Analyse van Spliceosomale snRNA lokalisatie in menselijke HeLa cellen met behulp van micro Injection
August 6th, 2019
Biogenese van spliceosomal snRNAs is een complex proces waarbij verschillende cellulaire compartimenten. Hier hebben we een micro injectie met fluorescently gelabelde Snrna's gebruikt om hun transport in de cel te bewaken.
Hier hebben we micro-injectie van fluorescerende RNAs toegepast om RNA-sequenties te detecteren die essentieel zijn voor de lokalisatie van korte nucleaire RNAs in nucleaire structuren genaamd Cajal-lichamen. Deze techniek heeft twee grote voordelen. Ten eerste kan het worden toegepast voor korte RNAs die anders moeilijk te labelen en te volgen zijn.
En ten tweede, het maakt een snelle screening van verschillende sequenties en het testen van hun rol in RNA lokalisatie. Een dag voor micro-injectie, zaad HeLa of andere aanhangende cellen op 12 millimeter coverslips tot 50% samenvloeiing te bereiken op het moment van microinjectie. Om te beginnen, plaats een voorbereide coverslip in het midden van een petrischaal, voeg cellen en twee millimeter van de cultuur media.
De volgende dag, plaats de cel gevuld petri schotel op een microscoop podium. Met behulp van een microloader laad je drie microliters van het snRNA-mengsel in de naald en installeer je de naald in de houder van de microinjector onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van de petrischaal. Gebruik een doelstelling van 10x lange afstand om de naald te vinden.
Stel eerst de snelheid grof op de injector en laat de naald zakken totdat deze het kweekmedium raakt. Met behulp van de microscoop verrekijker, vind het lichtpunt dat is de plaats waar de naald raakt de cultuur medium. Verander de snelheid in boete en verder lager de naald tijdens het kijken in de microscoop totdat de punt van de naald wordt waargenomen.
Verplaats de naald in het midden van het gezichtsveld en schakel over naar een doelstelling van 40x lange afstand. Selecteer hierna de cel en beweeg de naald boven de cel. Stel de druk en tijd in voor het celcontact.
Beweeg de naald naar beneden in de cel en stel vervolgens de ondergrens van de micromanipulator in. Het instellen van de ondergrens is het meest kritieke deel van het protocol. Omdat het coverslipoppervlak niet perfect is en omdat elke cel anders is, moet u tijdens de injectiesessie meerdere keren de ondergrens instellen.
Beweeg vervolgens de naald terug boven de cel en druk op de injectieknop op de joystick van de injector. De naald beweegt zich automatisch in de cel naar de plaats waar de limiet is ingesteld om het RNA-mengsel te injecteren. Als u wilt voltooien, drukt u op de menuknop op de injector en verwijdert u de naald van de houder.
Koppel vervolgens de buis los van de injector voordat u de injector en de micromanipulator uitschakelt. Breng na de microinjectie de cellen terug naar een koolstofdioxide-incubator en broed gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Spoel vervolgens de cellen drie keer met PBS bij kamertemperatuur.
Bevestig de cellen gedurende 20 minuten met 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire pijpen bij pH 6.9. Was vervolgens de cellen drie keer met kamertemperatuur PBS. Als alleen snRNA lokalisatie wordt geanalyseerd, kort spoelen van de cellen in water en monteren in een montagemedium met DAPI.
In het geval van extra eiwitlokalisatie, permeabiliseren de cellen met 0,5%Triton X-100 in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen drie keer af met PBS en bevlek ze met de juiste primaire en secundaire antilichamen zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel vervolgens drie keer met PBS en spoel één keer in water.
Monteer hierna de cellen in een montagemedium met DAPI. Wanneer klaar om te beelden, gebruik maken van een high-end fluorescentie microscopisch systeem uitgerust met een onderdompeling doelstelling om de beelden te verwerven. Zodra de microinjected cellen zijn geïdentificeerd, verzamel een stapel van 20 Z secties met 200 nanometer Z stappen per monster en onderworpen aan wiskundige deconvolutie.
Om het fluorescerende signaal te kwantificeren, opent u eerst het microscopiebeeld in ImageJ en splits u kanalen in vensters. Vensters synchroniseren met het gereedschap Venster synchroniseren. Trek vervolgens het gebied van belang rond een Cajal lichaam geïdentificeerd door coilin immunostaining.
Meet de intensiteit van het snRNA-signaal in de coilin-gedefinieerde ROI. Bepaal de intensiteit van snRNA fluorescentie in ROI willekeurig geplaatst in het nucleoplasma. Sla gemeten waarden op en bereken de verhouding van het RNA-signaal in het Cajal-lichaam en nucleoplasma.
In deze studie worden fluorescerende snRNAs gemicroinjecteerd om hun transport in de cel te controleren. Om te testen of de SM-site belangrijk is voor cajal lichaam accumulatie, snRNA ontbreekt de SM-site is direct microinjected in de kern. Injectie in het cytoplasma dient als een controle, terwijl de volledige lengte snRNA is microinjected om te dienen als een positieve controle.
Na incubatie worden microinjected cellen gefixeerd en wordt de Cajal body marker coilin gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie. De volledige lengte snRNA opgebouwd in Cajal lichamen na zowel nucleaire en cytoplastische injecties. In tegenstelling, snRNA ontbreekt de SM site bleef in het cytoplasma na microinjectie in dit compartiment, terwijl de nucleaire micro-injectie van snRNA zonder de SM site blijkt dat de SM bindende sequentie is belangrijk voor Cajal lichaam lokalisatie als dit snRNA blijft in de kern, maar niet accumuleren in Cajal organen.
