Name: Zuivering van bloedplaatjes van muis Blood (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Leer bloedplaatjes zuiveren uit muizenbloed met iohexol-gradiëntcentrifugatie voor viabiliteits- en functionaliteitsanalyse. Deze methode minimaliseert contaminatie en ondersteunt flowcytometrie en microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een start-up financiering van Cincinnati Children's Research Foundation en een universiteit van Cincinnati pilot translationele Grant aan M.N. We willen graag de Cincinnati Children's Hospital Research flow Cytometry core bedanken voor hun diensten.

Muis bloedafname moet worden uitgevoerd met de juiste institutionele zorg voor dieren en het gebruik Comite goedkeuring.
Opmerking: Het bloedplaatjes zuiverings protocol wordt beschreven in een stroomdiagram in Figuur 1.
1. inzameling van bloed
<ol><li>Voeg 25 µ L van 3,2% natrium citraat (pH 7,2) toe als anti-coagulant en 0,4 mM van Gly-Pro-ARG-Pro (GPRP) in een polypropyleen buis.</li>
	<li>
Verzamel ongeveer 200 µ L van het bloed van de C57BL/6 muis met behulp van retro-orbitale bloeden. Nota: het bloed kan van om het even welk type van muis spanning ongeacht leeftijd of geslacht worden verzameld.<ol>
<li>Gebruik 2 mL Isofluraan in elk type kamer om de muis te verdoven. Opmerking: De diepte van anesthesie wordt gecontroleerd door tekens van verhoogde ademhaling en verminderde beweging. De muis moet niet reageren op beweging van de anesthesie kamer, of te worden behandeld. Als de muis reageert op beweging of behandeling, dan is het meer tijd nodig om te houden in de anesthesie kamer.</li>
		<li>1.2.2 open ofwel rechts of links ooglid van de muis en plaats een 7,5 cm (0,12 cm diameter) capillaire buis in de vasculaire plexus van het oog.</li>
		<li>Draai de capillaire buis een halve bocht, terwijl de toepassing van druk op de capillaire buis om de schepen te breken en de bloedstroom te initiëren. Houd het dier ondersteboven over de collectie flacon te worden gevuld door capillaire werking.</li>
		<li>Zodra de juiste hoeveelheid bloed wordt verzameld, verwijder de capillaire buis en sluit het oog door de toepassing van milde druk voor 30 s op het ooglid met een gaasje. Zodra het aftappen wordt tegengehouden, terugkeer de muis aan zijn kooi en monitor voor het aftappen.</li>
		<li>Controleer de ogen voor trauma 1-2 dagen na retro-orbitale bloeden. Verwijder een muis uit de studie die tekenen van significante trauma aan het oog als gevolg van de procedure en euthanaseren. Opmerking: De muis mag niet ondergaan elke vorm van behandeling die bloedplaatjes kan remmen gedurende ten minste twee weken voor de bloedafname. Het bloedmonster moet worden gebruikt voor het zuiveren van bloedplaatjes binnen een uur na het bloeden van de muis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bloedplaatjes zuivering
Opmerking: Bloedplaatjes zuivering moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur om hun afbraak te voorkomen. Zorg ervoor dat de temperatuur van de reagentia en de instrumenten tussen 18 tot 22 °C is. Om te voorkomen dat afbraak van bloedplaatjes, snel pipetten en krachtig schudden moet worden vermeden tijdens de procedure.
<ol><li>Voeg 600 µ L van iohexol gradiënt medium (12% iohexol poeder in 0,85% natriumchloride, 5 mM Tricine, pH 7,2)11 in een 1,5 ml buis.</li>
	<li>Voeg 200 µ L van bloedmonster langzaam langs de zijkant van de buis op de top van de gradiënt medium met een brede boring pipet tip, zodat het bloed en iohexol medium niet mengen (Figuur 2a).</li>
	<li>Centrifugeer het monster met buis op 400 x g voor 20 min bij 20 °c in een slingerende emmer rotor met langzame acceleratie en vertraging.</li>
