Name: Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Leer elektrofysiologische opnames van mechanosensitieve ionkanalen onder afschuifspanning met een gemodificeerde parallelplaat-stroomkamer. Deze herbruikbare methode maakt real-time onderzoek naar mechanotransductie in cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het National Heart, Lung en Blood Institute (R01 HL073965, IL) en (T32 HL007829-24, ISF). De auteurs willen ook de wetenschappelijke machine winkel van de Universiteit van Illinois in Chicago erkennen voor het genereren van onze nieuwste MPP flow Chambers.

Het gebruik van dieren in onze studies is goedgekeurd door de Universiteit van Illinois in het Dierenzorg Comité van Chicago (#16-183).
1. montage van de gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer
Opmerking: Raadpleeg tabel 1 en Figuur 1 voor de MPP-stroom kamer stuk-id's. Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de oriëntatie van de kamer stukken voor de assemblage.
<ol><li>Om het rechthoekige afdekglas, deel D, aan de onderkant van het stuk C te hechten, maakt u eerst de siliconen elastomeer oplossing door het mengen van 500 μL silicone elastomeer Uithardings middel grondig in 5 mL siliconen elastomeer basis.</li>
	<li>Breng een dun laagje van de siliconen elastomeer oplossing aan de randen van de rechthoekige ruimte van stuk C en plaats het rechthoekige afdekglas stuk D direct op de elastomeer oplossing zodanig dat stuk D de open rechthoekige ruimte van stuk C volledig bedekt. Veeg voorzichtig overtollige siliconen elastomeer oplossing weg.</li>
	<li>Herhaal stap 1,2 voor het vasthouden van het rechthoekige afdekglas, stuk F, aan de onderkant van het stuk E en laat de siliconen elastomeer oplossing gedurende de nacht bij kamertemperatuur genezen. Opmerking: Eenmaal genezen, blijft het rechthoekige afdekglas tot zes maanden vastgehouden voordat het vervangen moet worden.</li>
	<li>Begin met het onderste kamer stuk, deel E, Monteer de MPP-stroom kamer door achtereenvolgens elk stuk boven op de vorige in de volgende volgorde te plaatsen: stuk E (onderkant), stuk C, stuk B, stuk A (boven).</li>
	<li>Lijn de schroefgaten van elk stuk op de hoeken uit en schroef de stukken stevig samen om te voorkomen dat er lekkages optreden tijdens het toedienen van de stroom naar de MPP-stroom kamer.</li>
</ol>2. celvoorbereiding en zaaien in de MPP-stroom kamer
Opmerking: Volg de stappen 2.1 − 2.7 voor gekweekte endotheliale cellen. Volg de methode die is beschreven in stappen 2.8 − 2.14 voor het isoleren van endotheel cellen van de mesenterische arteriële Arcade muis en de bereiding van vers geïsoleerde endotheel cellen.
<ol><li>Plaats in een 6-put plaat vier tot 5 12 mm afdekglas cirkels/put en zaadcellen tussen 10% en 30% confluentie zodanig dat enkele cellen kunnen worden benaderd voor elektrofysiologische opnames.</li>
	<li>Inbroed cellen onder de standaard kweek condities (5% CO2, 37 °c) voor niet minder dan 2 uur, zodat cellen zich kunnen hechten en niet meer dan 24 uur als endotheelcellen in de ervaring van de auteurs worden zeer plat en moeilijk te patchen wanneer ze op subconfluentie voor meer dan 24 H.</li>
	<li>Verwijder een afdekglas met vastgehouden cellen uit een put van de 6-well plaat, spoel snel in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en breng over in een 35 mm Petri schaaltje met 2 mL elektrofysiologische badoplossing (tabel 2) voorafgaand aan overdracht naar de MPP-stroom Kamer.</li>
	<li>Breng de afdekglas cirkel over naar het rechthoekige afdekglas, deel D, dat is gehecht aan stuk C van de MPP-stroom kamer, dat ervoor zorgt dat de juiste oplossing op het afdekglas blijft, zodat cellen niet aan de lucht worden blootgesteld. Voeg de gewenste badoplossing (~ 250 μL) toe aan de cellen, zodat de afdekglas cirkel en de cellen volledig in de oplossing worden ondergedompeld.</li>
