Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling van neurosferen aan te tonen van gemengde primaire hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-E16 Sprague Dawley rat embryo, om een robuust en goedkoop platform te bieden voor het bestuderen van het effect van verschillende neurotherapeutische leads. Zoals u weet, dat de hersenen is een complex netwerk van neuronen geassocieerd met een groot aantal ondersteunende cellen. Om de hersenfunctie te begrijpen, wordt het grootste deel van het onderzoek vaak opnieuw geïnitieerd uit in vitro experimenten, waarbij commercieel beschikbare neurale afstamming afgeleide cellijnen betrokken zijn.

Echter, deze cellijnen zijn getransformeerde cellijnen die lijden aan genotypische en fenotypische variaties. Om deze problemen aan te pakken, primaire neuron cultuur is de geschikte aanpak. Hier hebben we een eenvoudig en kosteneffectief protocol voor de cultuur van primaire neuronen geïllustreerd en een robuust screeningplatform gebouwd voor verschillende neurale therapieën.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat alleen door het moduleren van de celbeplating dichtheden, kunnen we showcase twee contrasterende neuron cultuur platforms waar lage dichtheid leidt tot langdurige primaire neuron cultuur, en hoge dichtheid genereert spontane neurosfeer. Neem twee 24-put platen. Een voor hoge dichtheid, en een andere voor lage dichtheid beplating.

Breng 12 mm steriele glazen covers in de 24-put platen. Giet 300 microliter PDL-oplossing in elk van de putten op een manier die volledig dekt het oppervlak van de gehele coverslip. Bereid PDL-oplossing voor bij een concentratie van 0,1 mg/mL in gedeïmiseerd water.

Wikkel de platen met aluminiumfolies om te voorkomen dat drogen, en houd het in de CO2-incubator 's nachts. De volgende dag, voor het plating, de PDL-oplossing aanzuigen. Was goed met steriel water voor twee tot drie keer.

Voeg vervolgens beplatingsmedia toe en breng de platen terug naar de couveuse tot de beplating. Offer een E14-E16 getimede zwangere Sprague-Dawley rat, Maak een V-vormige snede in de buikstreek met behulp van steriele tangen en een paar stompe schaar. Verwijder alle foetussen en leg ze voorzichtig op de petriplaat met koude HBSS-oplossing.

Haal de embryo's uit de embryonale zakjes en was ze zorgvuldig in een apart petrischaaltje in verse, koude HBSS. Onthoofd het hoofd met behulp van een steriele schaar. Breng de koppen in de steriele 90 mm petriplaten met koude HBSS.

Onder de stereomicroscoop, houd het hoofd van de snuit regio met de steriele getande tangen, en neem de hersenen door het snijden van de huid en de schedel open. Verwijder alle hersenvliezen van de hemisferen en de midbrain door het houden van de hersenstam. Verwijder voorzichtig de intacte halfronden, die lijken op paddestoeldoppen die de hippocampus en de cortex bevatten.

Verzamel de halfrondes met cortex en intacte hippocampus in een 15 mL conische buis met 10 mL dissociatiemedia. Laat de verzamelde weefsels te settelen, en aspirate de dissociatie medium, waardoor vijf tot tien procent van het medium in. Nogmaals, voeg 10 mL van verse dissociatie medium aan, en herhaal deze stap twee keer.

Voeg 4,5 mL dissociatiemedium en 0,5 mL trypsin-EDTA-oplossing toe. Bewaar het in de couveuse op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten voor de spijsvertering te gaan. Het medium aanzuigen en was met 10 mL dissociatiemedium en beplatingsmedium, achtereenvolgens.

Resuspend ze in 2,5 mL van beplating medium. Houd een 90 mm steriele schotel over de omgekeerde deksel van de schotel en giet deze in de basis van 90 mm steriele schotel. Titreer de verteerde weefsels in de hoek basis van de schotel, met behulp van 1000 microliter pipet tip, om zo het minste volume te bezetten.

Geef de verkregen celopening door de 70 micrometer celzeef, met uitzondering van eventuele stukjes weefsel. Bepaal de dichtheid van levensvatbare cellen met behulp van trypan blauwe kleurstof uitsluiting, en tel het aantal cellen in een geautomatiseerde cel teller. Verdun het aantal verkregen cellen op een manier om 1,5 in 10 te plateeren tot het vermogen van 5 cellen per mL voor beplating met een hoge dichtheid, en 20,000 cellen per mL voor lage dichtheidbeplating in twee afzonderlijke buizen met 30 mL beplatingsmedium.