	<li>Verzamel de meeste van de bloedplaatjes-rijke laag en een kleine fractie van de bloedplaatjes-arme laag (totaal 300 tot 400 µ L) met behulp van een brede boring pipet Tip zonder verstoring van de RBC en WBC lagen (Figuur 2b). Breng het bloedplaatjes monster naar een nieuwe buis. Opmerking: Als het aantal bloedplaatjes is minder in het bloed of een kleiner volume van het bloedvat wordt gebruikt, de bloedplaatjes-rijke laag en bloedplaatjes-arme laag kan worden gezien als een enkele laag.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS toe aan het bloedplaatjes monster, Meng door omkeren en centrifugeer bij 800 x g gedurende 10 min bij 20 °c in een slingerende emmer rotor. Gooi de oplossing volledig weg en voeg 200 µ L van PBS toe om de bloedplaatjes met milde pipetten opnieuw op te schorten. Opmerking: Deze stap is facultatief, aangezien het het gradiënt middel en de plasmaproteïnen verwijdert en de gevoeligheid van bloedplaatjes aan agonisten zoals trombine verhoogt. Aangezien de verschillende centrifuges verschillende programma's hebben, kan de langzame versnelling/de vertraging worden bepaald door de gebruikershandboek van de centrifuge te lezen.</li>
	<li>Breng 30 µ L van dit monster in een nieuwe buis om bloedplaatjes te tellen. De resterende bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor biochemische en fysiologische analyses, zoals bloedplaatjes activering, aggregatie, granule release, enz.</li>
	<li>Voor RNA of EiwitExtractie, Centrifugeer het monster van bloedplaatjes bij 800 x g 10 min om de bloedplaatjes te pelletpen. Gooi bovendrijvende volledig zonder storende de pellet. Voeg het gewenste volume van RNA of proteïne lysis buffer toe om de bloedplaatjes te lyse.</li>
</ol>3. het tellen van de bloedplaatjes
<ol><li>Tel de hele bloedcellen zonder verdunning en gezuiverd bloedplaatjes (verdund 2 tot 5-voudig met PBS) met behulp van een geautomatiseerde cel Analyzer. Gebruik 30 tot 50 µ L monsters voor het tellen.</li>
	<li>Bereken het totale aantal bloedplaatjes door vermenigvuldiging met het volume van het monster.</li>
	<li>Bereken het percentage van de opbrengst/het herstel van gezuiverde bloedplaatjes.</li>
	<li>Tel de RBC en WBC in de gezuiverde bloedplaatjes monster (verdund 50 tot 100-voudig met PBS) met een hemocytometer en Microscoop.</li>
</ol>4. de activering van bloedplaatjes
<ol><li>In een buis, voeg 1 tot 2.000.000 gezuiverde bloedplaatjes in maximaal 100 µ L van kleuring buffer (PBS met 2% foetale boviene serum, FBS).</li>
	<li>Voor veelvoudige aantal steekproeven, maak een hoofd mengeling van antilichamen met 1 µ L (0,5 mg/mL) van het volgende: PE-Cy7 rat anti-Mouse TER 119, PE rat anti-muis CD45, FITC rat anti-muis CD41, en APC rat anti-muis/Human CD62P (P-selectine) op te sporen RBC, WBC, bloedplaatjes, en geactiveerde bloedplaatjes, respectievelijk. Voeg de Master mix aan de buizen voor het bevlekken van de cellen. Voeg geen trombine toe.</li>
	<li>In een andere buis, voeg 1 tot 2.000.000 van gezuiverde bloedplaatjes in maximaal 100 µ L van kleuring buffer, en 0,4 mM GPRP peptide. Voeg trombine toe om de bloedplaatjes te activeren en vlek de cellen na stap 4,2. Opmerking: GPRP moet worden toegevoegd aan het monster voor het toevoegen van trombine om te voorkomen dat aggregaat of stolselvorming door middel van bloedplaatjes activering. Trombine concentratie moet worden geoptimaliseerd om een goede activatie van bloedplaatjes te verkrijgen. Na de activering van bloedplaatjes zijn de gebeurtenis tellingen verminderd tijdens de aankoop van monsters door flow Cytometry.</li>
	<li>Als een positieve controle, voeg 1 µ L van geheel bloed in tot 100 µ L kleuring buffer in een buis en 0,4 mM GPRP peptide. Voeg trombine om bloedplaatjes te activeren. Als een negatieve controle, voeg 1 µ L van het hele bloed in maximaal 100 µ L van kleuring buffer. Voeg geen trombine toe in negatief controlemonster. Vlek de cellen na stap 4,2.</li>