Soms is de micro-injectie in slechts een cellulaire compartiment mislukt en bedrogen Dextran 70 kilodalton kan worden gevonden in zowel de kern en het cytoplasma. Deze cellen worden verwijderd uit verdere analyse. Ondanks het feit dat de fluorescerende snRNAs worden opgeslagen bij negatieve 80 graden Celsius vóór de injectie, kan RNA-afbraak optreden.
Gedegradeerd snRNA geïnjecteerd in het cytoplasma wordt niet vervoerd in de kern en blijft gelokaliseerd in het cytoplasma. Dergelijke snRNA moet worden weggegooid en nieuwe snRNA moet worden gesynthetiseerd. Het is belangrijk om de injectie- en compenserende druk voor uw celtype correct aan te passen.
En zoals eerder gezegd, het instellen van de juiste ondergrens voor celinjectie is essentieel voor een goede microinjectie. Houd er rekening mee dat de fenol-chloroform die wordt gebruikt tijdens RNA-isolatie gevaarlijk is en dat de microinjectienaald een scherp voorwerp is. Wees voorzichtig bij het hanteren van deze materialen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de biogenesis van spliceosomale snRNA's en hun transport binnen cellen, gebruikmakend van micro-injectie van fluorescent gelabelde snRNA's. De belangrijkste biologische vraag focust op de lokalisatie van deze snRNA's in kernstructuren bekend als Cajal-lichaampjes, wat inzicht geeft in hun essentiële sequenties voor correcte lokalisatie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Moleculair Biologie
- RNA Lokalisatie
Achtergrond
- snRNA's spelen cruciale rollen in splicing en RNA-verwerking.
- Begrip van hun lokalisatie kan cellulaire mechanismen verhelderen die betrokken zijn bij RNA-functionaliteit.
- Cajal-lichaampjes zijn subnucleaire structuren geassocieerd met snRNA-verwerking.
- Micro-injectie maakt directe manipulatie en observatie van RNA-moleculen mogelijk binnen levende cellen.
Doel van studie
- Om de transport- en lokalisatiemechanismen van spliceosomale snRNA's te onderzoeken.
- Om de belangrijkheid van specifieke RNA-sequenties te evalueren bij het bepalen van snRNA-lokalisatie.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het traceren van snRNA-moleculen binnen cellen.
Gebruikte methoden
- Micro-injectietechniek werd gebruikt met behulp van fluorescent gelabelde snRNA's.
- HeLa-cellen werden gebruikt als biologisch model voor het onderzoek naar snRNA-lokalisatie.
- Verschillende controles en aanpassingen werden gemaakt tijdens het injectieproces voor nauwkeurigheid en betrouwbaarheid.
- Cellen werden gefixeerd en onderworpen aan immunofluorescentie om Cajal-lichaampje-markers te visualiseren.
- Kwantificering van fluorescentiesignalen werd uitgevoerd met behulp van ImageJ voor gedetailleerde analyse.
Belangrijkste resultaten
- Volledige lengte snRNA lokaliseerde succesvol naar Cajal-lichaampjes, bevestigend de noodzaak van de SM-plaats voor correcte accumulatie.
- snRNA zonder de SM-plaats vertoonde deficiente lokalisatie in Cajal-lichaampjes, en bleef in het cytoplasma.
- Controle-injecties demonstreerden verwachte verkeerspatronen, helpend bij het valideren van resultaten.
- Incubatie en zorgvuldige aanpassing van de micro-injectiemethode waren cruciaal voor succesvolle uitkomsten.
Conclusies
- Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van snRNA-transport en lokalisatie in levende cellen.
- Begrip van RNA-lokalisatiemechanismen helpt bij het onthullen van potentiële regulatorische paden geassocieerd met RNA-activiteit.
- De inzichten verkregen uit dit onderzoek kunnen bijdragen aan bredere moleculaire biologiestudies gerelateerd aan RNA-functie en cellulaire organisatie.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Understanding spliceosomal snRNA localization into Cajal bodies provides mechanistic insight into RNA processing pathways relevant to target validation in nucleic acid therapeutics. The microinjection-based localization assay enables rapid interrogation of sequence determinants governing subcellular trafficking, supporting early-stage de-risking of RNA-targeted modalities. This approach contributes to predictive confidence in identifying functional RNA elements critical for therapeutic efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates RNA sequence elements that govern subcellular localization, enabling hypothesis testing of functional domains in snRNA.
- Operational Value: Facilitates rapid screening of mutant constructs to identify sequences essential for nuclear body accumulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking specific RNA motifs to validated subcellular localization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables quantitative assessment of RNA trafficking via fluorescence intensity ratios in defined subcellular compartments.
- Operational Value: Provides a reusable platform for testing RNA variants with standardized readouts for localization efficiency.
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based outputs suitable for hit confirmation in RNA-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system compatibility by using human HeLa cells to model snRNA localization mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by defining sequence-function relationships in RNA nuclear trafficking.
- Predictive De-risking: Reduces mechanistic ambiguity in RNA therapeutic design by validating localization-dependent functionality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling sequence-function analysis prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA sequence determinants in subcellular localization and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative fluorescence readouts and reproducible localization metrics.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Cajal body/nucleoplasm fluorescence ratios) enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human cell models and defined localization endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for RNA localization testing applicable across multiple target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA therapeutics by validating sequence-specific localization to functional nuclear compartments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility through controlled microinjection, fixation, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking RNA sequence features to validated subcellular trafficking, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA targets based on demonstrated localization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, fluorescence microscopy, and ImageJ-based quantification.
- Dependent on microfluidic injection systems, fluorescence microscopes with Z-sectioning capacity, and deconvolution software.
- Necessitates standardization of injection pressure, incubation time, and fixation protocols across users and cell lines.
- Requires adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell models.
- Practical limitations include RNA degradation risk and variable injection success, necessitating quality controls for labeled RNA integrity.
