Name: Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer micro-injectie van fluorescerende snRNAs in HeLa-cellen om lokalisatie naar Cajal-lichaampjes te bestuderen. Deze methode onthult essentiële sequenties voor RNA-transport in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Tsjechische wetenschaps Stichting (18-10035S), het nationaal duurzaamheidsprogramma I (LO1419), institutionele ondersteuning (RVO68378050), het Europees Fonds voor regionale ontwikkeling (CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) en het subsidie Bureau van Universiteit van Charles (GAUK 134516). Verder erkennen we de Lichtmicroscopie kern faciliteit, IMG CAS, Praag, Tsjechië (ondersteund door subsidies (Tsjechisch-Bioimaging-LM2015062).

1. bereiding van Snrna's voor micro Injection
<ol><li>Bereid een DNA-template met de volledige of afgeknotte/gemuleerde versie van snRNA door PCR met behulp van een volgende PCR-instelling: 98 °C voor 60 s, 98 °C voor 15 s, 68 °C voor 30 s, 72 °C gedurende 1 minuut, 98 °C gedurende 15 sec. voor 35x en 72 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>De voorwaartse primer moet een volgorde van de organisator voor in vitro transcriptie bevatten, net stroomopwaarts van het eerste getranscribeerde nucleotide. Amplificatie U2 snRNA-sequentie met behulp van de voorwaartse primer met de T7 promoter en de reverse primer, die eindigt met het laatst getranscribeerd nucleotide (Zie tabel met materialen voor details).</li>
	<li>Synthetiseren snRNA met behulp van een Kit voor korte RNA-synthese (Zie tabel met materialen voor details) met T7 RNA polymerase. Voeg 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM trimethylguanosine Cap analoog (M32, 2, 7G (5 ') PPP (5 ') G), 1 ml van een RNA-remmer en 500-700 ng van de DNA-sjabloon aan het reactiemengsel en inbroed bij 37 °c 's nachts</li>
	<li>Voeg 1 μL (2U) DNase toe aan de reactie en bebroed 15 minuten extra bij 37 °C.</li>
	<li>Isoleren van snRNA door zure fenol/chloroform extractie. Verwijder de bovenste waterfase en voeg 1/10 van het oorspronkelijke volume van 3 M Natriumacetaat toe (pH = 5,2), 3 μL glycogeen voor betere korrel visualisatie en 2,5 volumes van 100% ethanol. Inincuberen gedurende 1 uur bij-80 °C, centrifugeer 10 min bij 14.000 x g en 4 °c.</li>
	<li>Was de pellet met 70% ethanol en los op in 12 μL Nuclease-vrij water. De gebruikelijke RNA-opbrengst was rond 600 ng/mL. Bewaren bij-80 °C.</li>
	<li>Bewaak de integriteit van in vitro getranscribeerd Snrna's door agarose gel elektroforeses.</li>
	<li>Verdun vóór micro injectie RNA tot de uiteindelijke concentratie 200 ng/mL in water dat 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa bevat.</li>
</ol>2. cellen
<ol><li>Behandel vóór het gebruik de dekstroken met 1 M HCl voor 1 uur, grondig wassen in gedistilleerd water en bewaren in 100% ethanol. Zure behandeling bevordert de hechting van cellen om celpeeling tijdens of na de injectie te voorkomen. Gebruik voor een gemakkelijkere identificatie van geïnjecteerde cellen een dekslip met een rooster.</li>
	<li>Zaad Hela of andere aanhandige cellen 1 dag voor micro injectie op 12 mm dekstroken (nr. 1 of nr. 1,5) om 50% confluentie te bereiken op het moment van micro injectie.</li>
</ol>3. injectie
Opmerking: HeLa-cellen werden microgeïnjecteerd in het gemodificeerde Eagle medium van Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glucose met fenolrood en antibiotica). Injectie werd uitgevoerd met behulp van een injector en een micro manipulator uitgerust met de steriele naald (Zie tabel met materialen voor details). Het gehele microscopisch/micromanipulator systeem werd voorverwarmd tot 37 °C gedurende ten minste 4 uur om fluctuatie van afzonderlijke delen van de Microscoop en de micro injector te voorkomen.
