Een dubbel gehumaniseerd BLT-muizen model met een stabiele mens-achtige gut Microbiome en menselijk immuunsysteem

Ons protocol is belangrijk, omdat het kan worden gebruikt om reproduceerbaar muizen te maken met zowel een menselijk darmmicrobioom als een menselijk immuunsysteem. We noemen deze muizen, dubbele gehumaniseerde muizen. Het dubbel gehumaniseerde muismodel kan worden gebruikt voor zowel fundamenteel als translationeel biomedisch onderzoek, inclusief de studie van in vivo relaties tussen het menselijke darmmicrobioom en het menselijk immuunsysteem.

Het aantonen van de procedure zal Jianshui Zhang, een postdoc, en Yilun Chang, een promovendus uit ons laboratorium. Om de lever en thymus weefsels te implanteren in de linker niercapsule, plaats de muis eerst in een kap. Behandel de muizen op de dag van de operatie met de subletale bestraling van het hele lichaam met een dosis van 12 centigrays per gram lichaamsgewicht.

Scheer elke muis rond de linker zijwaartse en mediale kant na bevestiging van een passend niveau van sedatie. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier en breng indien nodig een oormerk aan. Desinfecteer de huid met drie sequentiële jodium en 70% isopropanol scrubs.

Wanneer de huid is voorbereid, gebruik tangen om een tot een-tot-zes millimeter in blokjes menselijk foetale leverweefsel fragment te laden in een trocar, gevolgd door een een-op-1,6 millimeter in blokjes blokjes menselijke foetale thymus weefsel fragment. Gebruik de tangen om de huid op te tillen en gebruik een scalpel om een kleine longitudinale snee in de huid te maken. Breid de snede uit tot 1,5 tot twee centimeter aan de linkerkant van de muis.

En gebruik tangen om de spierlaag op te tillen. Gebruik een schaar om de spierlaag in de lengterichting te openen, de snede zo nodig uit te breiden om de nier bloot te stellen en het vetweefsel rond de nier voorzichtig te grijpen. Gebruik een scalpel om een incisie van één tot twee millimeter te maken aan het achterste uiteinde van de niercapsule en steek de voorgeladen trocar langzaam in de incisie parallel aan de lange as van de nier.

Laat de weefsels tussen de niercapsule en de nieren, en de terugkeer van de nier en darmen naar hun normale posities. Gebruik vervolgens hechtingen om de spierlaag en chirurgische nietjes te sluiten om de huid te sluiten. Plaats de muis in een autoclaved microisolator kooi met monitoring tot volledige recumbancy.

Zes uur na de operatie, plaats de muizen onder een warmtelamp en desinfecteren de staarten met 70%isopropanol. Injecteer 1,5 tot vijf keer 10-tot-de-vijf CD34 positieve menselijke foetale leverweefsel geïsoleerde hemopoietische stamcellen in 200 microliters van PBS in een verwijde staart ader per dier. Stop dan elke bloeding met zachte druk en breng de muizen terug naar hun kooi thuis.

Negen tot 12 weken na de operatie, gebruik een geschikt formaat plastic kam terughoudendheid om een been van een gehumaniseerde muis te isoleren, en spray de mediale kant van het geïsoleerde been met 70% isopropanol. Verspreid antibiotica en pijnstillende zalf op de verzamelplaats. Met behulp van een 25-gauge naald gehouden in een hoek van 90 graden, punctie de saphenous ader te verzamelen 50 tot 100 microliter bloed in een EDTA-gecoate bloedafname buis.

Wanneer een geschikt volume bloed is verkregen, druk uitoefenen op de site met een steriel stuk gaas om het bloeden te stoppen voordat de muis terug te keren naar zijn kooi. Gebruik vervolgens het verzamelde perifere bloedmonster om het niveau van de menselijke immuuncelconstitutie te beoordelen door stromingscytometrie met behulp van antilichamen tegen menselijke CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 en muis CD45. Voor verse fecale monster collectie, plaats individuele autoclaved papieren zakken in een rookkap en plaats een muis in elke zak totdat elk dier poept.

Breng de muizen vervolgens terug naar hun kooi en gebruik steriele tangen om elk fecal monster over te brengen in één buis van 1,5 milliliter per muis voor min 80 graden Celsius opslag. Aan het einde van de 14-daagse behandeling met antibiotica, verander het drinkwater in autoclaved gesteriliseerd water, en breng de muizen in een nieuwe autoclaved kooi. 24 en 48 uur na de stopzetting van antibiotica ontdooien goed voorbereide bronnen van fecale microbiota transplantatie materiaal, en aliquot de monsters in een anaerobe kamer onder anaërobe omstandigheden.

Om een fecale transplantatie uit te voeren, leveren 200 microliters van fecale microbiota transplantatie materiaal via orale gavage aan elk experimenteel dier, en verspreid alle resterende ontdooid materiaal op de vacht van gehumaniseerde muizen of op de kooi beddengoed. Hier wordt een voorbeeld van flow cytometrieanalyse van perifeer bloed van een gehumaniseerde BLT-muis 10 weken na de operatie getoond. T en B cel populaties kunnen zowel worden geïdentificeerd, evenals CD4 en CD8 positieve T-cellen subsets.

In deze grafiek kan de relatieve overvloed van de menselijke fecale donormonsters worden waargenomen die worden gebruikt om een darmmicrobioom over te brengen om dubbele gehumaniseerde muizen te creëren. De fenotypische veranderingen in de milt en cecum veroorzaakt door behandeling met antibiotica is vergelijkbaar met die waargenomen bij kiemvrije dieren. Deze belangrijkste component analyse plot van representatieve 16S ribosomale RNA sequencing gegevens blijkt dat dubbele gehumaniseerde muizen hebben mens-achtige darm microbiomen die uniek zijn voor de menselijke donor monster.

Het meest kritieke aspect van dit protocol is het beperken van de introductie van ongewenste bacteriën om ervoor te zorgen dat de muizen gezond blijven en het menselijke darmmicrobioom behouden. Dit model heeft het potentieel om gepersonaliseerde geneeskunde te bevorderen en om ons in staat te stellen te kijken naar hoe de menselijke ziekte het darmmicrobioom beïnvloedt terwijl we andere verzachtende factoren controleren.