Name: Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer een efficiënte methode voor eiwitzuivering in Streptococcus mutans met PCR-gebaseerde technieken. Deze aanpak is bijzonder geschikt voor membraaneiwitten en hoog molecuulmassa-eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidie nummers 16K15860 en 19K10471 tot T. M., 17K12032 tot M. I., en 18K09926 tot N. H.) en de SECOM Science and Technology Foundation (subsidie nummer 2018.09.10 nr. 1).

Opmerking: Generatie van S. mutans ∆gtfc, waarin de volledige coderende regio van het gtfc -gen wordt vervangen door SPCr, moet worden voltooid voordat deze protocollen worden uitgevoerd. Raadpleeg het gepubliceerde artikel voor meer informatie over generatie5.
1. ontwerp van de primer
<ol><li>
Bereid primers voor de bouw van S. mutans zijn-gtfc. Opmerking: De in dit Protocol gebruikte primer sequenties worden weergegeven in tabel 1. Two-Step Fusion PCR-methode voor de generatie van S. mutans zijn-gtfc wordt schematisch geïllustreerd in Figuur 2.<ol>
<li>Ontwerp primers (gtfc-reverse en SPCr-forward) voor de bevestiging van zijn-tag-Codeer volgorde, tussen het gen gtfc en SPCr (Figuur 2a).<ol>
<li>Omvatten GS linker en zijn-tag-coding sequentie in zowel Gtfc-reverse en SPCr-forward primers, waarbij 24 basissen in de 5 ' regio's complementair zijn aan elkaar. Opmerking: de aminozuursequentie van de GS linker en zijn-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-his, his, his, his, his) is verbonden aan het C-eindpunt van GTF-SI via gentranslation.</li>
			<li>Ontwerp een gtfc-forward primer om het gtfc -gen te targeten in de S. mutans WT genoome > 1 KB stroomafwaarts van het gen en de SPCr-reverse primer om het stroomafwaartse flankerende gebied van SPC r te richten in de S. mutans ∆gtfc. Stel de smelttemperatuur8 (Tm) van de gtfc-forward en SPCr-reverse primers in overeen met de smelttemperaturen van de gtfc-reverse en SPCr- respectievelijk voorwaartse primers.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ontwerp geneste primers (geneste-forward en geneste-reverse) voor de tweede PCR (Figuur 2b).</li>
		<li>Ontwerp primers (Gtfc-forward en Colony-reverse) specifiek voor het GENOMISCHE DNA van de Transformant (figuur 2c; de primers worden gebruikt voor kolonie PCR). Opmerking: De amplicons Straddle de grens tussen Gtfc en SPCr. De Gtfc-forward primer kan worden aangebracht als de voorwaartse primer.</li>
		<li>Ontwerp primers (up-forward en down-reverse) voor definitieve bevestiging van de generatie van S. mutans zijn-gtfc (figuur 2c; het door de primers versterkte PCR-product wordt gebruikt voor DNA-sequencing).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. genomische DNA-extractie van S. mutans
Opmerking: Elke S. mutans stam moet worden gekweekt in hersen hart infusie (BHI) medium bij 37 ° c onder anaerobe condities. De mutanten stammen van s. mutans ∆Gtfc en s. mutans zijn-gtfc worden gekweekt in BHI aangevuld met 100 μg/ml spectinomycine.
<ol><li>Streak s. mutandiss WT en s. mutans ∆gtfc afzonderlijk op elk van de BHI agar platen. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Kies enkele kolonies van s. mutandiss WT of s. mutans ∆gtfc met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en INOCULEREN in 1,5 ml BHI Bouillon. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C. Opmerking: De kolonies kunnen worden gebruikt als bron van het template-DNA voor de eerste PCR (stap 3,1).</li>
	<li>Breng 1 mL van elke bacteriecultuur over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer de cultuur gedurende 1 minuut bij 15.000 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg 1 mL tris-EDTA-buffer (pH 8,0) toe om de celpellet te hervatten.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie gedurende 1 minuut bij 15.000 x g. Verwijder het supernatant. Rebreng de celpellet in 50 μL tris-EDTA-buffer (pH 8,0).</li>
	<li>Verwarm de suspensie met een blok incubator gedurende 5 min bij 95 °C. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 15.000 x g.</li>
	<li>Breng de supernatant over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL (het supernatant zal dienen als sjabloon-DNA voor de eerste PCR).</li>
</ol>3. PCR-versterking
Opmerking: Tabel 1, tabel 2en tabel 3 vatten respectievelijk de PCR-primers, reagentia en versterkings cycli samen.