<ol><li>Plaats de Petri schaal (30 mm) met 2 mL kweekmedia met de Afdeklijst in het midden in de houder van de Microscoop. Laad 3 μL snRNA-mengsel in de naald met behulp van een micro lader. Installeer de naald in de houder van de micro injector in 45 ° met betrekking tot het oppervlak van de Petri schaal.</li>
	<li>Om de naald te vinden, gebruik een 10x lange afstand doel. Stel eerst de snelheid grof in op de injector en verlaag de naald totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de Microscoop verrekijker, vinden de lichte plek, dat is de plaats waar de naald raakt het cultuurmedium.</li>
	<li>Verander de snelheid in fijn en verder verlagen van de naald terwijl het kijken naar de Microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen. Beweeg de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over op een 40x lange afstand doel.</li>
	<li>Nadat u de doelstelling hebt gewijzigd, selecteert u de cel en verplaatst u de naald boven deze cel. Stel de druk en tijd voor het celcontact in (Zie Tips en probleemoplossing in discussie).</li>
	<li>Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens op de micro manipulator in. Let op dat u de naald niet onder de cel beweegt.</li>
	<li>Nadat u de ondergrens hebt ingesteld, beweegt u de naald terug boven de cel en drukt u op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld en injecteert het RNA-mengsel.</li>
	<li>Om te eindigen, druk op het knop menu op de injector en verwijder de naald uit de houder. Koppel vervolgens de buis los van de injector alvorens de injector en de micro manipulator uit te schakelen.</li>
</ol>4. fixatie en kleuring van cellen
<ol><li>Na de micro injectie, retourneer de cellen in een CO2 -incubator en incuberen bij 37 °c gedurende 1 uur.</li>
	<li>Na de incubatie, spoel de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur, Fix voor 20 min met 4% Paraformaldehyde in 0,1 M buizen pH 6,9, en was drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA-lokalisatie wordt geanalyseerd, spoel de cellen dan kort in water en Monteer deze in een afdekmedium met DAPI.</li>
	<li>In geval van extra eiwit lokalisatie, permeabiliseer de cellen met 0,5% Triton-X100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na drie spoelen met PBS, inbroed de cellen met primaire en secundaire antilichamen en na de laatste wasbeurten in PBS en korte spoeling in water, Monteer in een afdekmedium met DAPI.</li>
</ol>5. microscopie
<ol><li>Als deze niet direct na de montage wordt afgebeeld, slaat u de glaasjes op 4 °C op tot beeldvorming.</li>
	<li>Verkrijg beelden met behulp van een hoogwaardig fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een immersie doelstelling (60X of 100x/1.4 NA).</li>
	<li>Zodra microgeïnjecteerde cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 z-secties met 200 nm z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie. De maximale projecties of individuele z-stapels werden vervolgens gepresenteerd.</li>
	<li>Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, trekt u regio van belang (ROI) rond een Cajal-lichaam dat wordt geïdentificeerd door coilin-immunokleuring. Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de door coilin gedefinieerde ROI. Bepaal vervolgens de intensiteit van de snRNA-fluorescentie in ROI die willekeurig in het nucleoplasma wordt geplaatst en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het lichaam van Cajal en het nucleoplasma.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We werkten met Microinjection van fluorescently gelabelde Snrna's om sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor snRNA-lokalisatie in nucleaire Cajal-lichamen. Door een snelle en vrij eenvoudige bereiding van gelabelde Rna's (voorbereiding van DNA-Template door PCR gevolgd door in vitro transcriptie) biedt de methode een effectieve analyse van hoe verschillende sequenties bijdragen aan RNA lokalisatie. In relatief korte tijd konden we tien verschillende verwijderingen of vervangingen van het snRNA van U2 (referentie<s...

