Name: Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer praktische methoden om ziekte-gerelateerde RAF kinase mutanten te karakteriseren met in vitro kinase assays en luciferase assays. Deze technieken zijn gevoelig, reproduceerbaar en kosteneffectief.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de Hairy Cell Leukemia Fellowship voor steun van Yuan Jimin erkennen. Dit werk werd gesteund door Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), hertog-NUS Khoo Bridge funding Award (hertog-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging subsidie (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), en SHF academische geneeskunde Onderzoeksbeurs (AM/TP011/2018).

1. in vitro kinase test voor het meten van de katalytische werking van de mutanten van de
<ol><li>Construct vectoren coderen RAF mutanten (afbeelding 1A) met vlag (DYKDDDDK) tag bij C-Terminus met behulp van Gibson assembly of traditionele moleculaire klonen methoden.
	<ol>
<li>Introduceer de vlag tag en mutaties in de RAF-coderings sequenties door PCRs, en voeg vervolgens hele sequenties in pcdna 3.1 (+) vector met behulp van Gibson assembly of T4 DNA ligatie en volgens de protocollen van de fabricage. Gebruik de volgende voorwaarden voor PCR-reacties: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 cycli van (2 tot 4); (6) 4 °C vasthouden. Opmerking: De PCR-primers voor het klonen: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 en 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.</li>
		<li>Voeg de GST-coderings volgorde stroomopwaarts van de RAF Mutant codering sequenties voor het genereren van vectoren codering GST-gesmolten RAF mutanten met behulp van dezelfde methoden zoals beschreven in stap 1.1.1.</li>
		<li>Valideer alle vectoren door DNA sequencings voor Transfectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaat 293T cellen in 6-goed platen met een dichtheid van 5 x 105 cellen/goed één dag voor de trans-fectie. Wanneer de celdichtheid bereikt 80 ~ 90% samenloop op de tweede dag, transfect met vectoren coderen vlag-Tagged RAF kinases of hun mutanten uit stap 1,1 in cellen door het volgen van het Protocol van de vervaardiging van transfectie reagentia (tabel van materialen).</li>
	<li>Vervang het kweekmedium 24 uur na transfectie.</li>
	<li>Aspirate het kweekmedium 48 h na transfectie en Voeg 400 μL/goed van de lysisbuffer toe (25 mM tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) aangevuld met protease-en fosfatase remmers op lyse cellen op ijs. Opmerking: De concentratie van NP-40 in de lysisbuffer is van cruciaal belang voor het opsporen van de katalytische werking van mutanten van de RAF met matige dimeer affiniteit/stabiliteit in vitro. Een hoge concentratie van detergens of een sterk wasmiddel in lysisbuffer kan RAF Dimeren breken en daarmee de katalytische activiteit van RAF kinases of hun mutanten doden.</li>
	<li>Breng de cellysaten over in een buis van 1,5 mL en draai het met 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om celresten af te breken.</li>
	<li>Breng 300 μL per monster van schone gehele cellijnen naar 1,5 mL buizen, Voeg 20 μL per steekproef van anti-FLAG-affiniteits kralen toe en draai in een koude ruimte (4 °C) voor 1 uur. Neem ook 40 μL per monster van schoon hele celllysaat opzij voor het detecteren van de expressie en de activiteit (phospho-ERK1/2) van de RAF mutanten door immunoblots zoals hieronder beschreven.</li>
	<li>Was de anti-FLAG kralen één keer met lysisbuffer, dan eenmaal met kinase reactiebuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mm na3vo4, 0,5 mm DTT, pH 7,2) en Voeg 20 μl kinase reactiemengsel toe (2 μg MEK1 (K97A) en 100 μM ATP in 20 μL kinase re actie buffer) per sample. Opmerking: De kraal wassen moet voorzichtig en snel worden voltooid, de residuele buffer moet volledig worden opgezuigen voordat het kinase reactiemengsel toe te voegen, en alle operaties bij deze stap moeten worden uitgevoerd bij 4 ° c in een koude ruimte.</li>
	<li>Inbroed de kinase reacties bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 10 minuten, en draai de buisjes met kinase reacties met de vingers om de andere minuut tijdens de incubatie.</li>
	<li>Voeg 5 μL van 5x SDS sample buffer (375 mM tris · HCl, 9% natriumdodecylsulfaat (SDS), 50% glycerol, 0,03% Bromophenol blauw) per monster om kinase reacties te stoppen, en verwarm vervolgens de monsters bij 90 °C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voer de monsters uit in 9 ~ 12% polyacrylamidegel elektroforese (pagina) met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van fosho-MEK en RAF mutanten in monsters door immunoblots. Opmerking: De fosho-MEK kan ook worden gekwantificeerd met behulp van γ32P-ATP-integratie. Kort, 10 μM γ32P-ATP wordt toegevoegd aan de kinase reactiebuffer, en de hoeveelheid fosforyleerd MEK wordt vervolgens gekwantificeerd na pagina scheiding met behulp van standaard autoradiografie, phosphorimaging, of vloeibare Scintillatie tellings technieken als Passende.</li>
