Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection
6 augustus 2019
Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.
Hier hebben we micro-injectie van fluorescerende RNAs toegepast om RNA-sequenties te detecteren die essentieel zijn voor de lokalisatie van korte nucleaire RNAs in nucleaire structuren genaamd Cajal-lichamen. Deze techniek heeft twee grote voordelen. Ten eerste kan het worden toegepast voor korte RNAs die anders moeilijk te labelen en te volgen zijn.
En ten tweede, het maakt een snelle screening van verschillende sequenties en het testen van hun rol in RNA lokalisatie. Een dag voor micro-injectie, zaad HeLa of andere aanhangende cellen op 12 millimeter coverslips tot 50% samenvloeiing te bereiken op het moment van microinjectie. Om te beginnen, plaats een voorbereide coverslip in het midden van een petrischaal, voeg cellen en twee millimeter van de cultuur media.
De volgende dag, plaats de cel gevuld petri schotel op een microscoop podium. Met behulp van een microloader laad je drie microliters van het snRNA-mengsel in de naald en installeer je de naald in de houder van de microinjector onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van de petrischaal. Gebruik een doelstelling van 10x lange afstand om de naald te vinden.
Stel eerst de snelheid grof op de injector en laat de naald zakken totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de microscoop verrekijker, vind het lichtpunt dat is de plaats waar de naald raakt de cultuur medium. Verander de snelheid in boete en verder lager de naald tijdens het kijken in de microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen.
Verplaats de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over naar een doelstelling van 40x lange afstand. Selecteer hierna de cel en beweeg de naald boven de cel. Stel de druk en tijd in voor het celcontact.
Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens van de micromanipulator in. Het instellen van de ondergrens is het meest kritieke deel van het protocol. Omdat het coverslipoppervlak niet perfect is en omdat elke cel anders is, moet u tijdens de injectiesessie meerdere keren de ondergrens instellen.
Beweeg vervolgens de naald terug boven de cel en druk op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt zich automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld om het RNA-mengsel te injecteren. Als u wilt voltooien, drukt u op de menuknop op de injector en verwijdert u de naald van de houder.
Koppel vervolgens de buis los van de injector voordat u de injector en de micromanipulator uitschakelt. Breng na de microinjectie de cellen terug naar een koolstofdioxide-incubator en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de cellen drie keer met PBS bij kamertemperatuur.
Bevestig de cellen gedurende 20 minuten met 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire pijpen bij pH 6.9. Was vervolgens de cellen drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA lokalisatie wordt geanalyseerd, kort spoelen van de cellen in water en monteren in een montagemedium met DAPI.
In het geval van extra eiwitlokalisatie, permeabiliseren de cellen met 0,5%Triton X-100 in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen drie keer af met PBS en bevlek ze met de juiste primaire en secundaire antilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel vervolgens drie keer met PBS en spoel één keer in water.
Monteer hierna de cellen in een montagemedium met DAPI. Wanneer klaar om te beelden, gebruik maken van een high-end fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een onderdompeling doelstelling om de beelden te verwerven. Zodra de microinjected cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 Z secties met 200 nanometer Z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie.
Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, opent u eerst het microscopiebeeld in ImageJ en splits u kanalen in vensters. Vensters synchroniseren met het gereedschap Venster synchroniseren. Trek vervolgens het gebied van belang rond een Cajal lichaam geïdentificeerd door coilin immunostaining.
Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de coilin-gedefinieerde ROI. Bepaal de intensiteit van snRNA fluorescentie in ROI willekeurig geplaatst in het nucleoplasma. Sla gemeten waarden op en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het Cajal-lichaam en nucleoplasma.
In deze studie worden fluorescerende snRNAs gemicroinjecteerd om hun transport in de cel te controleren. Om te testen of de SM-site belangrijk is voor cajal lichaam accumulatie, snRNA ontbreekt de SM-site is direct microinjected in de kern. Injectie in het cytoplasma dient als een controle, terwijl de volledige lengte snRNA is microinjected om te dienen als een positieve controle.