	<li>Plaats de afdekglas cirkel zodanig dat deze in de helft ligt die zich het dichtst bij het vacuüm reservoir bevindt, zodat de cellen in overeenstemming zijn met de spleet openingen van het stuk B. Zorg ervoor dat de glazen afdek cirkel hecht aan het deel D door middel van een oplossing-glas hechting, zodat de toepassing van stroom naar de kamer niet verstoren de positie van de afdekglas cirkel.</li>
	<li>Monteer de MPP-stroom kamer door de onderdelen samen in de juiste volgorde te schroeven, zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5 en zoals weergegeven in Figuur 1. Breng de kamer over in de Microscoop fase en parfumeer onmiddellijk de kamer met badoplossing, zodat de oplossing het vacuüm reservoir voor aspiratie bereikt (~ 10 mL).</li>
	<li>Identificeer een gezonde cel voor het experiment door een cel te identificeren met een donkere rand en een duidelijke Nucleus. Vermijd cellen die lijken te worden blebbing of cellen die in contact komen met andere cellen. Opmerking: In het laboratorium van de auteurs worden menselijke aorta endotheel cellen en primaire muizen mesenterische endotheel cellen in de cultuur gebruikt. Echter, elk ander type hecht cel dat van belang is voor specifieke onderzoeksbehoeften kan op dezelfde manier worden gebruikt.</li>
	<li>Was de geïsoleerde arteriële arcade in dissociatie oplossing (tabel 2). Breng de arcade in een 2 mL centrifugebuis met 2 mL voorverwarmde (37 °C) dissociatie oplossing (recept voor dissociatie oplossing weergegeven in tabel 2) met neutrale protease (0,5 mg/ml) en elastase (0,5 mg/ml). Inbroed voor 1 uur bij 37 °C met voorzichtig schudden om de 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder 1 mL van de neutrale protease/elastase dissociatie oplossing en voeg 1 mg/mL Collagenase type 1 toe. Retourneer de Collagenase-oplossing naar de oplossing die de slagaders bevat voor een uiteindelijke Collagenase-type 1-concentratie van 0,5 mg/mL. Inbroed voor 2 − 3 min bij 37 °C.</li>
	<li>Met behulp van 5-grade Tang, verplaats de Arcade snel op een 35 mm diameter Petri schaal met een druppel van 750 μL van verse, gekoelde dissociatie oplossing. Verder dissociëren van het weefsel met behulp van 2 20 G spuit naalden om mechanisch bevrijden endotheliale cellen van enzymatisch verteerde slagaders.</li>
	<li>Met behulp van een 9 "wegwerp Pasteur glas Pipet, wrijf de cel oplossing 10x voordat de cellen overbrengen naar een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis met behulp van de glazen pipet.</li>
	<li>Was de Petri schaal met nog eens 750 μL dissociatie oplossing en breng deze over naar dezelfde buis. Gebruik de glazen pipet om de cellen verder mechanisch te dispergeren door ten minste 10x te pipetteren om een enkele celsuspensie te maken die ervoor moet zorgen dat er geen bubbels worden geïntroduceerd die de integriteit van de endotheel cellen kunnen beschadigen.</li>
	<li>Voeg 750 μL van de suspensie van de endotheelcel (~ 500 − 1000 cellen) rechtstreeks toe aan het deel D van de MPP-stroom kamer op de helft die het dichtst bij de vacuüm zijde van het reservoir zit. Laat de endotheliale cellen tussen 45 min en 1 uur bij kamertemperatuur plakken.</li>
	<li>Monteer de MPP-stroom kamer door de delen samen te schroeven in de juiste volgorde zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5 en zoals weergegeven in Figuur 1. Breng de kamer over in de Microscoop fase en parfumeer onmiddellijk de kamer met badoplossing, zodat de oplossing de vacuüm aspiratie bereikt (~ 10 mL). Identificeer toegankelijke endotheel cellen door hun ruw en rond fenotype19,20. Opmerking: Een verscheidenheid van spijsvertering methoden en enzym cocktails zijn gebruikt om te isoleren van endotheel cellen uit verschillende arteriële bedden. Zie tabel 3 voor gedetailleerde beschrijvingen van de protocollen die door verschillende onderzoekers zijn gebruikt om endotheliale cellen voor patch klem elektrofysiologie van mechanosensitieve ionenkanalen te isoleren. Deze methoden zijn waarschijnlijk geschikt voor gebruik in combinatie met de MPP-stroom kamer.</li>
</ol>3. het regelen van afschuif spanning naar de MPP-stroom kamer voor elektrofysiologische opnames van Afschuifgeactiveerde Mechanosensitieve ionenkanalen