</ol>2. RAF co-activatie assay voor de evaluatie van de Allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten
<ol><li>Construct vectoren coderen van de RAF-ontvanger (CRAF kinase domein met unfosforylatable NtA motief, AAFF) of de kinase-Dead RAF Activators (RAF kinase domein met fosforylation-mimicked NtA motief, SSDD, DDEE of DGEE) (Figuur 1A) als beschreven in stap 1,1.</li>
	<li>Transfect 293T cellen met twee vectoren coderen zowel de RAF-ontvanger en de kinase-Dead RAF Activator of een enkele vector codering een van eiwitten zoals beschreven in de stappen 1,2 en 1,3.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium om 24 uur na de transfectie en oogst 293T transfectanten op 48 h om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in stappen 1,4 en 1,5.</li>
	<li>Meng het schone hele cellysaat met 5x SDS sample buffer snel bij kamertemperatuur (25 °C) en kook vervolgens gedurende 5 minuten bij 90 °C.</li>
	<li>Voer de gekookte whole Cell lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS, breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan en Detecteer de niveaus van phospho-ERK1/2 en controle eiwitten door immunoblots.</li>
</ol>3. gratis Split Luciferase assay voor het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de RAF mutanten
<ol><li>Construct vectoren codering vlag-Tagged RAF mutanten versmolten met het N-eindpunt van Nluc (N-Terminus van Firefly Luciferase, Aa2-416) of het C-eindpunt van Cluc (C-Terminus van Firefly Luciferase, aa398-550) zoals beschreven in stap 1,1.</li>
	<li>Transfect 293T cellen met een paar vectoren coderen verschillende Nluc-RAF mutanten en Cluc-RAF mutanten zoals beschreven in stap 1,2.</li>
	<li>Bij 24 h na transfectie, replate 293T celtransfectants in Krystal Black beeld platen bij de celdichtheid van 2x105 per goed met kleur vrij medium (dat wil zeggen, DMEM zonder fenolrood).</li>
	<li>24 h later, Voeg D-Luciferin (0,2 mg/ml) aan 293t celtransfectants, inbroed gedurende 30 min, en meet de plaats signalen met behulp van een multi-detectiesysteem (tabel van de materialen).</li>
	<li>Na het meten van de plaats-signalen, aspireren de medium en lyse 293t transfectants met lysis buffer om de hele celllysates voor te bereiden zoals beschreven in de stappen 1,4 en 1,5.</li>
	<li>Voer de hele cel lysaat samples uit in 9 ~ 12% pagina met 0,1% SDS en Detecteer de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten door Anti-Flag immunoblot zoals beschreven in stap 2,5. De relatieve uitdrukkings niveaus van zowel Nluc-RAF Mutant als Cluc-RAF mutant in 293T transfectants worden gekwantificeerd met behulp van afbeelding J van hun immunoblots.</li>
	<li>Normaliseer de plaats-signalen van 293t celtransfectanten volgens de uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten. In het kort wordt dit bereikt door het ruwe plaats-signaal te delen door de relatieve uitdrukkings niveaus van nluc-RAF mutanten en cluc-RAF mutanten uit stap 3,6.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
<li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAF+proteins+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li>
<li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+nature%3A+biological+functions+of+the+Raf-1+%22kinase%22%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li>
<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
<li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li>
<li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Raf%2FMEK%2FERK+pathway+in+cell+growth%2C+malignant+transformation+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Biophysics+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li>
<li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guilty+as+charged%3A+B-RAF+is+a+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li>
<li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li>
<li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1%2C+but+not+B-Raf+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li>
<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras%2C+CRAF+and+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li>
<li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases%3A+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li>
<li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li>
<li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li>
<li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit artikel presenteerden we drie methoden voor het karakteriseren van de ziekte-gerelateerde RAF mutanten, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en gratis Split plaats assay. Aangezien RAF kinases zowel katalytische activiteit als allosterische activiteit hebben, kunnen verschillende RAF-mutanten de stroomafwaartse signalering activeren via twee verschillende mechanismen13,14,16,<sup class="xre...