	<li>Voor flow Cytometry Isotype Control, label 5 tubes met ongekleurd, PE-Cy7, PE, FITC, en APC. Voeg 100 µ L van het bevlekken buffer, 1 µ L van bloed, en 1 µ L van het respectieve antilichaam aan de geëtiketteerde buizen toe om de cellen te bevlekken.</li>
	<li>Incubeer monsters om vlek voor 30 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Was de monsters door toevoeging van 1 mL van de kleur buffer aan elke buis. Centrifugeer bij 800 x g voor 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder de kleur buffer zorgvuldig zonder de pellet te verhullen.</li>
	<li>Voeg 300 µ L van kleuring buffer aan elke buis, meng mild, en de overdracht aan een FACS buis. Bewaar de gekleurde monsters in het donker tot geanalyseerd met een stroom cytometer.</li>
</ol>5. flow Cytometry analyses van bloedplaatjes
<ol><li>
Maak een nieuw experiment en het genereren van log vooruit Scatter VS log kant Scatter dot percelen en poorten toewijzen voor Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (bloedplaatjes), en CD62P APC (geactiveerde bloedplaatjes) populaties volgens de gating strategie gekozen voor de Experimenteer in de FACS DIVA software.
	<ol>
<li>Open de bevolkings hiërarchie door de optie populatie hiërarchie weergeven te kiezen onder het tabblad populaties . Bewerk de bevolkings hiërarchie door de gating strategie te controleren en de poorten goed te hernoemen.</li>
		<li>Open statistieken weergave door te kiezen voor Create Statistics View. Bewerk statistieken weergave op basis van gebruikersvoorkeuren door met de rechtermuisknop op de statistieken weergave te klikken en Statistieken weergave bewerkente selecteren.</li>
		<li>Kies een kleur voor elke poort die het visuele aspect van de lay-out verbetert door te dubbelklikken op de doos die overeenkomt met de bevolking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In het cytometer venster, klik op het tabblad parameters en pas de spanningen voor parameters om de bevolking van belang op de percelen te visualiseren.</li>
	<li>Pas de spanningen voor elk van de parameters, zodat de negatieve populatie kan worden onderscheiden van de positieve populatie. Controleer vóór het opnemen van de monsters voor de compensatie controle of de enkelvoudige bevlekte positieve controles op schaal zijn (zorg ervoor dat de positieve pieken zichtbaar zijn en niet te ver naar rechts). Opmerking: Als de positieve pieken zijn uit schaal, de spanningen moeten worden aangepast aan de positieve populaties te zien.</li>
	<li>Noteer de gekleurde cellen met één kleur voor compensatie controles (ongekleurd, PE-Cy7, PE, FITC en APC).</li>
	<li>Als de positieve controlepoorten zijn niet goed ingesteld, passen ze door het veranderen van spanningen.</li>
	<li>Ga naar Experiment &Gt; compensatie-instellingen &Gt; compensatie berekenen. Kies alleen toepassen in het resulterende venster.</li>
	<li>Schakel over naar het globale werkblad door op de wisselknop boven aan de linkerkant van het werkbladvenster te klikken.</li>
	<li>Laad de positieve controlemonster en het verwerven van voldoende cellen om de compensatie en de poorten aan te passen.</li>
	<li>Laad het monster opnieuw en controleer of elke plot de verwachte populatie op basis van de fluorochrome gekleurd antilichaam toont. Verwerven en registreren 100.000 evenementen voor hele bloedmonsters en 10.000 evenementen voor gezuiverde bloedplaatjes. Laad de monsters een voor een tot de overname is voltooid.</li>
	<li>Analyseer de flow Cytometry gegevens met de software met de juiste percelen en poorten (Figuur 3)</li>
</ol>