<ol><li>Set-up een zwaartekracht perfusie systeem door een 30 ml gegradueerde spuitcilinder aan te sluiten op een 3-weg Luer slot uitgerust met een mcirobore buis (inwendige diameter: 0,05 inch, buitendiameter: 0,09 inch) geschikt voor het inbrengen in de 3 mm diameter inlaat gat van de MPP Kamer.</li>
	<li>Bevestig de gegradueerde cilinder aan de buitenzijde van de kooi van Faraday rondom de elektrofysiologie rig (Figuur 2) met behulp van dubbelzijdige tape. Voorafgaand aan het inbrengen van de slang in de MPP-kamer, pre-Vul de spuit en slang met bad oplossing (Zie tabel 2 voor Bad oplossing gebruikt voor het onderzoeken van de inwarm rectificeren K+ kanalen in endotheel cellen). Plaats de slang in het inlaat gaatje van de MPP-stroom kamer van stuk A.</li>
	<li>Pre-Vul de MPP-stroom kamer met oplossing zodat de oplossing wordt verwijderd in het vacuüm reservoir. Stop de stroom naar de kamer en vul de gegradueerde cilinder op de bovenste markering. Bereken de stroomsnelheid handmatig door de oplossing door de kamer te laten stromen en een stop horloge te gebruiken om mL/s te berekenen bij een bepaalde cilinder hoogte van de spuit.</li>
	<li>Verhoog of verlaag de spuit om de stroming te veranderen, en dus schuin in de kamer, en ga door met dit proces totdat een gewenst niveau van afschuif spanning wordt gevonden.</li>
	<li>Bereken de afschuif spanning in een parallelle kamer met behulp van de volgende vergelijking21: τ = 6μQ/h2w waarbij μ = viscositeit van vloeistof (g/cm · s), Q = debiet (mL/s), en parallelle plaat kamer breedte (b = 2,2 cm) en hoogte (h = 0,1 cm). Opmerking: In het huidige zwaartekracht perfusie systeem, bij een cilinder hoogte van de spuit (gemeten vanaf de bovenkant van de cilinder) van 57 cm boven de Microscoop, is het debiet 0,3 mL/s. De afschuiving berekend in de kamer op deze spuitcilinder hoogte en debiet is 0,7 dyn/cm2. Ook moet worden opgemerkt dat andere perfusie systemen, zoals een peristaltische pomp, kunnen worden gebruikt om de stroom naar de MPP-stroom kamer te regelen. Echter, deze apparaten kunnen ongewenste turbulentie en invloed stabiliteit van de elektrofysiologie metingen onder stroming toe te voegen, daarom, met behulp van de zwaartekracht perfusie systeem beschreven hier wordt aanbevolen.</li>
	<li>Breng een geassembleerde kamer met vastgehouden cellen naar de Microscoop fase van de elektrofysiologie Rig en steek de slang voorgevulde met badoplossing in het gat van stuk A. Vul de kamer gelijktijdig en was de cellen met 10 mL badoplossing door het draaien van de 3-weg Luer Lock zodat de oplossing stroomt naar de kamer.</li>
	<li>Zodra de gewenste patch configuratie succesvol is verkregen, kunnen kanaal stromen in een statisch bad bij kamertemperatuur stabiliseren. Zodra de stromingen zijn gestabiliseerd, breng shear in een stap-Wise mode waardoor stijgingen van de stroom te stabiliseren voordat de volgende stap verhoging van de shear stress. Opmerking: De auteurs vinden het meest succes met de geperforeerde patch configuratie bij het bestuderen van mechanoactivated ion-kanalen in endotheliale cellen. Om geperforeerde whole-Cell patch configuraties uit te voeren, voeg 5 μL van een 60 mg/mL voorraad amfotericine B in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) toe aan 1 mL 0,2 μm steriele gefilterde pipet oplossing. Na het genereren van een Giga-Ohm zegel in de cel-aangesloten configuratie, vormen geperforeerde hele celpatches binnen 2 − 5 min.</li>
	<li>Verwijder de afschuif blootstelling aan de cellen door de stroom naar de kamer te stoppen, waardoor mechanosensitieve kanaal stromen terugkeren naar Baseline stromingen die in het statische bad zijn waargenomen.</li>
	<li>Isoleer mechanisch gevoelige ionen kanaal stromen van belang door het veranderen van de oplossing Valence (bijv. 60 mm K+ in badoplossing met 0 CA2 + in pipet oplossing voor het bestuderen van naar binnen rectificeren K + kanalen. Tabel 2 toont voorbeelden van oplossings recepten) en/of farmacologische remming van mogelijk vervuinende stroombronnen.</li>
</ol>

