Detectie van Extravasculaire Trypanosoma -parasieten door fijne naald aspiratie

Fijne naald aspiratie cytologie is een goedkope, eenvoudige, snelle en minimaal invasieve techniek die we gebruiken om trypanosomen te verzamelen van voelbare laesies in organen in levende muizen. Gezien het feit dat fijne naaldaspiratie een niet-terminale procedure is, maakt het mogelijk om na verloop van tijd bij hetzelfde dier te worden bemonsterd. Als deze bevindingen kunnen worden vertaald naar vee, zal deze methode zeer nuttig zijn voor dierenartsen om trypanosomiasis bij runderen in een boerderij te diagnosticeren.

Het aantonen van de smeervlek procedure zal Ana Margarida Santos, een assistent technoloog van mijn laboratorium. Bevestig om te beginnen de verdovendering te bevestigen met de teenknijpmethode. Wanneer de reflex van de intrekking van het been afwezig is, plaatst u de muis in rugrecumency.

Zorgvuldig palpate de teelballen om de grootte en afstand van de bovengaande huid te bepalen en vervolgens te beperken tussen de wijs- en middelvinger of tussen de wijsvinger en duim. Om het doel verder te immobiliseren, strek je de bovenmatige huid stevig uit en maak je het oppervlak schoon met alcoholdoekjes. Steek vervolgens de naaldpunt van een 23-meterige naald die is aangesloten op een spuit van vijf milliliter in het doel om ervoor te zorgen dat de zuiger zich in de rusttoestand bevindt.

Voor het aanbrengen van zuigkracht, trek de spuit zuiger naar de drie tot vier millimeter merk twee tot drie keer. Om de kans op het verkrijgen van een representatief monster te vergroten en kleinere structuren zoals de epididymis te richten, leidt u de naald in het orgaan in een rechte lijn of langs verschillende raaklijnen om. Laat de zuigkracht los en trek de naald terug.

Naald kan alleen worden verwijderd nadat de negatieve druk is vrijgegeven door het loslaten van de zuiger. Anders wordt de aanzuiger in de spuit gezogen en is het onherstelbaar. Druk uitoefenen met een steriele gaasspons op de punctieplaats om eventuele bloedingen onder controle te houden.

Koppel de spuit los aan de naald en vul deze met lucht. Sluit de naald opnieuw aan, plaats de punt van de naald zeer dicht bij of zelfs op de glijbaan en gooi de inhoud van de naald voorzichtig op de glijbaan. Om te zorgen voor repliceren bemonstering, ten minste een extra aspiratie per orgaan en dier uit te voeren.

Na het terugdraaien van anesthesie met een onderhuidse injectie van 200 microliter van één milligram per kilogram Atipamezole in zoutoplossing, breng je dieren terug naar hun thuiskooi voor herstel. Met behulp van de niet-dominante hand, pak de dia die de druppel van aanzuigen knijpen het matte uiteinde tussen de duim en wijsvinger heeft. Met behulp van de dominante hand, pick-up een schone spreader glijbaan en plaats het glad schone rand over de tweede dia net op de top van de daling onder een hoek van ongeveer 30 graden.

Om een dunne film te verkrijgen, glijdt u de glijbaan naar voren met één lichte continue en gestage beweging. Laat de glijbaan rusten en laat het materiaal volledig en snel drogen van de lucht. Label de matte rand van de dia met een potlood.

Voor het Giemsa kleuringsprotocol bevestig je luchtgedroogde uitstrijkjes door de glijbanen gedurende vijf minuten onder te dompelen in een Coplin-pot met 100% methanol. Breng de glijbanen vervolgens over in een Coplin-pot met 20%Giemsa-oplossing en 30 minuten gedestilleerd water. Spoel de glijbanen in leidingwater en dep met tissuepapier om goed te drogen.