<ol><li>Voer de eerste PCR uit met de s. mutandiss WT en s. mutans ∆gtfc genoom als de PCR templates. Versterk de regio's die het stroomafwaartse deel van het Gtfc -gen en de verharkoveringsspc r afboren met behulp van de in stap 1.1.1.2 beschreven primers (Figuur 2a).</li>
	<li>Elektroforese elk PCR-product op 1% agarose gel. De gewenste DNA-fragmenten van ongeveer 1.000 BP en 2.000 BP. Reinig de fragmenten uit de gels met behulp van op silica membraan gebaseerde gel-extractiemethode. Opmerking: De basisprocedures voor PCR9, DNA-gel elektroforese10en DNA-zuivering11 zijn elders beschreven.</li>
	<li>Voer een tweede PCR uit met de producten van de eerste PCR (ongeveer equimolar) als PCR-sjablonen met de geneste-forward en geneste-reverse primers (Figuur 2b).</li>
	<li>Elektroforese een tiende van het PCR-mengsel op de agarose-gel. Bevestig het genereren van de juiste ampliconlengte voor Temp van ongeveer 3.000 BP.</li>
	<li>
Het resterende PCR-product neer te slaan. Opmerking: zuivering van het PCR-product is niet nodig, omdat niet-specifieke amplicons die door de tweede PCR worden gegenereerd, de homologe recombinatie niet verstoren.<ol>
<li>Voeg Nuclease vrij water toe aan het PCR-mengsel en breng het totale volume naar 100 μL, gevolgd door 0,1 volume (10 μL) van 3 M Natriumacetaat (pH 5,2) en 2,5 volumes (250 μL) van absolute ethanol. Meng en bewaar het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Centrifugeer het monster 20 min bij 15.000 x g bij 4 °c. Gooi het supernatant weg. Voeg 1 mL 70% ethanol toe om de DNA-pellet te wassen.</li>
		<li>Centrifugeer het monster 5 min bij 15.000 x g bij 4 °c. Gooi het supernatant weg. Lucht drogen en los de DNA-pellet op met 10 μL Nuclease vrij water.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Celtransformatie
<ol><li>Bereid de bevoegde s. mutandiss WT voor om het tweede PCR-product te introduceren door de stappen te volgen die worden beschreven in de vorige publicatie5. Bewaar de cellen bij-80 °C. Opmerking: Voor dit experiment zijn de bevoegde s. mutandiss WT-cellen al bewaard gebleven in-80 °C om S. mutans ∆gtfcte genereren.</li>
	<li>Meng 5 μL van het geconcentreerde tweede PCR-product tot de 50 μL aliquot van de ijskoude bevoegde cellen die eerder zijn bevroren. Voeg het mengsel toe aan electroporatie cuvettes. Geef een enkele elektrische puls (1,8 kV, 2,5 MS, 600 Ω, 10 μF) aan de cellen met behulp van het elektroporation apparaat.</li>
	<li>Respendeer de cellen in 500 μL BHI-Bouillon. Verdeel onmiddellijk 10 – 100 μL van de suspensie op BHI-agar-platen met spectinomycine. Inbroed de platen gedurende 2 – 6 dagen bij 37 °C tot de kolonies voldoende zijn opgekwekt om te worden opgepakt.</li>
</ol>5. verificatie van GEnome recombinatie en opslag
<ol><li>Voer kolonie PCR uit, met behulp van gtfC-forward en Colony-reverse primers om te schermen voor de recombinatie. Elektroforese elke kolonie PCR-product op een agarose gel. Bevestig het DNA-fragment van ongeveer 1.500 BP.</li>
	<li>Kies een van de positieve kolonies met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur de cellen overnachten in 2 mL BHI bouillon met spectinomycine.</li>
	<li>Meng 0,8 mL bacteriële cultuur met 0,8 mL steriele 50% glycerol en kolf bij-80 °C of-20 °C.</li>
	<li>Breng de resterende 1 mL celsuspensie over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Herhaal stap 2.3 – 2.7 om het genomische DNA uit de cellen te halen.</li>
	<li>Voer PCR uit met behulp van de up-forward en down-reverse primers en genomisch DNA als sjabloon. Herhaal stap 3,2 om het versterkte DNA-product uit de gels te zuiveren.</li>
	<li>Bepaal de DNA-sequentie van de gezuiverde ampliconlengte voor temp door DNA-sequencing. Opmerking: Zorg ervoor dat u de generatie van S. mutans zijn-gtfc bevestigt door DNA-sequencing.</li>
</ol>6. zuivering van Polyhistidine-Tagged GTF-SI
<ol><li>Streak S. mutans zijn-gtfc op een spectinomycine-bevattende BHI agar plaat. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Pak een enkele kolonie met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur cellen in 3 mL BHI Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Bereid twee conische kolven met 1 L BHI Bouillon zonder spectinomycine. Inoculeren 1 mL van de nachtelijke kweek suspensie in 1 L van de BHI-Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Concentraat eiwitten uit de kweek supernatant door ammoniumsulfaat neerslag. Opmerking: uittreksel uit cellichamen als een doel proteïne intracellulaire is. De basisprocedures voor de precipitatie van ammoniumsulfaat zijn elders12beschreven.<ol>
