op schijfjes worden waargenomen met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 4) of op geheel weefsel met behulp van een confocale Microscoop (Figuur 5). Hetzij op de dikke tissue slice of...

Het artikel beschrijft een snel protocol voor het etiketteren van bloedvaten in een Teleost vis door cardiale transfusie van DiI verdund in fixatief, met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model en gericht op de hersenen en de hypofyse weefsel.

Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Het algemene doel van deze procedure is om bloedvaten in de hersenen en hypofyse van teleost vissen te labelen, en we gebruiken hartperfusie met een fixatief bevattend DiI in de modelsoort medaka. Dus deze techniek die eenvoudig en efficiënt is, zal helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de vasculaire anatomie in de hersenen en hypofyse van teleostvissen, evenals de relatie tussen neuronen of endocriene cellen en bloedvaten. Enkele voordelen van deze techniek zijn een snelle en eenvoudige eenvoudige voorbereiding, en het aanpassingsvermogen aan de teleost vissoorten.Om een vishouder voor te bereiden, snijd een stuk polystyreen tot een lengte van vijf centimeter, een breedte van drie centimeter en een dikte van twee centimeter, en lijm het polystyreen tot een plastic schaal met een diameter van negen centimeter. Gebruik dan een scalpel om een drie centimeter bootvormig gat in het polystyreen te maken. Om het perfusiesysteem voor te bereiden, voegt u een 30 tot 50 centimeter lange plastic canule toe aan de uiteinden van de perfusiesysteemnaald.Om glazen pipetten van vijf centimeter voor te bereiden, gebruikt u een pipettrekker om individuele glazen haarvaten volgens de instructies van de fabrikant uit te rekken. Laad voor het begin van de dissectie een spuit van 10 milliliter met de voorbereide DiI-fixatieve oplossing en plaats een naald met een canule aan de uiteinden van de spuit. Gebruik vervolgens verschillende stukken tape geplaatst in verschillende richtingen om de spuit vast te stellen aan de bank, en de positie van de microscoop en de stoel aan te passen om een goede positie voor dissectie te verkrijgen en voor het indrukken van de spuit zuiger met de elleboog.Plaats vervolgens een geëuthanaseerde vis in de buik van de vishouder en zet de kop en staart vast met pinnen. Gebruik een schaar om de oppervlakkige laag huid horizontaal te snijden om de voorste buik te openen en gebruik tangen om de huid boven het hart te verwijderen totdat een duidelijke toegang tot de ventrikel en de bulbus arteriosus is bereikt. Voeg een glazen pijp toe aan het uiteinde van de capillaire en breek de punt van de pipet.Breng de glazen pijp dicht bij de ventrikel en voeg elleboogdruk toe aan de spuitzuiger om de vloeistof eruit te dwingen terwijl u de hartventuur met de pipet vastpinnen. Perforeer dan onmiddellijk de sinus venosus met tangen om het bloed uit de bloedsomloop te brengen. Vanuit de ventrikel, stel de hoek van de glazen pipet aan de ingang van de bulbus arteriosus te lokaliseren, en beweeg de pipet opening in de bulbus arteriosus.Voeg vervolgens druk toe aan de spuit voor een extra 30 tot 60 seconden terwijl de pipet in de bulbus arteriosus blijft. Voor een optimale etikettering van alle bloedvaten is het van cruciaal belang om lang genoeg in de bulbus arteriosus te doordringen om al het bloed te vervangen door de DiI-fixatieve oplossing. Na ongeveer 60 seconden perfusie, wanneer er geen bloedlekkage meer wordt waargenomen, verwijder de glazen pipet en naalden van de vis en oogst je de hersenen en hypofyse in verse 4%paraformaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur in het donker.Spoel vervolgens de weefsels twee keer in verse PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt alvorens de monsters voor beeldvorming. Na een hartinjectie van een fixatieve oplossing die DiI bevat, zoals aangetoond, kunnen de gelabelde bloedvaten worden waargenomen op weefselschijfjes door fluorescerende stereomicroscopie of op hele weefsel door confocale microscopie. Houd er rekening mee dat als de oplossing wordt geïnjecteerd in de hartventrikel in plaats van de bulbus arteriosus of als de oplossing wordt geïnjecteerd met een te lage druk en/of voor een te korte periode, een ontoereikende etikettering van de vaten zal worden waargenomen.Bovendien kan bij het beeldvorming van hetzelfde weefsel met dezelfde beeldvormingsparameters na enkele dagen een afname van de etiketteringsintensiteit worden waargenomen, waarbij het signaal meer verspreid in het weefselmonster verschijnt. Weefselplakjes van transgene lijnen waarbinnen de cellen van belang fluorescerende reportereiwitten kunnen verder worden gelabeld voor specifieke eiwitten van belang met behulp van standaard immunofluorescentieprotocollen die het mogelijk maken de interacties tussen bloedvaten en andere celtypen te onderzoeken. Het is belangrijk om de bulbus arteriosus te bereiken.Wanneer dit wordt bereikt, moet het toevoegen van druk aan de spuitzuiger leiden tot een uitbreiding van de bulbus die een succesvolle procedure bevestigt. Deze techniek kan worden gebruikt om de interactie tussen endocriene cellen en bloedvaten in de teleost hypofyse in het algemeen te onderzoeken, maar misschien meer specifiek om mogelijke verschillen of overeenkomsten tussen de portalsystemen in teleost en zoogdieren te onderzoeken. Omdat dit politieke gebruik giftige en vluchtige verbindingen voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van een gasmasker en een geventileerde kamer moet altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We demonstreren het gebruik van het gen pistool op fluorescente kleurstoffen, zoals DII, te introduceren in neuronen in de hersenen plakjes van knaagdieren en niet-menselijke primaten van verschillende leeftijden. In dit specifieke geval maken we gebruik van volwassen muizen (3-6 maanden oud) en volwassen cynomologus apen (9-15 jaar oud). Deze techniek, die oorspronkelijk beschreven door het laboratorium van Dr Lichtman...