<ol><li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li>
<li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte%3A+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li>
<li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+signaling+cells+in+the+immune+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li>
<li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+platelets+and+PBMC%3A+New+evidence+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li>
<li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li>
<li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%27+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li>
<li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+%26%2334%3Bfirst+responders%26%2334%3B+in+wound+response%2C+cancer%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Platelet &#34;first responders&#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li>
<li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).</li>
<li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+rapid%2C+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li>
<li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematolology%22%5BJournal%5D)">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li>
<li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nycodenz%3A+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li>
<li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li>
<li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li>
<li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li>
<li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li>
<li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+murine+platelet+structure%2C+function%2C+assays%2C+and+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li>
<li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Vaak worden bloedplaatjes geïsoleerd door lage snelheid centrifuges die bloedplaatjes-rijk plasma dat een aanzienlijk aantal bloedcellen, cellulaire puin, en plasma-eiwitten die kunnen interfereren met de biochemische en fysiologische analyses en behoeften bevat verdere reiniging21. Daarom is het belangrijk om een snelle en eenvoudige methode te gebruiken die zuivere bloedplaatjes zonder belangrijke verontreinigende stoffen kan opleveren. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft de zuivering van...

De bloedplaatjes zijn een component van bloed dat als initiator van bloed het klonteren als reactie op schade in het bloedvat functioneert. Zij verzamelen zich op de plaats van verwonding om de schipmuur1te stoppen. Bloedplaatjes zijn anucleate fragmenten van cytoplasma afgeleid van de megakaryocytes van het beenmerg onder invloed van thrombopoietin en voer de circulatie2. Ze worden beschouwd als metabolisch actief en kunnen sensing extracellulaire omgeving door het activeren van intracellulaire signalering Cascades die resulteren in bloedplaatjes verspreiden, aggregatie, en hemostatische plug vorming1,3. Naast hemostase/trombose en wondgenezing4, bloedplaatjes spelen een belangrijke rol in de gastheer inflammatoire reacties, bloedvat, en de substatis3,5,6,7, 8.
Plaatjes worden gezuiverd van bloed om hun biochemische en fysiologische eigenschappen, die moeten vrij zijn van andere bloedbestanddelen studie. Sinds rode bloedcellen (RBC) en witte bloedcellen (WBC) bevatten aanzienlijk meer RNA en eiwitten dan bloedplaatjes9,10, de aanwezigheid van zelfs een klein aantal van deze cellen kunnen interfereren met transcriptomics en Proteomic analyses van RNA en eiwitten afkomstig van bloedplaatjes. We vonden dat gezuiverde bloedplaatjes geactiveerd met trombine BIND antilichaam, zoals anti-GPIIb/IIIa (JON/A) en anti-P-selectine efficiënter dan hele bloedplaatjes.
Aangezien bloedplaatjes kwetsbaar zijn, is het belangrijk om de monsters zo licht mogelijk te behandelen. Als de bloedplaatjes zijn geactiveerd, ze vrij hun korrel inhoud en uiteindelijk afgebroken. Daarom, om te voorkomen dat de bloedplaatjes ' functionele eigenschappen intact, is het belangrijk om bloedplaatjes rust te handhaven tijdens isolatie. Verschillende protocollen hebben beschreven isolatie van bloedplaatjes van de mens, hond, rat, en niet-menselijke primaat door verschillende methoden1,10,11,12. Sommige van de methoden vereisen meerdere stappen, zoals het verzamelen van bloedplaatjes-rijk plasma door centrifugeren, filtratie door scheiding kolom, negatieve selectie van bloedplaatjes met RBC-en WBC-specifieke antilichaam geconjugeerd aan magnetische kralen, en zo verder, die tijdrovende en kan afgebroken bloedplaatjes en de inhoud ervan.
Ford en zijn collega's beschreven bloedplaatjes zuivering van menselijk bloed met behulp van iohexol medium11. Deze methode gebruikt een gelijkaardig volume van bloedsteekproef en middel tijdens reiniging. Aangezien de mens een hoger volume van bloed oplevert, is het vrij gemakkelijk om de bloedplaatjes te zuiveren.
Iohexol is een universele dichtheid gradiënt inert medium dat vrij oplosbaar is in water en gebruikt in de fractionering van nucleïnezuren, eiwitten, polysaccharide, en Nucleoproteins13,14. Het heeft een lage osmolaliteit en is niet giftig, waardoor het een ideaal medium voor de reiniging van intact levende cellen11. Het is een niet-zwevend medium; Daarom kan de verdeling van cellen in een gradiënt worden bepaald gebruikend hemocytometer, stroom cytometer, of spectrofotometer. Het interfereert niet met het merendeel van de enzymatische of chemische reactie van de cellen of cellulaire fragmenten na verdunning.
De muis fungeert als een belangrijk diermodel voor vele menselijke ziekten15,16,17,18. Er zijn een paar gepubliceerde artikelen die de zuivering van de muis plaatjes te beschrijven19,20. Echter, de muis levert een relatief kleiner volume van het bloed, waardoor het moeilijk is om bloedplaatjes te zuiveren. Als dezelfde kleine hoeveelheid gradiënt medium en bloedmonsters wordt gebruikt, kan de bloedplaatjes laag niet duidelijk worden gescheiden van RBC-WBC laag na centrifugeren. In dit artikel hebben we beschreven een snelle en eenvoudige methode van de muis bloedplaatjes zuivering met drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en lage snelheid centrifugeren. We hebben ook geactiveerd de gezuiverde bloedplaatjes met trombine en onderzocht hun kwaliteit met Flow Cytometry en microscopie.