<ol><li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans%3A+Role+of+Hemodynamic+Stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).</li>
<li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K%2B+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li>
<li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secrets+of+the+code%3A+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li>
<li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li>
<li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+K%28%2B%29+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li>
<li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K%28%2B%29+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li>
<li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li>
<li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomed+Engineering%22%5BJournal%5D)">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K%2B+channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).</li>
<li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Assembly+and+Application+of+%27Shear+Rings%27%3A+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital%2C+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).</li>
<li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li>
<li>Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li>
<li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-activated+Na%28%2B%29and+K%28%2B%29Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li>
<li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SK%28Ca%29+and+IK%28Ca%29+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereberal+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).</li>
<li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li>
<li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette%3A+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%28%2B%29+current+by+convectively+restoring+%5BK%28%2B%29%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585(2016).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li>
<li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li>
<li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li>
<li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het vasculaire systeem wordt voortdurend blootgesteld aan actieve hemodynamische krachten, die mechanosensitieve ionkanalen3,22 activeren, maar de fysiologische rollen van deze kanalen in shear stress-geïnduceerde mechanotransductie is alleen beginnen te ontstaan4,6,8. De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de mechanosensitiviteit van shear stress-geactiveerde kan...

Hemodynamische krachten gegenereerd door de bloedstroom zijn bekend om te spelen belangrijke rollen in endotheel en vasculaire functie1,2. Het is ook bekend dat verschillende soorten ionenkanalen acuut reageren op veranderingen in shear stress3,4,5 wat leidt tot de hypothese dat ionenkanalen primaire shear stress sensoren kunnen zijn. Meer recentelijk toonden wij en anderen aan dat mechanogevoelige ionenkanalen kritische rollen spelen in verschillende afschuiving gevoelige vasculaire functies, waaronder de vasoactieve respons op shear stress6,7,8 en ontwikkelings-angiogenese9. De mechanismen van de shear-stress gevoeligheid van ionenkanalen zijn echter bijna volledig onbekend. Deze kloof van kennis is waarschijnlijk te wijten aan de technische moeilijkheid van het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder goed gedefinieerde shear stress. In dit artikel bieden we daarom een stap voor stap gedetailleerd protocol dat routinematig wordt uitgevoerd in ons lab om dit doel te bereiken6,7,10,11.
Het algemene doel van deze methode is om het real-time onderzoek van Ion Channel mechanoactivation onder goed gedefinieerde shear stress in het fysiologische bereik mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door een standaard parallelle plaat stroom kamer te wijzigen, zodat een elektrofysiologische pipet in de kamer kan worden verlaagd en toegang wordt verkregen tot cellen die op de bodemplaat zijn geteeld tijdens de real-time blootstelling aan stroming, wat een unieke aanpak biedt om dit te bereiken doel6,7,11. Standaard parallelle plaat stroomkamers, beschreven in voorgaande publicaties, kunnen worden gebruikt voor de real-time beeldvormings analyse van cellen die zijn blootgesteld aan afschuifkrachten12 of andere niet-invasieve benaderingen13,14 maar niet voor Elektrofysiologie. Evenzo is de kegel-en plaat apparatuur, een andere krachtige benadering om cellen bloot te stellen aan shear stress15,16 ook niet geschikt voor elektrofysiologische opnames. Dus, deze stroom apparaten niet toestaan dat het onderzoek van shear stress gevoeligheid van ionenkanalen. De moeilijkheid bij het uitvoeren van elektrofysiologische opnames onder stroom is de belangrijkste reden voor de schaarste van informatie over de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze cruciale effecten.