Terwijl u de dia horizontaal houdt, breng u enkele druppels nonaqueous montagemedium aan op het uitstrijkje. Plaats de rand van een afdekglas op de glijbaan, laat het zakken en druk zachtjes om eventuele luchtbellen te verwijderen. Voor immunocytochemie, bevestig lucht gedroogde uitstrijkjes in 100% methanol bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Was de glijbaan gedurende vijf minuten in een Coplin pot met 1X PBS herhalen deze stap drie keer met behulp van verse 1X PBS elke keer. Na het verwijderen van de dia's uit de Coplin-pot, veeg je overtollige buffer af zonder het uitstrijkje aan te raken en trek je een lijn rond het uitstrijkje met een waterafstotende pen. Terwijl u de dia horizontaal houdt, breng u 150 microliter verdunde primaire antilichaamoplossing aan op elk uitstrijkje en broed gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Na incubatie, was de dia's gedurende vijf minuten in een Coplin pot met 1X PBS herhalen deze stap drie keer met behulp van verse 1X PBS elke keer. Terwijl u de dia horizontaal houdt, breng u 150 microliters van commercieel verkrijgbaar paardenradoxidase DAB-visualisatiesysteem aan op elk uitstrijkje en vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in te broeden. Was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in PBS.

Dan counterstain door het onderdompelen van de dia's in een Coplin pot met Harris hematoxylin voor 10 seconden. Spoel af in leidingwater en dep met papier om goed te drogen. Terwijl u de dia horizontaal houdt, breng u enkele druppels nonaqueous montagemedium aan op het uitstrijkje.

Plaats de rand van een afdekglas op de glijbaan, laat het zakken en druk zachtjes om eventuele luchtbellen te verwijderen. Een goede kwaliteit uitstrijkje werd gekenmerkt door een monolaag van cellen met een goede dichtheid en bewaarde morfologische kenmerken waardoor de identificatie van hun weefsel van oorsprong en relatieve verhouding tussen elkaar. Bovendien waren parasieten efficiënt immunovlekkend, identificeerbaar en telbaar.

Slechte of negatieve fijne naald aspiratie resultaten kunnen te wijten zijn aan te weinig materiaal en dus onder vertegenwoordiger van de massa of orgel. Het kan ook te wijten zijn aan te veel materiaal op een enkele dia maken overdreven dikke uitstrijkjes en afbreuk te doen aan cytologische evaluatie. Zogenaamde verpletterd artefact gebeurt als gevolg van te veel kracht wordt toegepast bij het maken van het uitstrijkje verlaten van verstoorde cellen wat resulteert in een heleboel naakte kernen en DNA-strepen.

Wanneer er niet genoeg kracht wordt uitgeoefend tijdens de voorbereiding van het uitstrijkje, worden cellen niet uitgesplitst, wat resulteert in een gelaagde laag die de evaluatie van de morfologische kenmerken van de cellen belemmert. Vergelijking van fijne naald aspiratie cytopathologie met histopathologie, cytopathologie had het voordeel van beter bewaarde cellulaire morfologie en een betere beoordeling van relatieve verhoudingen en het tellen van cellen. Immunocytochemie is eenvoudiger, sneller en gemakkelijker te optimaliseren dan immunohistochemie.

Voor fijne naaldaspiratie, altijd zorgen voor een goede immobilisatie van het dier, stabilisatie van de organen of massa aangezogen, en een gecoördineerde vacuüm toepassing en release. Dan voor hoge kwaliteit uitstrijkjes, onmiddellijk verspreid nadat het materiaal is geplaatst op het glas en wees voorzichtig met de sterkte toegepast om het uitstrijkje te maken om cel verpletterd artefacten te voorkomen. Naast routinematige microscopie en immunocytochemie kan dit materiaal ook worden gebruikt voor elektronenmicroscopie, biochemische analyse, stroomcytometrie, moleculaire biologie, of zelfs voor in vitro-tests.

Deze techniek stelde ons in staat om aan te tonen dat fijne naaldaspiratie kan worden gebruikt om ziekten bij proefdieren te diagnosticeren en te bestuderen. We waren in staat om tropisme van Trypanosoma parasieten te diagnosticeren aan de externe mannelijke voortplantingsorganen en ook om deze ziekte te karakteriseren in de loop van de infectie.