<table><tbody><tr><td>APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin)</td><td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>Marker voor activering van bloedplaatjes</td></tr><tr><td>Eppendorf tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Centrifugebuisje</td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Analyse van bloedplaatjes en vol bloed</td></tr><tr><td>FACS tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Buisjes voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Ingrediënt voor kleurbuffer</td></tr><tr><td>FITC rat anti-muis CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Bloedplaatjesmarker</td></tr><tr><td>Flowcytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Analyse van bloedplaatjes en vol bloed</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>FlowJo, Inc.</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Analyse van bloedplaatjes en vol bloed</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Voorkomen van bloedplaatjesklompvorming</td></tr><tr><td>Hematocriet capillaire buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Capillaire buis voor bloedopname</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Bloedcelanalysator</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>Celtellingskamer</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Gebruikt voor anesthesie van muis</td></tr><tr><td>Microscoop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Celmonitoring en telling</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradientmedium</td></tr><tr><td>PE rat anti-muis CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>Wit bloedlichaampje marker</td></tr><tr><td>PE-Cy7 rat anti-muis TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>Rode bloedlichaampje marker</td></tr><tr><td>Pipettips 200 &micro;L, brede hals</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Overbrengen van bloed en bloedplaatjesmonsters</td></tr><tr><td>Pipettips 1000 &micro;L, brede hals</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Overbrengen van bloed en bloedplaatjesmonsters</td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Buffer voor wassen en verdunnen</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Fysiologische zoutoplossing</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Anticoagulans</td></tr><tr><td>Kleurbuffer</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Was en verdunningsbuffer</td></tr><tr><td>Steriele water</td><td>In-house</td><td>Niet-catalogusartikel</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Centrifuge op tafel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Centrifuge met draaiende emmerrotor</td></tr><tr><td>Trombiene</td><td>Enzyme Research Laboratoty</td><td>HT 1002a</td><td>Agonist voor activering van bloedplaatjes</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Buffer voor Nycodenz-medium</td></tr></tbody></table>