De RAF familie kinases zijn een belangrijk onderdeel van RAS/RAF/MEK/ERK signalering Cascade, die een signaal van RAS te activeren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MEK)1,2,3,4. Deze familie van kinasen speelt een cruciale rol in celgroei, overleving en differentiatie, en hun veranderingen induceren vele ziekten, met name kanker5,6,7,8. Onlangs hebben genomische sequencings veel ziektegerelateerde RAF-mutanten geïdentificeerd die verschillende eigenschappen vertonen in de signaaloverdracht van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade9,10,11. Een zorgvuldige karakterisering van de mutanten van de RAF zal ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen van hoe de mutanten van de RAF de signaal output van RAS/RAF/MEK/ERK Cascade veranderen, en uiteindelijk passende benaderingen selecteren voor de behandeling van verschillende door de RAF gemuteerde ziekten.
De familie van de RAF kinases omvatten drie leden, CRAF, braf, en Araf, die vergelijkbare moleculaire structuren, maar verschillende capaciteiten te activeren downstream signalering1,2,3,4. Onder deze paralogs heeft braf de hoogste activiteit op grond van zijn constitutief gefosforyleerde NTA (N-terminal acidic) motief12,13,14, terwijl Araf de laagste activiteit die voortvloeit uit het niet-canonieke APE motief15. Dit kan verklaren de verschillende mutatie frequenties van RAF paralogs in ziekten: BRAF > CRAF > ARAF. Bovendien, binnen dezelfde RAF Paralog, mutaties in verschillende locaties kunnen leiden tot downstream signalering in verschillende manieren, die voegt een extra laag van complexiteit aan de regulering van de RAF familie kinases. Recente studies hebben aangetoond dat alle RAF kinases zowel de katalytische als de allosterische activiteiten13,14,16,17,18hebben. Constitutief actieve RAF-mutanten zetten de stroomafwaartse signalering rechtstreeks door fosforylating MEK, terwijl kinase-dode RAF-mutanten hun wild type tegenhangers kunnen transactiveren door middel van Side-to-side door dimerisatie en MEK-ERK-signalering16 activeren ,19,20. De dimeer-affiniteit/-stabiliteit is een belangrijke parameter die niet alleen de allosterische activiteit van kinase-dode RAF-mutanten bepaalt, maar ook de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten beïnvloedt,15,21, 22. de kinase-dode RAF mutanten met een hoge dimeer affiniteit/stabiliteit kunnen de endogene wild-type RAFs rechtstreeks transactiveren15, terwijl die met intermediaire dimeer affiniteit/stabiliteit vereist een coördinatie van actieve RAS of een verhoogde niveau van wild-type RAF moleculen om te functioneren13,15,20,21,23. Evenzo, grondwettelijk actieve RAF mutanten fosforylaat MEK in een dimeer-afhankelijke manier, en degenen met een lage dimeer affiniteit/stabiliteit verliezen hun katalytische activiteit in vitro op immunoprecipitatie die de zwakke RAF Dimeren breekt15, 21,22. De dimeer affiniteit/stabiliteit bepaalt ook de gevoeligheid van de RAF mutanten aan hun remmers, en positief correleert met de weerstand van de RAF-remmers24. Om ziekte-gerelateerde RAF-mutanten te karakteriseren, is het daarom noodzakelijk om hun katalytische en allosterische activiteiten te meten, en dimeer affiniteit/stabiliteit.
In de afgelopen jaren hebben ons laboratorium en anderen verschillende methoden ontwikkeld om RAF familie kinasen en hun mutanten te karakteriseren. Volgens ons laboratorium en de ervaring van anderen, denken we dat de volgende drie assays voordelen hebben bij het bepalen van ziekte-gerelateerde RAF-mutanten: (1) de in vitro kinase assay die gemakkelijk kan worden uitgevoerd om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF mutanten15; (2) de RAF co-Activation assay is een betrouwbare en handige methode om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten13,15,21,22,23, 25; (3) de gratis gesplitste plaats test die een veel hogere gevoeligheid heeft bij het meten van de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van de mutanten van de RAF in tegenstelling tot de traditionele Co-Immunoprecipitation Assay, en is in staat om uit te voeren zonder geavanceerde apparatuur in contrast met de kwantitatieve analytische methoden zoals SPR (Sppervlakte Plasmon Resonance) analyse15,22. Door deze drie testen te combineren, kunnen we gemakkelijk begrijpen hoe een ziektegerelateerde RAF Mutant de downstream signalering verandert en zo een geschikte therapeutische strategie gebruiken om de ziekte te behandelen die wordt veroorzaakt door deze RAF-mutatie.

