Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Het gebruik van de gewijzigde parallelle plaat stroomkamer kan onderzoekers helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de functionele reactie van mechanosensitive ionkanalen op schuifstress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt real-time onderzoek te stromen geactiveerde ionkanalen in een gemakkelijk te monteren, herbruikbare parallelle plaat flow kamer. Om te beginnen met de procedure, breng een dunne laag siliconen elastomeer oplossing rond de randen van de rechthoekige ruimte van stuk C, en voorzichtig plaats de rechthoekige deksel glas, stuk D, direct op de elastomeer oplossing om volledig te dekken de open rechthoekige ruimte van stuk C.Zorgvuldig wegvegen overtollige siliconen elastomeer oplossing.

Herhaal vervolgens de procedure voor het vasthouden van het rechthoekige afdekglas, stuk F, aan de onderkant van stuk E en laat de siliconen elastomeeroplossing 's nachts bij kamertemperatuur genezen. Nu, monteer de MPP flow kamer door achtereenvolgens het plaatsen van elk stuk op de top van de vorige, te beginnen met de onderste kamer, stuk E, dan stuk C, stuk B, gevolgd door stuk A op de top. Vervolgens lijnen de schroefgaten van elk stuk op de hoeken en stevig schroef de stukken samen om lekken te voorkomen tijdens het beheer van de stroom naar de MPP flow chamber.

In een zes-put plaat, plaats vier tot vijf, 12 millimeter dekking glazen cirkels in elke put. Sla de cellen tussen 10% en 30%-samenvloeiing op, zodat enkele cellen toegankelijk zijn voor elektrofysiologische opnames. Vervolgens, incubeer de cellen onder standaard kweekomstandigheden voor niet minder dan twee uur om cellen te hechten, en niet meer dan 24 uur, als endotheelcellen zal plat en moeilijk te patchen wanneer gezaaid op subconfluency voor meer dan 24 uur.

Verwijder vervolgens een afdekglas met de aangehangen cellen uit een put van de zes-put plaat en spoel snel in PBS. Breng vervolgens het afdekglas met cellen over op een petrischaal van 35 millimeter met twee milliliter elektrofysiologische BAF-oplossing. Breng het afdekglas met cellen onmiddellijk over naar de MPP-stroomkamer.

Breng de afdekglascirkel over op het rechthoekige afdekglas, stuk D, dat is gehecht aan stuk C van de MPP-stroomkamer. Voeg de BAF-oplossing toe om de afdekglascirkel en de cellen volledig onder te dompelen. Plaats vervolgens de afdekglazen cirkel op stuk D zodanig dat de cellen in overeenstemming zijn met de spleet openingen van stuk B.Zorg ervoor dat de cover glas cirkel hecht aan stuk D door middel van oplossing glas hechting om verstoring van de positie van de cover glas cirkel door de stroom toepassing te voorkomen.

Monteer vervolgens de MPP-stroomkamer door de stukken in de juiste volgorde aan elkaar te schroeven. Breng de kamer over naar het microscoopstadium en doorspeed onmiddellijk de kamer met BAF-oplossing. Identificeer vervolgens een gezonde cel met een donkere rand en duidelijke kern voor het experiment.

Vermijd cellen die lijken te zijn blubbing of cellen die in contact zijn met andere cellen. Om shear stress te controleren, het opzetten van een zwaartekracht perfusie systeem door het aansluiten van een 30 milliliter afgestudeerd spuitcilinder op een drie-weg Luer slot uitgerust met microbore buizen. Bevestig vervolgens de gegradueerde cilinder aan de Kooi van Faraday rond de elektrofysiologie-installatie met dubbelzijdige tape.

Voordat u de slang in de MPP-kamer plaatst, vult u de spuit en de slang vooraf met BAF-oplossing. Steek vervolgens de slang in het MPP-stroomkamerinlaatgat van stuk A.Vul de MPP-stroomkamer vooraf met oplossing, zodat deze in het vacuümreservoir wordt verwijderd. Stop de stroom naar de kamer en vul de gegradueerde cilinder aan de bovenste markering.

Bereken de stroomsnelheid handmatig met behulp van een stopwatch door de oplossing door de kamer te laten stromen op een bepaalde spuitcilinderhoogte. Verhoog of verlaag de spuit om de stroom te veranderen en bereken de schuifspanning in een parallelle kamer met behulp van deze vergelijking. Herhaal dit proces totdat een gewenst niveau van afschuifstress is gevonden.

Breng vervolgens een geassembleerde kamer met aangehangen cellen over naar het microscoopstadium van de elektrofysiologie-installatie. En steek de slang, voorgevuld met BAF-oplossing, in het gat van stuk A.Dan, vul de kamer en was de cellen met 10 milliliter BAF oplossing, tegelijkertijd. Zodra de gewenste patch configuratie met succes is verkregen, laat kanaalstromen te stabiliseren in een statisch bad bij kamertemperatuur.

Zodra de stromingen zijn gestabiliseerd, toe te passen schuin op een stap-wise manier, waardoor de verhoogde stroom te stabiliseren voorafgaand aan de volgende stap van shear stress te verhogen. Verwijder schuinte blootstelling aan de cellen door het stoppen van de stroom naar de kamer, waardoor mechanosensitive kanaalstromen om terug te keren naar baseline stromen waargenomen in het statische bad. Hier getoond is een representatieve ruwe opname van Kir stroom van een primaire muis mesenterische endotheelcel met opmerkelijke lineaire uitgaande lekstroom.

Een helling van negatieve 140 tot positieve 40 millivolt werd toegepast op de patch meer dan 400 milliseconden. Lek stroom voorkomt dat de analyse van echte Kir kanaal activiteit. Om lekstroom af te trekken, berekent u eerst de lineaire hellinggeleiding van lekstroom.

Meerdere G helling door overeenkomstige spanningen van de gehele ruwe spoor te plotlek stroom op de ruwe gegevens. De lijn moet het uitgaande lineaire lek precies bedekken. Trek vervolgens de uitgeplosde lekstroom af van het hele spoor, zodat de lineaire uitgaande stroom ongeveer nul picoamperes per picofarad is en de echte Kir-stroom kan worden geanalyseerd.

Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de juiste positie van de cover glas in de kamer, zodat cellen toegankelijk zijn voor experimenten. Zorg er bovendien voor dat de afdekslip voldoende is nageleefd op stuk D, zodat de vloeistofstroom het afdekglas met cellen niet verstoort.