zuivering van bloedplaatjes van muis blood

Purification of Platelets from Mouse Blood

De bloedplaatjes worden gezuiverd van geheel bloed om hun functionele eigenschappen te bestuderen, die van rode bloedcellen (RBC), witte bloedcellen (WBC), en plasmaproteïnen vrij zouden moeten zijn. We beschrijven hier zuivering van bloedplaatjes uit muis bloed met behulp van drie-voudige meer iohexol gradiënt medium ten opzichte van het bloedmonster volume en centrifugeren in een swingende emmer rotor op 400 x g voor 20 min bij 20 ° c. De terugwinning/opbrengst van de gezuiverde bloedplaatjes was 18.2-38.5%, en de gezuiverde bloedplaatjes waren in een rustende staat, die geen significant aantal van RBC en WBC bevatten. De gezuiverde bloedplaatjes behandeld met trombine toonde tot 93% activering, met vermelding van hun levensvatbaarheid. We hebben bevestigd dat de gezuiverde bloedplaatjes voldoende zuiver zijn met behulp van flow flowcytometrische en microscopische evaluatie. Deze bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering, granule release, aggregatie, en adhesie assays. Deze methode kan worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes uit het bloed van andere soorten ook.

De samenvatting van de bloed plaat zuivering wordt beschreven in een stroomdiagram (Figuur 1). De stappen omvatten inzameling van bloed van muis gebruikend het retro-orbitale aftappen in aanwezigheid van een antistollings, toevoeging van bloedsteekproef op het iohexol gradiënt middel, centrifugeren in een slingerende emmer rotor bij 400 x g 20 min bij 20 °c. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geëvalueerd met microscopie en Stroom Cytometry na het bevlekken met antilic...

Hier, muis bloed werd verzameld in de aanwezigheid van een anti-coagulant. De bloedplaatjes werden gezuiverd door iohexol gradiënt medium met behulp van lage snelheid centrifugeren. De bloedplaatjes werden geactiveerd met trombine om te onderzoeken of ze levensvatbaar waren. De kwaliteit van de gezuiverde bloedplaatjes werd geanalyseerd door stromings Cytometry en microscopie.