In termen van de alternatieve benaderingen om hetzelfde doel te bereiken, zijn er geen die zo nauwkeurig of gecontroleerd zijn. Sommige eerdere studies probeerden de activiteit van het ion-kanaal onder stroom op te nemen door cellen bloot te stellen aan een stroom vloeistof afkomstig van een andere pipet die in de nabijheid van een cel van boven de17,18werd gebracht. Dit is zeer niet-fysiologische, als de mechanische krachten gegenereerd onder deze omstandigheden hebben weinig gemeen met de fysiologische profielen van shear stress in de bloedvaten. Vergelijkbare bezorgdheid is van toepassing op de pogingen om fysiologische afschuif stress te simuleren door een perfusie van open kamers. Zoals uitvoerig besproken in onze eerdere studie10, creëert een open Liquid-Air-interface meerdere storingen en recirculatie, die niet-fysiologisch zijn. Om al deze zorgen aan te pakken, hebben we een gemodificeerde parallelle plaat (MPP)-stroom kamer ontworpen, ook wel de "minimaal invasieve stroomvoorziening" genoemd in onze eerdere studies6,7,10,11, gemaakt van acryl en uitgebreid gebruikt in ons lab. Ondanks het feit dat de oorspronkelijke beschrijving van het ontwerp bijna twintig jaar geleden is gepubliceerd en het enige stroom apparaat is dat het mogelijk maakt elektrofysiologische opnames onder welomschreven afschuif spanning uit te voeren, is deze methodologie echter niet goedgekeurd door andere laboratoria en er zijn slechts zeer weinig studies die proberen om stromen onder stroom op te nemen. Wij zijn daarom van mening dat het verstrekken van een gedetailleerde beschrijving voor het gebruik van de MPP flow Chamber een grote hulp zal zijn voor onderzoeken die geïnteresseerd zijn in mechanosensitieve ionenkanalen en vasculaire biologie.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m steriele spuitfilters</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Gebakken voor het filteren van elektrofysiologische pijptoplossingen</td></tr><tr><td>5 grade forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>1252-30</td><td>Gebakken voor het overbrengen van gedigesteerde slagaders naar verse oplossing</td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipet</td><td>Fisher Scientifc</td><td>13-678-20D</td><td>Gebakken voor het mechanisch verstoren van gedigesteerde slagaders en het overbrengen van vers geïsoleerde endotheelcellen</td></tr><tr><td>12 mm diameter Dekglazen cirkels</td><td>Fisher Scientifc</td><td>12-545-80</td><td>Voor gebruik bij onderzoek met gekweekte cellen en meerdere behandelingen. Cellen die aan het dekglas hechten, worden gebruikt voor patch clamp-analyses</td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm Rechthoekige Dekglazen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975224</td><td>Dekglas om toe te voegen aan MPP flowkamer stukken C (Figuur 1)</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm Rechthoekige Dekglazen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td>Dekglas om toe te voegen aan MPP flowkamer E (Figuur 1)</td></tr><tr><td>20 G spuitnaalden</td><td>Becton Dickinson and Co</td><td>305175</td><td>Voor gebruik bij mechanische verstoring van gedigesteerde mesenterische slagaders</td></tr><tr><td>35 mm Petri schotel</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Voor gebruik bij mechanische verstoring van gedigesteerde mesenterische slagaders</td></tr><tr><td>Amphotericin B gesolubiliseerde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-50MG</td><td>Gebakken voor het genereren van de geperforeerde hele-cel patch configuratie.</td></tr><tr><td>Collageenase, type I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>100 mg - LS004194</td><td>Enzym gebruikt in ons laboratorium als een korte spijsvertering na de eerste cocktail van neutrale protease en elastase</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>67-68-5</td><td>Oplosmiddel voor Amphotericin B gebruikt in geperforeerde hele-cel patch clamp</td></tr><tr><td>Elastase, gelyofiliseerd</td><td>Worthington Biochemical</td><td>25 mg - LS002290</td><td>Enzym gebruikt in ons laboratorium in een cocktail met neutrale protease/dispase om de spijsvertering van slagaders voor endotheelcelisolatie te beginnen.</td></tr><tr><td>Falcon weefselkweekplaat, 6-well, platte bodem met laag verdampingsdek</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Voor gebruik bij onderzoek met gekweekte cellen en meerdere behandelingen</td></tr><tr><td>Neutrale protease/dispase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td><td>Enzym gebruikt in ons laboratorium in een cocktail met elastase om de spijsvertering van slagaders voor endotheelcelisolatie te beginnen</td></tr><tr><td>SylGard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Siliconen elastomeer voor het hechten van het rechthoekige dekglas aan de MPP flowkamer stukken C en E (Figuur 1)</td></tr><tr><td>Tygon ND 10-80 slang</td><td>Microbore Tubing</td><td>AAQ04133</td><td>ID: 0,05 in, OD: 0,09 in, inlaatperfusieslang voor het toedienen van stroming naar de kamer</td></tr></tbody></table>

elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Vloeibare shear stress is bekend om een belangrijke rol in de endotheliale functie te spelen. In de meeste vasculaire bedden, verhoogde shear stress van acute stijgingen van de bloedtoevoer activeert een signalering Cascade resulterend in vasodilatatie daardoor verlichten mechanische belasting op de vaatwand. Het patroon van shear stress is ook bekend als een kritische factor in de ontwikkeling van atherosclerose met laminaire shear stress wordt atheroprotective en verstoorde shear stress Pro-atherogenic. Terwijl we een gedetailleerd begrip van de verschillende tussenliggende cel signalering trajecten, de receptoren die eerst de mechanische stimulans vertalen in chemische bemiddel kers zijn niet volledig begrepen. Mechanosensitive ionenkanalen zijn van cruciaal belang voor de respons op afschuiving en regelen shear-geïnduceerde cel signalering waardoor de productie van vasoactieve mediatoren. Deze kanalen behoren tot de vroegste geactiveerde signalering componenten te scheren en zijn gekoppeld aan shear-geïnduceerde vasodilatatie door het bevorderen van stikstofmonoxide productie (bv, naar binnen rectificeren K+ [Kir] en voorbijgaande receptor potentieel [TRP] kanalen) en endotheel hyperpolarisatie factor (bijv. Kir en calcium-geactiveerde K+ [KCA] kanalen) en door afschuiving veroorzaakte vasoconstrictie door een onbepaald mechanisme dat piëzo-kanalen omvat. Het begrijpen van het biopfysische mechanisme waarmee deze kanalen worden geactiveerd door afschuifkrachten (d.w.z. direct of via een primaire mechano-receptor) kan potentiële nieuwe doelen bieden om de pathofysiologie te verhelpen die gepaard gaat met endotheliale disfunctie en atherogenese. Het is nog steeds een grote uitdaging om doorstroming geïnduceerde activering van ionenkanalen in real-time te registreren met behulp van elektrofysiologie. De standaardmethoden om cellen bloot te stellen aan goed gedefinieerde shear stress, zoals de kegel-en plaat rheometer en de gesloten parallelle plaat stroom kamer staan geen real-time studie toe van de activering van ionenkanalen. Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven die real-time elektrofysiologische opname van mechanosensitieve ionenkanalen onder welomschreven shear stress mogelijk maakt.