<table><tbody><tr><td>anti-phosphoERK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anti-phosphoMEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK1/2</td><td>AB clonal</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anti-MEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(muis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG(Konijn)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG kralen(M2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd anti-muis IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd anti-Konijn IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning  Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM zonder fenolrood</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferine </td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis-getagged MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp;bereid in onze eerdere studies</td><td>N.A.</td><td>Referentie 15.</td></tr><tr><td>GloMax-Multi Detectie Systeem.</td><td>Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van raf familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

De snel versnelde fibrosarcoma (RAF) familie kinasen spelen een centrale rol in de celbiologie en hun disfunctie leidt tot kankers en ontwikkelingsstoornissen. Een karakterisering van ziekte-gerelateerde RAF mutanten zal ons helpen bij het selecteren van passende therapeutische strategieën voor de behandeling van deze ziekten. Recente studies hebben uitgewezen dat de kinasen van de RAF-familie zowel katalytische als allosterische activiteiten hebben, die strak gereguleerd worden door dimerisatie. Hier bouwden we een reeks praktische en haalbare methoden om de katalytische en allosterische activiteiten en de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van RAF familie kinasen en hun mutanten te bepalen. Ten eerste hebben we de klassieke in-vitro kinase assay aangepast door de detergens concentratie in buffers te verminderen, gebruikmakend van een zachte Quick Wash procedure, en het gebruik van een glutathion S-transferase (GST) fusie om te voorkomen dat RAF Dimeren van dissociatie tijdens Zuivering. Dit stelt ons in staat om de katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten adequaat te meten. Ten tweede ontwikkelden we een roman RAF co-Activation assay om de allosterische activiteit van kinase-dode RAF mutanten te evalueren door gebruik te maken van N-terminale afgeknotte RAF-eiwitten, waardoor de eis van actieve RAS in huidige protocollen wordt geëlimineerd en daardoor een hogere Gevoeligheid. Ten slotte genereerden we een unieke complementaire Split plaats-test om de relatieve dimeer affiniteit/stabiliteit van verschillende RAF-mutanten te kwantificeren, wat betrouwbaarder en gevoeliger is in vergelijking met de traditionele Co-Immunoprecipitation-assay. Kortom, deze methoden hebben de volgende voordelen: (1) gebruiksvriendelijk; (2) in staat zijn om effectief te kunnen uitvoeren zonder geavanceerde apparatuur; (3) kosteneffectief; (4) zeer gevoelig en reproduceerbaar.

De familie kinasen van de RAF hebben zowel katalytische als allosterische activiteiten, waardoor hun ziektegerelateerde mutanten de stroomafwaartse signalering kunnen inschakelen via verschillende mechanismen13,14,16,17 ,18. De constitutief actieve RAF mutanten direct fosforylaathun substraten, terwijl de kinase-dode RAF mutanten hun functie vervullen door he...