Na incubatie worden microinjected cellen gefixeerd en wordt de Cajal body marker coilin gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie. De volledige lengte snRNA opgebouwd in Cajal lichamen na zowel nucleaire en cytoplastische injecties. In tegenstelling, snRNA ontbreekt de SM site bleef in het cytoplasma na microinjectie in dit compartiment, terwijl de nucleaire micro-injectie van snRNA zonder de SM site blijkt dat de SM bindende sequentie is belangrijk voor Cajal lichaam lokalisatie als dit snRNA blijft in de kern, maar niet accumuleren in Cajal organen.
Soms is de micro-injectie in slechts een cellulaire compartiment mislukt en bedrogen Dextran 70 kilodalton kan worden gevonden in zowel de kern en het cytoplasma. Deze cellen worden verwijderd uit verdere analyse. Ondanks het feit dat de fluorescerende snRNAs worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius vóór de injectie, kan RNA-afbraak optreden.
Gedegradeerd snRNA geïnjecteerd in het cytoplasma wordt niet vervoerd in de kern en blijft gelokaliseerd in het cytoplasma. Dergelijke snRNA moet worden weggegooid en nieuwe snRNA moet worden gesynthetiseerd. Het is belangrijk om de injectie- en compenserende druk voor uw celtype correct aan te passen.
En zoals eerder gezegd, het instellen van de juiste ondergrens voor celinjectie is essentieel voor een goede microinjectie. Houd er rekening mee dat de fenol-chloroform die wordt gebruikt tijdens RNA-isolatie gevaarlijk is en dat de microinjectienaald een scherp voorwerp is. Wees voorzichtig bij het hanteren van deze materialen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de biogenese van spliceosomale snRNA's en hun transport binnen cellen, middels micro-injectie van fluorescentie-gelabelde snRNA's. De belangrijkste biologische vraag richt zich op de lokalisatie van deze snRNA's in nucleaire structuren die bekendstaan als Cajal-lichaampjes, wat inzicht biedt in hun essentiële sequenties voor een correcte lokalisatie.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
- RNA-lokalisatie
Achtergrond
- snRNA's spelen een cruciale rol bij splicing en RNA-verwerking.
- Inzicht in hun lokalisatie kan de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de RNA-functionaliteit verduidelijken.
- Cajal-lichaampjes zijn subnucleaire structuren die geassocieerd zijn met de verwerking van snRNA.
- Micro-injectie maakt de directe manipulatie en observatie van RNA-moleculen in levende cellen mogelijk.
Doel van de studie
- Om de transport- en lokalisatiemechanismen van spliceosomale snRNA's te onderzoeken.
- Om het belang van specifieke RNA-sequenties bij het bepalen van de snRNA-lokalisatie te evalueren.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het volgen van snRNA-moleculen binnen cellen.
Gebruikte methoden
- De microinjectietechniek werd toegepast met gebruik van fluorescentie-gelabelde snRNA's.
- HeLa-cellen werden gebruikt als biologisch model voor het bestuderen van de lokalisatie van snRNA.
- Tijdens het injectieproces werden diverse controles en aanpassingen doorgevoerd voor een nauwkeurig en betrouwbaar resultaat.
- De cellen werden gefixeerd en onderworpen aan immunofluorescentie om markers van het Cajal-lichaampje te visualiseren.
- Kwantificering van de fluorescentiesignalen werd uitgevoerd met ImageJ voor een gedetailleerde analyse.
Belangrijkste resultaten
- Het volledige snRNA lokaliseerde succesvol naar de Cajal-lichaampjes, wat de noodzaak van de SM-site voor een correcte accumulatie bevestigt.
- snRNA zonder de SM-site vertoonde een gebrekkige lokalisatie in de Cajal-lichaampjes en bleef in het cytoplasma.
- Controle-injecties toonden de verwachte transportpatronen, wat hielp bij de validatie van de resultaten.
- Incubatie en een zorgvuldige afstelling van de microinjectiemethode waren essentieel voor succesvolle resultaten.