<li>Centrifugeer de bacteriële kweek suspensie gedurende 20 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Herstel de kweek supernatant in een glazen beker van 3 liter.</li>
		<li>Voeg 1.122 g ammoniumsulfaat toe aan 2 L van het supernatant (80% verzadiging) met krachtig roeren met behulp van een magnetische roerder. Laat het neerslag gedurende 4 uur of meer bij 4 °C samen roeren. NB: de precipitaatformatie kan 's nachts worden voortgezet.</li>
		<li>Centrifugeer de ammoniumsulfaat-geprecipiteerde oplossing bij 15.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Decanterende het supernatant.</li>
		<li>Verzamel het precipitaat met een spatel en breng over in een glazen beker van 200 mL. Respendeer de pellets in 35 mL bindings buffer (50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).</li>
		<li>Dialyseer de suspensie tegen 2.500 mL van de bindings buffer met behulp van een geregenereerde cellulose dialyse slang, bij 4 °C, met roeren. Vervang de dialyse oplossing na 2 uur en ga 's nachts verder met dialyse.</li>
		<li>Vervang de dialyse-oplossing opnieuw. Doorgaan naar dialyze voor een extra 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer de gedialyseerde suspensie bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Filtreer de supernatant door een membraanfilter met behulp van afzuig filtratie apparatuur. Breng het filtraat over in een kolf van 75 cm2 .</li>
	<li>Fractioneren van de polyhistidine-Tagged GTF-SI van de gefiltreerde suspensie door geïmmobiliseerde metaal affinity chromatografie (IMAC).
	<ol>
<li>Breng 2 mL van de ni-geladen IMAC-hars slurry (ongeveer 1 mL hars) over in een chromatografische kolom waarvan de uitlaat is aangebracht op een siliconenbuis. Verwijder de opslagoplossing door de zwaartekracht stroom. Let op: Laat de hars niet uitdrogen in de IMAC.</li>
		<li>Voeg 3 mL gedistilleerd water toe aan de kolom om de hars te wassen. Voeg 5 mL van de bindings buffer toe om de hars te equilibreren.</li>
		<li>Sluit de stroom af met een Hoffmann-knijp haan. Voeg 5 mL van de gefilterde suspensie uit stap 6,5 toe om de slurry te maken.</li>
		<li>Voeg alle slurry toe aan de resterende gefilterde suspensie. Zwenk het mengsel gedurende 30 minuten zachtjes bij 4 °C.</li>
		<li>Laad het mengsel terug op de kolom. Verwijder de suspensie door de zwaartekracht stroom. Was de IMAC Resin met 20 mL binding buffer. Opmerking: Stel de stroomsnelheid in op ongeveer 2 mL/min met een Hoffmann-knijp haan in de daaropvolgende IMAC.</li>
		<li>Elute de recombinant GTF-SI met 20 mL van de elutie buffer (50 mM NaH2po4, 300 mM NaCl, 500 mm imidazol, pH 8,0). Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het eluaat moet bij 4 °C worden bewaard. IMAC Resin kan worden hergebruikt. Raadpleeg de instructies voor de IMAC Resin.</li>
	</ol></li>
	<li>Vervang de elutie buffer door de opslag buffer (50 mM fosfaatbuffer, pH 6,5) en concentreer de recombinant GTF-SI oplossing tot ongeveer 1 mL met behulp van een centrifugale ultrafiltratie unit. Bewaar de recombinant GTF-SI-oplossing bij 4 °C. Opmerking: Bevestig met behulp van SDS-PAGE13 en Western blotting14 de polyhistidine-Tagged GTF-si-zuivering met een mierikswortel, met peroxidase-geconjugeerd anti-polyhistidine monoklonaal antilichaam. Toevoeging van CHAPS (eindconcentratie, 0,1%) het eluens kan nodig zijn om niet-specifieke adsorptie aan de eenheid te voorkomen, afhankelijk van het doeleiwit.</li>
</ol>7. functionele restauratie door recombinant GTF-SI
<ol><li>Streak elke s. mutandiss stam op een BHI agar plaat afzonderlijk. Incuberen de platen 's nachts op 37 °C.</li>