RNA splicing is een van de cruciale stappen in genexpressie, die wordt gekatalyseerd door een groot RiboNucleoProteïne complex genaamd de spliceosome. In totaal zijn meer dan 150 eiwitten en 5 kleine nucleaire rna's (snrna's) geïntegreerd in de spliceosoom in verschillende stadia van het splicing traject. De Snrna's U1, U2, U4, U5 en U6 nemen deel aan de splitsing van de grote GU-AG introns. Deze snrna's voegen zich bij de spliceosoom als voorgevormde kleine nucleaire RiboNucleoProteïne deeltjes (snrnps) die snrna bevatten, zeven SM-eiwitten geassocieerd met snrna (of like-SM-eiwitten, die associëren met de U6 snrna) en 1-12 eiwitten die specifiek zijn voor elke snRNP.
Assemblage van snRNPs omvat cytoplasmatische en nucleaire stadia. Nieuw getranscribeerd snRNA wordt geëxporteerd naar het cytoplasma waar het verwerft een ring geassembleerd uit zeven SM-eiwitten. De SM-ring dient vervolgens als een signaal voor het opnieuw importeren van snRNA terug naar de Nucleus. Defecte Snrna's die niet associëren met SM eiwitten worden bewaard in het cytoplasma1. Nieuw geïmporteerde snrnps verschijnen eerst in het lichaam van Cajal waar ze snRNP-specifieke eiwitten ontmoeten en hun rijping voltooien (beoordeeld in referentie2,3). We hebben onlangs aangetoond dat remming van de uiteindelijke rijpings stappen resulteert in vastlegging van onrijpe snrnps in Cajal-lichamen4,5. We stelden een model voor waarbij de uiteindelijke rijping van snRNP onder kwaliteitscontrole is die de toevoeging van snRNP-specifieke eiwitten en de vorming van actieve snRNPs bewaakt. Echter, moleculaire Details van hoe cellen onderscheid maken tussen correct geassembleerde volwassen en afwijkende onvolgroeide deeltjes blijven ongrijpbaar.
Om snRNA-sequenties te bepalen die essentieel zijn voor de targeting en accumulatie van Snrna's in nucleaire Cajal-lichamen, hebben we besloten om micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's in gebruik te nemen. Micro Injection was een methode van keuze omdat: 1) het vereist geen extra sequentie tag om synthetische Snrna's te onderscheiden van hun endogene tegenhangers, wat vooral belangrijk is voor korte Rna's met weinig ruimte voor het inbrengen van extra tagvolgorde; 2) het maakt analyse van sequenties die belangrijk zijn voor biogenese. De SM-reeks is bijvoorbeeld essentieel voor SM-ring assemblage en opnieuw importeren in de Nucleus6. Wanneer Snrna's worden uitgedrukt in de cel, Snrna's ontbreekt de SM sequentie zijn afgebroken in het cytoplasma en niet bereiken de Nucleus en Cajal lichamen7. Echter, Snrna's zonder de SM sequentie kunnen direct microgeïnjecteerd in de Nucleus en dus een mogelijke rol van de SM sequentie in Cajal lichaam lokalisatie geassageerd.
Hier beschrijven we in detail een micro injectie methode die we hebben toegepast om snRNA-sequenties te bepalen die nodig zijn om Snrna's in de Cajal-Body5te targeten. We toonden aan dat SM en SMN binding sites samen noodzakelijk en voldoende zijn om niet alleen Snrna's te lokaliseren, maar verschillende korte niet-Codeer Rna's in het Cajal lichaam. Op basis van Microinjection en ander bewijs, stelden we voor dat de SM-ring die op de SM-bindingsplaats is geassembleerd, het Cajal-lichaam lokalisatie signaal is.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Voorraadconcentratie 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - hoge glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Bevat 4,5 g&frasl;L D-glucose, Fenol rood en antibiotica</td></tr><tr><td>FemtoJet express Injector</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Micro-injectienaad van 0,5 &micro;m binnen- en 0,7 &micro;m buitendiameter</td></tr><tr><td>Fluoromont G met DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Voorraadconcentratie 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Gridded Glass Coverslips</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Dekvlakjes met een raster, geen directe ervaring met ze</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethielde cap analoog</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Voorraadconcentratie 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transcriptie Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Dekglasjes 12 mm, Nr. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Voor routinewerk</td></tr><tr><td>Microscoop Dekglasjes 12 mm, Nr. 1,5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Voor hoge resolutie beelden</td></tr><tr><td>Microscoop DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Voor beeldacquisitie</td></tr><tr><td>Microscoop DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 32% oplossing EM-kwaliteit</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>Opgelost in PIPES tot de uiteindelijke concentratie 4%</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Primers voor U2-amplificatie: Forward: 5’-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Reverse: 5’ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 rpromotersequentie in cursief</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Voorraadconcentratie 40 mM</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Opgelost in water, voorraadconcentratie 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Opgelost in water, voorraadconcentratie 10%</td></tr></tbody></table>