Zuivering van bloedplaatjes van muis Blood

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Bloedplaatjes moeten vrij zijn van bloedcellen en eiwitten bij het bestuderen van hun biochemische en fysiologische eigenschappen. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld om bloedplaatjes te zuiveren uit muisbloed. Deze techniek kan bloedplaatjes zuiveren met behulp van iohexol gradiënt medium en lage snelheid centrifugatie, wat resulteert in een duidelijke scheiding van bloedplaatjes van andere bloedbestanddelen.Om de bloedplaatjes te zuiveren, gebruik een breedborende pipetpunt om 200 microliter vers geoogst volbloed langzaam langs de zijkant van een buis van 1,5 milliliter op 600 microliter van iohexolgradiënt medium te leggen zonder te mengen. Na centrifugatie in een swingende emmerrotor om de bloedplaatjes te isoleren, gebruikt u een nieuwe brede pipettip om het grootste deel van de bloedplaatjesrijke laag en een kleine fractie van de bloedplaatjesarme laag te verzamelen zonder de witte bloedcel of rode bloedcellaag te aspireren. Voeg het bloedplaatjesmonster toe aan een nieuwe buis en voeg een milliliter PBS toe aan de bloedplaatjes.Meng de bloedplaatjes door inversie alvorens een andere centrifugatie uit te voeren. Dan resuspend de pellet in 200 microliters van PBS met milde pipetting. Voor de activering van bloedplaatjes, breng een tot twee keer 10 naar de zes bloedplaatjes naar een nieuwe buis met 100 microliter kleuring buffer.Voeg een tot twee keer 10 aan de zes bloedplaatjes aan een andere buis met 100 microliters van kleuring buffer aangevuld met 0,4-millimolar GPRP peptide. Voeg trombine toe aan de buis met het GPRP peptide om de bloedplaatjes te activeren en voeg de antilichaamcocktail van belang toe aan beide buizen. Als een positieve controle, voeg een microliter van vol bloed in maximaal 100 microliter van kleuring buffer in een buis met 0,4-millimolar GPRP peptide, en voeg trombine om deze bloedplaatjes te activeren.Als een negatieve controle, voeg een microliter van vol bloed in maximaal 100 microliter van kleuring buffer. Vlek vervolgens beide controlebuizen met de antilichaamcocktail. Na 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker, was de monsters met een milliliter verse kleuring buffer per buis.Resuspend de pellets in 300 microliters van verse kleuring buffer. Breng vervolgens de celmonsters over in afzonderlijke stroomcytometrieanalysebuizen die tegen licht zijn beschermd. Als u de bloedplaatjes wilt analyseren door cytometrie van de stroom, maakt u een nieuw experiment en genereert u logaritmische voorwaartse spreiding versus logaritmische zijverstrooiingspuntplospunten.Nadat u de spanningen zo nodig hebt aangepast, registreert u de met één kleur bevlekte cellen voor de compensatiecontroles. Voer nu het positieve controlemonster uit om voldoende cellen te verwerven om de compensatie en de poorten aan te passen. Verwerf en 20 000 gebeurtenissen voor elk bloedmonster en analyseer de stroomcytometriegegevens met behulp van de juiste percelen en poorten.Als het bloed langzaam op het medium wordt toegevoegd, vormt het iohexolgradiëntmedium en het bloedmonster twee afzonderlijke lagen in de buis. Na centrifugatie bevat de bovenste, strokleurige laag het plasma, maar geen intacte bloedcellen. De tweede, witachtige, bloedplaatjesrijke laag bevat de meerderheid van de bloedplaatjes.De derde, transparante laag is de bloedplaatjesarme laag en bevindt zich direct boven de rode bloedcel en witte bloedcelpellet. Vol bloed vertoont verschillende populaties van rode bloedcellen, witte bloedcellen, en bloedplaatjes op een logaritmische voorwaartse verstrooiing versus kant scatter dot plot. Gezuiverde bloedplaatjes, echter, tonen een duidelijke populatie met verwaarloosbare aantallen rode of witte bloedcellen.De bloedsteekproeven van het geheel bevatten Ter119-positieve rode bloedcel en CD45-positieve witte bloedcel populaties die bijna afwezig zijn in gezuiverde bloedplaatjes. Onbehandelde gezuiverde bloedplaatjes drukken bijna geen activeringsmarkeringen uit die hun rusttoestand bevestigen, terwijl gezuiverde thrombin-behandelde bloedplaatjes doorgaans een 71%P-selectin-expressie aantonen. Microscopische evaluatie van onbehandelde gezuiverde bloedplaatjes monsters onthult geen bloedplaatjes aggregatie.Na activering met trombine tonen de bloedplaatjes echter een robuuste aggregatie, die hun levensvatbaarheid na zuivering verder bevestigt, zoals aangetoond. Laag het bloedmonster zorgvuldig op het iohexol-medium en zorg er bij het verzamelen van de bloedplaatjes voor dat u voorzichtig aanzuit om de rode bloedcel en witte bloedcellen niet te verzamelen voor een succesvolle bloedplaatjeszuivering. Deze methode kan ook worden gebruikt voor de zuivering van bloedplaatjes van andere soorten.De gezuiverde bloedplaatjes kunnen worden gebruikt voor genexpressie, activering, aggregatie, granulaatontgifting en hechtingsstudies.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a technique for the differentiation of megakaryocytes and the formation of platelets. Hematopoietic stem progenitor cells — isolated from human umbilical cord blood — differentiate into mature megakaryocytes in the presence of thrombopoietin. The mature megakaryocytes produce cytoplasmic extensions termed proplatelets, which give rise to individual platelets.