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

Hier beschrijven goedkope, snelle, beheerste en gelijkmatige fixatie procedure met 4% paraformaldehyde geperfuseerd via het vasculaire systeem: door het hart van de rat de best mogelijke bescherming van de hersenen te verkrijgen.

Hele Animal Perfusie Fixatie voor knaagdieren

Neurale circuits topografisch georganiseerd in functionele compartimenten specifieke moleculaire profielen. Hier bieden wij de praktische en technische stappen voor het openbaren van globaal brein topografie met behulp van een veelzijdige wholemount immunohistochemische kleuring aanpak. We zien het nut van de methode met behulp van de goed begrepen morfologie en de circuits van cerebellum.

Wholemount Immunohistochemie voor het openbaren van Complex Brain Topografie

Analyse van knaagdier cerebrovasculaire anatomie speelt een belangrijke rol in experimenteel onderzoek beroerte. In deze context heeft intravasculaire perfusie met gekleurde latex beschouwd als een standaard hulpmiddel voor meerdere jaren. Deze techniek houdt specifieke technische beperkingen, die de reproduceerbaarheid ondermijnen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode om hersenvaten op reproduceerbare wijze te visualiseren. Injectie van een mengsel van twee commercieel verkrijgbare...

Intravasculaire Perfusie van Carbon Black Ink Hiermee Betrouwbare Visualisatie van hersenvaten

Met behulp van een lipofiele l, 3'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.

DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in<em&gt; Ambystoma Mexicanes</em

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Het voorlopige onderzoek bevestigt dat subarachnoïdale bloeding (SAH) het overlijden van de pericyten in de hersenen veroorzaakt. Het evalueren van de contractiliteit van pericyten na SAH vereist differentiatie tussen levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten. Daarom is er een procedure ontwikkeld om levensvatbare en niet-levensvatbare hersenpericyten gelijktijdig in hersensecties te labelen, waardoor observatie met behulp van een confocale microscoop met hoge resolutie wordt...

Beeldvorming van vitale en niet-vitale hersenpericyten in hersenplakjes na een subarachnoïdale bloeding

We demonstreren chemisch inducerende grote bloedvatverwijding bij muizen als een model voor het onderzoeken van cerebrovasculaire disfunctie, dat kan worden gebruikt voor modellering van vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer. We demonstreren ook het visualiseren van het vaatstelsel door het injecteren van een siliconenrubbersamenstelling en het bieden van duidelijke visuele richtlijnen voor het meten van veranderingen in de grootte van bloedvaten.

Een visuele benadering voor het induceren van dolichoectasia bij muizen om door grote bloedvaten gemedieerde cerebrovasculaire disfunctie te modelleren

Leer bloedvaten labelen in de hersenen en hypofyse van teleost vissen via cardiale perfusie met DiI-fixatief. Deze efficiënte methode met Oryzias latipes helpt onderzoekers vasculaire anatomie en neuronale interacties bestuderen.

Etikettering van bloedvaten in de Teleost hersenen en de hypofyse met behulp van cardiale transfusie met een DiI-fixatief

Meer video's verkennen