Aspirate de eerder toegevoegde beplating medium en plaat 500 microliter van cellen verspreid in beplating medium in elke put. Daarna breng je de platen vier uur terug naar de couveuse. Vier uur na beplating, onderzoeken de cellen voor hechting onder de microscoop.

Na vier uur beplating, in zowel hoge als lage dichtheid platen, de neuronen tonen een goede hechting aan de platen. Vervang het medium in elke put door 500 microliters van vers onderhoudsmedium en kweek het in een couveuse bij 37 graden Celsius. We moeten deze neuronen verguld voor op hoge en lage dichtheid.

Terwijl de lage dichtheid vergulde neuronen kunnen worden gebruikt voor langdurige culturen, tot 30 dagen, door het veranderen van het onderhoudsmedium twee keer per week, de high-density vergulde neuronen begint spontaan neurosferen te genereren, die kwam dag nadat we onderhouden in ultra-lage bevestiging plaat. Na 24 uur van beplating, zowel high-and low-density vergulde neuronen worden waargenomen om gezonde morfologie weer te geven. Een fase contrast beeld van de lage dichtheid vergulde neuronen, gekweekt voor ongeveer zeven dagen, wordt hier weergegeven.

De neuronen vertonen gezonde morfologie, en kan worden gehandhaafd tot 30 dagen met meer krachtige routing en interconnecties. De bar diagram hier toont ongeveer 90 procent levensvatbaarheid van de lage dichtheid vergulde neuronen, zelfs na 30 dagen van cultuur, zoals bepaald door de MTT test. De primaire neuronen hier zijn gekenmerkt door immunostaining met Tuj 1, een marker van gedifferentieerde neuronen, en tau, een marker van neuronale axonen.

De zuiverheid van de neuronen wordt bevestigd door de afwezigheid van vlekken in niet-neuronale markers GFAP voor astrocyten en O4 voor oligodendrocyten. In alle karakteriseringsstudies zijn kernen gekleurd met Hoechst 33258. Hier zijn de laagdichtheid gezaaide cellen bevlekt met astrocytische marker GFAP en neuronale marker Tuj 1 om de zuiverheid van de cultuur tot zeven dagen te controleren.

Opgemerkt wordt dat dit protocol de preferentiële groei van neuronen over astrocyten ondersteunt, zoals aangegeven door de kwantitatieve analyse. Nuclei's zijn bevlekt met Hoechst 33258. Ook in de hoogdichtheid gezaaide cellen, de astrocyten zijn gekleurd met GFAP en neuronen door Tuj 1.

Hier, in de kwantitatieve analyse, wordt ongeveer 17 procent astrocyten waargenomen in vergelijking met 83 procent neuronen. De kernen zijn bevlekt met Hoechst 33258. Na zeven dagen worden spontaan gevormde meerdere neurosferen in de neuronen met een hoge dichtheid waargenomen.

Ongeveer de achtste tot tiende dag van de cultuur, in de hoogdichtheid vergulde neuronen, de neurosferen begint te vormen grote projecties en bruggen bestaande uit radiale glia-achtige extensies. De zwarte pijlen geven de brug aan tussen twee nieuw gevormde neurosferen. Levende en dode celtesten zijn uitgevoerd op de neurosferen voor 15 dagen.

In dichte Calcein AM kleuring, met absoluut geen propidium jodide kleuring, geeft bijna 100 procent levensvatbaarheid van de neurosferen in de cultuur. De lijngrafiek hier geeft een uitbreiding aan in de grootte van de neurosferen met het verstrijken van het aantal dagen. Dit overdreven gekleurde beeld van neurosfeer duidt op een rijke populatie neurale voorlopercellen door verhoogde expressie van NPC markers Nestin en Tuj 1.

De neurosferen hier tonen hoge hoeveelheden astrocyten gekenmerkt door de sterke expressie van GFAP, vergezeld van een nog hogere expressie van neuronale marker Tuj 1. De kernen zijn bevlekt met Hoechst 33258. Dus ik denk dat ons protocol is heel spannend en interessant, gezien het feit dat van een enkele strategie zijn we in staat om twee platforms te krijgen: een 2-D en een 3-D.

En dit zal een geweldig platform zijn voor het screenen van verschillende neurotherapeutische tracks. Dus ik denk dat het echt heel nuttig is voor alle neurowetenschappers. Ook een ander belangrijk aspect is dat de neurosferen waarin we ons aanmelden extreem rijk zijn aan neurale voorlopercellen, de NPC's.

Ze kunnen worden gebruikt om ze te onderscheiden in neuronen en niet-neuronale afstammingen. Dus, ik voel me als, echt, mensen kunnen deze techniek onder de knie door het nemen van hulp van deze video, zal het echt echt nuttig zijn voor iedereen. Bedankt.