An In Vitro Method for the Differentiation of Megakaryocytes and Platelet Formation

In this video, we describe a protocol for purifying platelets from murine whole blood and their subsequent activation with the platelet agonist thrombin. When analyzed with flow cytometry, the purified resting platelets are characterized based on the expression of their cell-surface marker CD41, whereas purified activated platelets co-express both the surface markers CD41 and CD62P.

Purification and Activation of Platelets from Murine Whole Blood

In this video, we demonstrate the isolation of cytotoxic high-density neutrophils and low-density neutrophils from the blood of a tumor-bearing mouse by discontinuous sucrose gradient centrifugation.

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood

Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.

Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes

Een zeer zuivere bevolking van megakaryocytes kan worden verkregen van koord bloed afkomstige CD34+ cellen. Een methode voor CD34+ celdifferentiatie isolatie en Megakaryocyt is hier beschreven.

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Hier gepresenteerd is een protocol voor het toevoegen van peptide CD47 (pepCD47) aan metalen stents met behulp van polybisfosfonaat chemie. Functionalisatie van metalen stents met behulp van pepCD47 voorkomt de bevestiging en activering van ontstekingscellen waardoor hun biocompatibiliteit wordt verbeterd.

Mitigatie van Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilisatie

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Dit protocol beschrijft in detail alle stappen die betrokken zijn bij het verkrijgen van leukofilter-afgeleide CD34 + hematopoietische voorlopers en hun in vitro differentiatie en rijping tot proplatelet-dragende megakaryocyten die in staat zijn om bloedplaatjes in het kweekmedium vrij te geven. Deze procedure is nuttig voor diepgaande analyse van cellulaire en moleculaire mechanismen die megakaryopoiese beheersen.

Leukodepletiefilters-afgeleide CD34 + -cellen als een celbron om megakaryocytendifferentiatie en bloedplaatjesvorming te bestuderen

De vorming van procoagulerende bloedplaatjes is gecorreleerd met een verhoogd risico op trombose. Hier wordt een nauwkeurig protocol gepresenteerd voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, bedoeld om de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microvesikels te kwantificeren, die onderscheidende kenmerken zijn van procoagulerende bloedplaatjes.

Karakterisering van procoagulerende bloedplaatjes door meting van de blootstelling aan fosfatidylserine en de afgifte van microblaasjes uit menselijke gezuiverde bloedplaatjes

Het metabolisme van bloedplaatjes is van belang, vooral omdat het betrekking heeft op de rol van hyper- en hypoactiviteit van bloedplaatjes bij bloedingen en trombotische aandoeningen. Het isoleren van bloedplaatjes uit plasma is noodzakelijk voor sommige metabole testen; Hier wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van intracellulaire metabolieten uit gewassen bloedplaatjes.

Preparaat van gewassen menselijke bloedplaatjes voor kwantitatieve metabole fluxstudies

Leer bloedplaatjes zuiveren uit muizenbloed met iohexol-gradiëntcentrifugatie voor viabiliteits- en functionaliteitsanalyse. Deze methode minimaliseert contaminatie en ondersteunt flowcytometrie en microscopie.

Zuivering van bloedplaatjes van muis Blood

Meer video's verkennen