Conclusies
- Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van snRNA-transport en -lokalisatie in levende cellen.
- Inzicht in de mechanismen van RNA-lokalisatie helpt bij het onthullen van potentiële regulatoire paden die geassocieerd zijn met RNA-activiteit.
- De inzichten die uit dit onderzoek zijn verkregen, kunnen bijdragen aan bredere moleculair-biologische studies met betrekking tot RNA-functie en cellulaire organisatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Inzicht in de lokalisatie van spliceosomale snRNA's in Cajal-lichaampjes biedt mechanistische inzichten in RNA-processeringspaden die relevant zijn voor de validatie van targets in therapeutica op basis van nucleïnezuren. De op micro-injectie gebaseerde lokalisatie-assay maakt een snelle analyse mogelijk van sequentiebepalende factoren die het subcellulaire transport sturen, wat bijdraagt aan het vroegtijdig verminderen van risico's bij RNA-gerichte modaliteiten. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van functionele RNA-elementen die cruciaal zijn voor de therapeutische effectiviteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt RNA-sequentie-elementen die de subcellulaire lokalisatie bepalen, waardoor hypothesetoetsing van functionele domeinen in snRNA mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Faciliteert snelle screening van mutante constructen om sequenties te identificeren die essentieel zijn voor accumulatie in nucleaire lichaampjes.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de betrouwbaarheid van targets door specifieke RNA-motieven te koppelen aan gevalideerde subcellulaire lokalisatiepatronen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantitatieve beoordeling van RNA-transport mogelijk via fluorescentie-intensiteitsratio's in gedefinieerde subcellulaire compartimenten.
- Operationele waarde: Biedt een herbruikbaar platform voor het testen van RNA-varianten met gestandaardiseerde read-outs voor lokalisatie-efficiëntie.
- Assay-gereedheid: Genereert kwantitatieve, op imaging gebaseerde output die geschikt is voor hit-bevestiging in RNA-gerichte screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Stelt ziekterelevante systeemcompatibiliteit vast door menselijke HeLa-cellen te gebruiken om lokalisatiemechanismen van snRNA te modelleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door sequentie-functierelaties in het nucleaire transport van RNA te definiëren.
- Voorspellende risicoreductie: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij het ontwerp van RNA-therapeutica door lokalisatie-afhankelijke functionaliteit te valideren.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces, waardoor sequentie-functieanalyse mogelijk is voorafgaand aan de fasen van lead-identificatie en preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van RNA-sequentiebepalers in subcellulaire lokalisatie en pathway-verduidelijking.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen en reproduceerbare lokalisatiemetrieken.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (fluorescentieverhoudingen tussen Cajal-lichaampjes/nucleoplasma), wat comparatieve conditieanalyse mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via het gebruik van menselijke celmodellen en gedefinieerde lokalisatie-eindpunten.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde capaciteit voor RNA-lokalisatietests die toepasbaar is over meerdere doelprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van RNA-therapeutica door het valideren van sequentie-specifieke lokalisatie in functionele nucleaire compartimenten.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van gecontroleerde micro-injectie, fixatie en kwantitatieve imaging-workflows.
- Strategische waarde: Ondersteuning van go/no-go-beslissingen door RNA-sequentiekenmerken te koppelen aan gevalideerd subcellulair transport, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van RNA-doelen mogelijk op basis van aangetoonde lokalisatiecompetentie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in micro-injectie, fluorescentiemicroscopie en kwantificatie op basis van ImageJ.
- Afhankelijk van microfluïdische injectiesystemen, fluorescentiemicroscopen met Z-sectiecapaciteit en deconvolutionsoftware.
- Vereist standaardisatie van de injectiedruk, incubatietijd en fixatieprotocollen tussen gebruikers en cellijnen.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding naar niet-adherente of primaire celmodellen.
- Praktische beperkingen omvatten het risico op RNA-degradatie en een variabele injectiesuccesrate, waardoor kwaliteitscontroles voor de integriteit van het gelabelde RNA noodzakelijk zijn.