Meerdere Foto's met verschillende weergaven van de MPP-stroom kamer op de Microscoop (bovenste paneel) en een schematische weergave van de MPP-stroom kamer (onderste paneel) worden weergegeven in Figuur 1. De schematische Details van de afmetingen van het gehele apparaat en de stroom kamer. Figuur 2 toont een foto van het zwaartekracht perfusie systeem aan de MPP-stroom kamer in ons laboratorium (bovenste paneel). Ook is een sche...

Het doel van dit protocol is om een gemodificeerde parallelle plaat stroom kamer te beschrijven voor gebruik bij het onderzoeken van real-time activering van mechanosensitieve ionenkanalen door shear stress.

Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Het gebruik van de gewijzigde parallelle plaat stroomkamer kan onderzoekers helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de functionele reactie van mechanosensitive ionkanalen op schuifstress. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt real-time onderzoek te stromen geactiveerde ionkanalen in een gemakkelijk te monteren, herbruikbare parallelle plaat flow kamer. Om te beginnen met de procedure, breng een dunne laag siliconen elastomeer oplossing rond de randen van de rechthoekige ruimte van stuk C, en voorzichtig plaats de rechthoekige deksel glas, stuk D, direct op de elastomeer oplossing om volledig te dekken de open rechthoekige ruimte van stuk C.Zorgvuldig wegvegen overtollige siliconen elastomeer oplossing.Herhaal vervolgens de procedure voor het vasthouden van het rechthoekige afdekglas, stuk F, aan de onderkant van stuk E en laat de siliconen elastomeeroplossing 's nachts bij kamertemperatuur genezen. Nu, monteer de MPP flow kamer door achtereenvolgens het plaatsen van elk stuk op de top van de vorige, te beginnen met de onderste kamer, stuk E, dan stuk C, stuk B, gevolgd door stuk A op de top. Vervolgens lijnen de schroefgaten van elk stuk op de hoeken en stevig schroef de stukken samen om lekken te voorkomen tijdens het beheer van de stroom naar de MPP flow chamber.In een zes-put plaat, plaats vier tot vijf, 12 millimeter dekking glazen cirkels in elke put. Sla de cellen tussen 10% en 30%-samenvloeiing op, zodat enkele cellen toegankelijk zijn voor elektrofysiologische opnames. Vervolgens, incubeer de cellen onder standaard kweekomstandigheden voor niet minder dan twee uur om cellen te hechten, en niet meer dan 24 uur, als endotheelcellen zal plat en moeilijk te patchen wanneer gezaaid op subconfluency voor meer dan 24 uur.Verwijder vervolgens een afdekglas met de aangehangen cellen uit een put van de zes-put plaat en spoel snel in PBS. Breng vervolgens het afdekglas met cellen over op een petrischaal van 35 millimeter met twee milliliter elektrofysiologische BAF-oplossing. Breng het afdekglas met cellen onmiddellijk over naar de MPP-stroomkamer.Breng de afdekglascirkel over op het rechthoekige afdekglas, stuk D, dat is gehecht aan stuk C van de MPP-stroomkamer. Voeg de BAF-oplossing toe om de afdekglascirkel en de cellen volledig onder te dompelen. Plaats vervolgens de afdekglazen cirkel op stuk D zodanig dat de cellen in overeenstemming zijn met de spleet openingen van stuk B.Zorg ervoor dat de cover glas cirkel hecht aan stuk D door middel van oplossing glas hechting om verstoring van de positie van de cover glas cirkel door de stroom toepassing te voorkomen.Monteer vervolgens de MPP-stroomkamer door de stukken in de juiste volgorde aan elkaar te schroeven. Breng de kamer over naar het microscoopstadium en doorspeed onmiddellijk de kamer met BAF-oplossing. Identificeer vervolgens een gezonde cel met een donkere rand en duidelijke kern voor het experiment.Vermijd cellen die lijken te zijn blubbing of cellen die in contact zijn met andere cellen. Om shear stress te controleren, het opzetten van een zwaartekracht perfusie systeem door het aansluiten van een 30 milliliter afgestudeerd spuitcilinder op een drie-weg Luer slot uitgerust met microbore buizen. Bevestig vervolgens de gegradueerde cilinder aan de Kooi van Faraday rond de elektrofysiologie-installatie met dubbelzijdige tape.Voordat u de slang in de MPP-kamer plaatst, vult u de spuit en de slang vooraf met BAF-oplossing. Steek vervolgens de slang in het MPP-stroomkamerinlaatgat van stuk A.Vul de MPP-stroomkamer vooraf met oplossing, zodat deze in het vacuümreservoir wordt verwijderd. Stop de stroom naar de kamer en vul de gegradueerde cilinder aan de bovenste markering.Bereken de stroomsnelheid handmatig met behulp van een stopwatch door de oplossing door de kamer te laten stromen op een bepaalde spuitcilinderhoogte. Verhoog of verlaag de spuit om de stroom te veranderen en bereken de schuifspanning in een parallelle kamer met behulp van deze vergelijking. Herhaal dit proces totdat een gewenst niveau van afschuifstress is gevonden.Breng vervolgens een geassembleerde kamer met aangehangen cellen over naar het microscoopstadium van de elektrofysiologie-installatie. En steek de slang, voorgevuld met BAF-oplossing, in het gat van stuk A.Dan, vul de kamer en was de cellen met 10 milliliter BAF oplossing, tegelijkertijd. Zodra de gewenste patch configuratie met succes is verkregen, laat kanaalstromen te stabiliseren in een statisch bad bij kamertemperatuur.Zodra de stromingen zijn gestabiliseerd, toe te passen schuin op een stap-wise manier, waardoor de verhoogde stroom te stabiliseren voorafgaand aan de volgende stap van shear stress te verhogen. Verwijder schuinte blootstelling aan de cellen door het stoppen van de stroom naar de kamer, waardoor mechanosensitive kanaalstromen om terug te keren naar baseline stromen waargenomen in het statische bad. Hier getoond is een representatieve ruwe opname van Kir stroom van een primaire muis mesenterische endotheelcel met opmerkelijke lineaire uitgaande lekstroom.Een helling van negatieve 140 tot positieve 40 millivolt werd toegepast op de patch meer dan 400 milliseconden. Lek stroom voorkomt dat de analyse van echte Kir kanaal activiteit. Om lekstroom af te trekken, berekent u eerst de lineaire hellinggeleiding van lekstroom.Meerdere G helling door overeenkomstige spanningen van de gehele ruwe spoor te plotlek stroom op de ruwe gegevens. De lijn moet het uitgaande lineaire lek precies bedekken. Trek vervolgens de uitgeplosde lekstroom af van het hele spoor, zodat de lineaire uitgaande stroom ongeveer nul picoamperes per picofarad is en de echte Kir-stroom kan worden geanalyseerd.Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de juiste positie van de cover glas in de kamer, zodat cellen toegankelijk zijn voor experimenten. Zorg er bovendien voor dat de afdekslip voldoende is nageleefd op stuk D, zodat de vloeistofstroom het afdekglas met cellen niet verstoort.