In dit artikel presenteerden we een reeks praktische en haalbare methoden voor het karakteriseren van ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen, waaronder in vitro kinase Assay, RAF co-Activation Assay, en complementaire Split plaats assay.

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Deze methode vergemakkelijkt de effectieve karakterisering van ziektegerelateerde RAF kinase-methoden. Deze techniek is zeer gevoelig en reproduceerbaar, kosteneffectief, gebruiksvriendelijk en vereist geen geavanceerde apparatuur. Om de katalytische activiteit van RAF-mutanten te meten, introduceert u flag tech mutaties in de RAF-coderingsvolgorde door PCR, voordat u hele sequenties in de juiste vector invoegt volgens standaardprotocollen.Plaats de glutathion als transferase coding sequentie stroomopwaarts van de RAF mutant codering sequenties, om vectoren coderen glutathion als transferase gesmolten RAF mutanten te genereren, op dezelfde manier. Transvect 80%tot 90% confluent 293T celculturen met de vectoren codering van de vlag gelabeld RAF kinases of hun mutanten, volgens de normen protocollen. Na 24 uur cultuur, vervang het medium in elke cultuur.Voeg na 48 uur cultuur 400 microliters lysebuffer toe, aangevuld met protease en fosfphataseremmers, aan elke put op ijs. Na vijf tot tien minuten breng je de cellysates over naar een buis van 1,5 milliliter voor centrifugatie om het celpuin te bespeuren. Breng 300 microliter van elk monster over in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.Zet 40 microliter per monster opzij voor downstream groothandelssfosiel extra cellulair signaal gereguleerde kinase één en twee expressie- en activiteitsamtatieanalyse. Voeg 20 microliter anti-FLAG affiniteit kralen aan elke buis, voor een uur incubatie met rotatie in een vier graden Celsius koude kamer. Aan het einde van de incubatie snel en voorzichtig wassen van de anti vlag kralen een keer met lyse buffer in de koude kamer en een keer met kinase reactie buffer voor het toevoegen van 20 microliters van kinase reactie mengsel.Grafmutanten met een lage Dima-affiniteit kunnen hun katalytische activiteit in vitro verliezen als gevolg van Dima-dissociatie. Daarom is de snelle en zachte was van cruciaal belang. Na 10 minuten bij kamertemperatuur met omkerende om de andere minuut, stop de kinase reacties met vijf microliters van vijf XSDS monsterbuffer, per monster en kook de monsters op 90 graden Celsius gedurende vijf minuten.Voer aan het einde van de incubatie de monsters uit op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel met 0,1%SDS en breng de eiwitten vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan om detectie van de niveaus van fosfo-mitogeneactiveerde eiwitkinasen en RAF-mutanten in elk monster, door middel van immunoblotting. Om de Allosteric activiteit van kinase dode RAF mutanten te evalueren, bouwen vectoren codering van de RAF ontvanger of de kinase dode RAF activators. Transvect 293 T cellen met twee vectoren coderen zowel de RAF ontvanger en de kinase dode RAF activator, of een enkele vector coderen een van de eiwitten zoals aangetoond.Oogst de hele cel lysates na 48 uur cultuur zoals aangetoond, en meng snel de schone hele cel lysate met vijf XSDS monster buffer op kamertemperatuur, Voor het koken van de lysates gedurende vijf minuten op 90 graden Celsius. Voer vervolgens de gekookte hele cel lysaat monsters op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel dat is 0,1% SDS en breng de eiwitten naar een nitrocellulose membraan voor het opsporen van de niveaus van fosfor extra cellulair signaal geregeld kinase een en twee en controle eiwitten door immuun blotting zoals aangetoond. Om de relatieve dimer affiniteit en of stabiliteit van de RAF mutanten te meten construeren vectoren coderen vlag tech ontwerp mutanten gesmolten aan het eindpunt van Firefly luciferase of de C Terminus een firefly luciferase.Transvect 293 T cellen met een paar vectoren coderen verschillende en Terminus van firefly luciferase RAF mutanten en C Terminus een firefly luciferase RAF mutanten zoals aangetoond. 24 uur na de transvection replate twee keer 10 naar de vijfde 293 T cel transacties per goed in kristalzwarte beeldplaten in kleur vrij medium. 48 uur na de travestie voeg de luciferin toe aan 293 T celtransctenten en broed gedurende 30 minuten.Voor het meten van de luciferase signalen op een multi detectie systeem. Aan het einde van de meting aspirate de supernatents, en blice de afgehandelde 293 T cellen met lysas buffer zoals aangetoond. Voer de hele cel lysate monsters op een negen tot 12%polyacrylamide elektroforese gel met 0,1%SDS.Detecteer de expressieniveaus van het eindeinde van Firefly luciferase RAF mutanten, of het C-eindpunt van Firefly luciferase RAF mutanten door anti vlag amino vlek zoals aangetoond. Normaliseer dan de luciferase signalen van de 293 T celtransvectanten volgens de expressieniveaus van het eindeinde eindeinde van Firefly luciferase en C eindpunt van Firefly luciferase RAF mutanten. De in vitro kinase asa kan worden gebruikt om effectief sonde de katalytische activiteit van sommige constitutief actieve R-spine mutanten, maar niet die van kinase dode mutanten met een gesmolten C-wervelkolom.De katalytische activiteit van constitutief actieve RAF-mutanten met een zwakke, zwakkere affiniteit of stabiliteit kan echter niet worden onderzocht door deze ASA te gebruiken omdat hun dimers tijdens het zuiveringsproces worden gebroken. Om het verlies van katalytische activiteit van RAF-mutanten met zwakke, zwakkere affiniteit of stabiliteit te voorkomen, kunnen deze mutanten worden versmolten met glutothionas transferase om de katalytische activiteit van de mutanten te redden. De RAF co-activatie ASA kan worden gebruikt om de allosterische activiteit van kinase dode RAF Mutants te evalueren.Zoals geïllustreerd kinase dode mutanten met een zuur eind terminal motief en C wervelkolom fusie, functioneren als allosterische activators om de katalytische activiteit van mutanten met een niet fosfor relateerbare zure eindterminal motief, wanneer co uitgedrukt in 293T cellen trigger. Verder kan een gratis split luciferase SA worden gebruikt voor het meten van de relatieve dimer affiniteit of stabiliteit van RAF familie kinases en hun mutanten. Het gebruik van een lysas buffer met een lage concentratie wasmiddel, en een snelle zachte wasprocedure tijdens de monsterzuivering is essentieel voor een succesvolle in vitro kinase SA. Deze techniek zal onderzoekers helpen precies te bepalen hoe ziekte relais de RAF mutanten, activeren van de downstream-route, het vergemakkelijken van de selectie van de juiste therapeutische strategieën voor de behandeling van ziekten.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.

Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Proteïne kinasen zijn hoog geëvolueerde signaal enzymen en steigers die kritisch zijn voor inter- en intracellulaire signaaltransductie. Wij presenteren een protocol voor het meten van kinase-activiteit door middel van radioactief gemerkte adenosintrifosfaat ([γ-32P] ATP), een betrouwbare methode om te helpen bij het ophelderen van cellulaire signalering regulering.

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Dit protocol beschrijft een op BRET gebaseerde test voor het meten van de interacties van het CRAF-kinase met 14-3-3-eiwitten in levende cellen. Het protocol schetst stappen voor het voorbereiden van de cellen, het uitlezen van BRET-emissies en gegevensanalyse. Er wordt ook een voorbeeldresultaat gepresenteerd met identificatie van de juiste controles en probleemoplossing voor testoptimalisatie.

Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Dit protocol beschrijft het ontwerp, de creatie en de toepassing van rapamycine-gereguleerde fosfatasen. Deze methode zorgt voor een hoge specificiteit en strakke temporele controle van de activering van fosfatase in levende cellen.

Ontwikkeling en toepassing van rapamycine-gereguleerde tyrosinefosfatasen

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer praktische methoden om ziekte-gerelateerde RAF kinase mutanten te karakteriseren met in vitro kinase assays en luciferase assays. Deze technieken zijn gevoelig, reproduceerbaar en kosteneffectief.

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

Meer video's verkennen