analyse van spliceosomale snrna lokalisatie in menselijke hela cellen met behulp van micro injection

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenese van spliceosomale Snrna's is een complex proces waarbij zowel nucleaire als cytoplasmatische fasen en de laatste stap optreedt in een nucleair compartiment genaamd de Cajal lichaam. Echter, sequenties die direct snRNA lokalisatie in deze subnucleaire structuur zijn niet bekend tot voor kort. Om de sequenties te bepalen die belangrijk zijn voor accumulatie van Snrna's in Cajal-lichamen, werkten we met micro injectie van fluorescently gelabelde Snrna's, gevolgd door hun lokalisatie in cellen. Eerst bereidden we snRNA deletie mutanten voor, synthetiseerde DNA templates voor in vitro transcriptie en transcribeerde Snrna's in aanwezigheid van UTP in combinatie met Alexa488. Gelabelde Snrna's werden gemengd met 70 kDa-dextran geconjugeerd met TRITC, en microgeïnjecteerde naar de Nucleus of het cytoplasma van menselijke HeLa cellen. Cellen werden gedurende 1 uur geïnincubeerd en de Cajal-Body marker coilin werd gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie, terwijl Snrna's en dextran, die dient als een marker van nucleaire of cytoplasmatische injectie, direct werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze methode maakt het mogelijk om efficiënt en snel te testen hoe verschillende sequenties de RNA lokalisatie in cellen beïnvloeden. Hier tonen we het belang van de SM-bindende sequentie voor efficiënte lokalisatie van Snrna's in de Cajal-body.

Voor het monitoren van snRNA lokalisatie en de rol van de SM binding site in Cajal Body targeting, bereidden we een DNA-template voor met de T7 promoter en ofwel de full-length U2 snRNA of U2 snRNA zonder de zeven nucleotiden (AUUUUUG) die de SM binding site vormen. Snrna's werden in vitro getranscribeerd, geïsoleerd en vermengd met TRITC-gekoppelde dextran-70kDa. We microgeïnjecteerde het mengsel dat in vitro getranscribeerd snRNA in de Nucleus of het cytoplasma van HeLa cellen.
Er is al eerd...

Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.

Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Hier hebben we micro-injectie van fluorescerende RNAs toegepast om RNA-sequenties te detecteren die essentieel zijn voor de lokalisatie van korte nucleaire RNAs in nucleaire structuren genaamd Cajal-lichamen. Deze techniek heeft twee grote voordelen. Ten eerste kan het worden toegepast voor korte RNAs die anders moeilijk te labelen en te volgen zijn.En ten tweede, het maakt een snelle screening van verschillende sequenties en het testen van hun rol in RNA lokalisatie. Een dag voor micro-injectie, zaad HeLa of andere aanhangende cellen op 12 millimeter coverslips tot 50% samenvloeiing te bereiken op het moment van microinjectie. Om te beginnen, plaats een voorbereide coverslip in het midden van een petrischaal, voeg cellen en twee millimeter van de cultuur media.De volgende dag, plaats de cel gevuld petri schotel op een microscoop podium. Met behulp van een microloader laad je drie microliters van het snRNA-mengsel in de naald en installeer je de naald in de houder van de microinjector onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van de petrischaal. Gebruik een doelstelling van 10x lange afstand om de naald te vinden.Stel eerst de snelheid grof op de injector en laat de naald zakken totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de microscoop verrekijker, vind het lichtpunt dat is de plaats waar de naald raakt de cultuur medium. Verander de snelheid in boete en verder lager de naald tijdens het kijken in de microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen.Verplaats de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over naar een doelstelling van 40x lange afstand. Selecteer hierna de cel en beweeg de naald boven de cel. Stel de druk en tijd in voor het celcontact.Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens van de micromanipulator in. Het instellen van de ondergrens is het meest kritieke deel van het protocol. Omdat het coverslipoppervlak niet perfect is en omdat elke cel anders is, moet u tijdens de injectiesessie meerdere keren de ondergrens instellen.Beweeg vervolgens de naald terug boven de cel en druk op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt zich automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld om het RNA-mengsel te injecteren. Als u wilt voltooien, drukt u op de menuknop op de injector en verwijdert u de naald van de houder.Koppel vervolgens de buis los van de injector voordat u de injector en de micromanipulator uitschakelt. Breng na de microinjectie de cellen terug naar een koolstofdioxide-incubator en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de cellen drie keer met PBS bij kamertemperatuur.Bevestig de cellen gedurende 20 minuten met 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire pijpen bij pH 6.9. Was vervolgens de cellen drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA lokalisatie wordt geanalyseerd, kort spoelen van de cellen in water en monteren in een montagemedium met DAPI.In het geval van extra eiwitlokalisatie, permeabiliseren de cellen met 0,5%Triton X-100 in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen drie keer af met PBS en bevlek ze met de juiste primaire en secundaire antilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel vervolgens drie keer met PBS en spoel één keer in water.Monteer hierna de cellen in een montagemedium met DAPI. Wanneer klaar om te beelden, gebruik maken van een high-end fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een onderdompeling doelstelling om de beelden te verwerven. Zodra de microinjected cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 Z secties met 200 nanometer Z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie.Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, opent u eerst het microscopiebeeld in ImageJ en splits u kanalen in vensters. Vensters synchroniseren met het gereedschap Venster synchroniseren. Trek vervolgens het gebied van belang rond een Cajal lichaam geïdentificeerd door coilin immunostaining.Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de coilin-gedefinieerde ROI. Bepaal de intensiteit van snRNA fluorescentie in ROI willekeurig geplaatst in het nucleoplasma. Sla gemeten waarden op en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het Cajal-lichaam en nucleoplasma.In deze studie worden fluorescerende snRNAs gemicroinjecteerd om hun transport in de cel te controleren. Om te testen of de SM-site belangrijk is voor cajal lichaam accumulatie, snRNA ontbreekt de SM-site is direct microinjected in de kern. Injectie in het cytoplasma dient als een controle, terwijl de volledige lengte snRNA is microinjected om te dienen als een positieve controle.Na incubatie worden microinjected cellen gefixeerd en wordt de Cajal body marker coilin gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie. De volledige lengte snRNA opgebouwd in Cajal lichamen na zowel nucleaire en cytoplastische injecties. In tegenstelling, snRNA ontbreekt de SM site bleef in het cytoplasma na microinjectie in dit compartiment, terwijl de nucleaire micro-injectie van snRNA zonder de SM site blijkt dat de SM bindende sequentie is belangrijk voor Cajal lichaam lokalisatie als dit snRNA blijft in de kern, maar niet accumuleren in Cajal organen.Soms is de micro-injectie in slechts een cellulaire compartiment mislukt en bedrogen Dextran 70 kilodalton kan worden gevonden in zowel de kern en het cytoplasma. Deze cellen worden verwijderd uit verdere analyse. Ondanks het feit dat de fluorescerende snRNAs worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius vóór de injectie, kan RNA-afbraak optreden.Gedegradeerd snRNA geïnjecteerd in het cytoplasma wordt niet vervoerd in de kern en blijft gelokaliseerd in het cytoplasma. Dergelijke snRNA moet worden weggegooid en nieuwe snRNA moet worden gesynthetiseerd. Het is belangrijk om de injectie- en compenserende druk voor uw celtype correct aan te passen.En zoals eerder gezegd, het instellen van de juiste ondergrens voor celinjectie is essentieel voor een goede microinjectie. Houd er rekening mee dat de fenol-chloroform die wordt gebruikt tijdens RNA-isolatie gevaarlijk is en dat de microinjectienaald een scherp voorwerp is. Wees voorzichtig bij het hanteren van deze materialen.

analysis-spliceosomal-snrna-localization-human-hela-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Hier beschrijven we een test dat de kracht van micro-injectie in combinatie met fluorescerende...

Analyse van de mRNA Nuclear Export Kinetics in zoogdiercellen door micro-injectie

RNA in situ hybridisatie (ISH) maakt de visualisatie van RNA's in cellen en weefsels mogelijk. Hier laten we zien hoe combinatie van RNAscope ISH met immunohistochemie of histologische kleurstoffen met succes kan worden gebruikt om mRNA's te detecteren die gelokaliseerd zijn in axonen in secties van muis- en menselijke hersenen.

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

Een in situ hybridisatie (ISH) protocol dat gebruikmaakt van korte antisense oligonucleotides voor alternatieve pre-mRNA-splicing patronen kunt ontdekken in muis hersenen secties wordt beschreven.

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Hier beschrijven we een in situ hybridisatie bepaling waarmee gevoelige en specifieke detectie van sequenties 50 nucleotiden met single-nucleotide resolutie op het niveau van eencellige zo kort. De assay, die kan worden uitgevoerd, handmatig of automatisch, kunt inschakelen visualisatie van splice varianten, korte reeksen en mutaties in het kader van het weefsel.

Visualiseren van genetische varianten, korte doelen en puntmutaties in het kader van de morfologische weefsel met een RNA In Situ hybridisatie Assay

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.

De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Leer micro-injectie van fluorescerende snRNAs in HeLa-cellen om lokalisatie naar Cajal-lichaampjes te bestuderen. Deze methode onthult essentiële sequenties voor RNA-transport in levende cellen.

Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection

Meer video's verkennen