electrophysiological-recordings-single-cell-ion-currents-under-well

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

Dit protocol schetst de kwantificering van de mechanische eigenschappen van kankerachtige en niet-kankerachtige cellijnen in vitro. Geconserveerde verschillen in de mechanica van kankercellen en normale cellen kunnen fungeren als een biomarker die implicaties kan hebben voor de prognose en diagnose.

Shear Assay Protocol voor de bepaling van eencellige materiaaleigenschappen

Dit protocol beschrijft een snelle en efficiënte methode voor het isoleren van gladde spiercellen uit de basilaire slagader van de rat en het registreren van naar binnen gelijkrichtende kaliumkanaalstromen in deze cellen met behulp van de patchklemtechniek voor de hele cel. Het biedt een nieuwe benadering voor onderzoekers die de basilaire slagader en ionenkanalen bestuderen.

Registratie van naar binnen rectificerende K+- stromen in vers geïsoleerde gladde spiercellen van de arteria basilaris door middel van patch-clamp-techniek

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Leer elektrofysiologische opnames van mechanosensitieve ionkanalen onder afschuifspanning met een gemodificeerde parallelplaat-stroomkamer. Deze herbruikbare methode maakt real-time onderzoek naar mechanotransductie in cellen mogelijk.

Elektrofysiologische opnames van eencellige ionen stromen onder welomschreven afschuif spanning

Meer video's verkennen