	<li>Gebruik een gesteriliseerde tandenstoker en neem een enkele kolonie op om te inoculeren in 2 mL BHI-Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Gebruik 20 μL van de nachtelijke cultuur van S. mutans ∆gtfc om 2 ml BHI bouillon met 1% sucrose zonder antibiotica in een glazen reageerbuis te inoculeren. Voeg de GTF-SI of een equivalent volume van het voertuig toe aan de S. mutans ∆gtfc cultuur, en cultuur de cellen met de buis geplaatst in een schuine positie 's nachts. Opmerking: Steriliseer de GTF-SI-oplossing met een steriel spuit filter en bepaal vóór gebruik de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic acid Protein assay15 .</li>
	<li>Roer de cultuur suspensies met een Vortex mixer voor 10 sec. de schorsingen af. Was de reageerbuisjes met een voldoende hoeveelheid gedistilleerd water.</li>
	<li>Beits de biofilms op de buiswand met 1 mL 0,25% Coomassie Brilliant Blue (CBB).</li>
	<li>Decaner de kleurings oplossing na 1 min. was de reageerbuisjes met een voldoende hoeveelheid gedistilleerd water. Lucht drogen van de reageerbuisjes.</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het ontwerp van primers is de meest kritieke stap in het protocol. De sequenties van de gtfc-reverse en SPCr-forward primers werden automatisch bepaald op basis van de sequenties van zowel het 3 ′ eindgebied van gtfc als het 5 ′ eindgebied van SPCr. Elke primer bevat 24 complementaire basissen die coderen een GS linker en een zijn-tag-coding sequentie in hun 5 ' regio's. Verstoring van de inheemse regelgevings sequenties gelegen in de upstream flankerende regio's ...

Analyse van de functie van een gen impliceert meestal een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild-type stammen tot stammen waarin het gen van belang is verstoord. Zodra de door het gen verstoorde stam wordt geproduceerd, maakt exogene toevoeging van het genproduct een functioneel herstel mogelijk.
De meest voorkomende methode voor het verkrijgen van gezuiverde genproducten die nodig zijn voor daaropvolgende restauratie testen is door heterologeuze expressie in Escherichia coli1uit te voeren. Echter, de expressie van membraan eiwitten of hoge moleculaire massa eiwitten is vaak moeilijk met behulp van dit systeem1. In deze gevallen wordt het doeleiwit meestal geïsoleerd van de cellen die het eiwit native synthetiseert door middel van een complexe reeks stappen, wat kan leiden tot verlies van het genproduct. Om deze problemen op te lossen, is een eenvoudige procedure ontwikkeld voor genproduct zuivering na een gendisruptie methode2, PCR-gebaseerde DNA-splicing methode3 (aangewezen twee-STELE fusie-PCR) en elektroporation voor genetische transformatie in Streptococcus mutans. Toevoeging van een polyhistidine tag (his-tag) aan het C-eindpunt van het genproduct vergemakkelijkt de zuivering ervan door geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie (IMAC).
Om de zijn-tag-uitverwoorde stam te isoleren, wordt het gehele genomische DNA van het gen van belang (in deze zijn-tag-uitverwoorde gen-verstoorde stam) vervangen door een antibioticum-resistent marker gen. De procedure voor het genereren van de his-tag-uitdrukken van strainis bijna identiek aan die voor het genereren van een genverstoorde stam zoals eerder beschreven4,5. Daarom moeten de methoden voor gendisruptie en genproduct isolatie worden uitgevoerd als seriële experimenten voor de functionele analyse.
In het huidige werk, een polyhistidine-Coding sequentie wordt gehecht aan het 3 ′ uiteinde van de Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005) gen, codering glucosyltransferase-si (GTF-si) in S. mutans6. Vervolgens werden expressie studies in een streptokokken soort uitgevoerd. Het bereiken van heterologe gtfc expressie door E. coli is moeilijk, waarschijnlijk vanwege de hoge moleculaire massa van GTF-si. Deze stam heeft de naam S. mutans his-gtfc. Een schematische illustratie van de organisatie van de gtfc en spectinomycine resistentie gen cassette (SPCr)7 loci in wild-type S. mutans (s. mutans WT) en derivaten daarvan wordt weergegeven in Figuur 1. De GTF-SI is een secretoire proteïne dat bijdraagt aan de ontwikkeling van de cariogene dentale biofilm6. Onder de aanwezigheid van sucrose wordt een aanhandige biofilm waargenomen op een glad glazen oppervlak in WT s. mutans stam maar niet in de S. mutans gtfc-verstoorde stam (S. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilm vorming wordt hersteld in S. mutans Δgtfc op exogene toevoeging van de RECOMBINANT GTF-si. De stam, S. mutans zijn-gtfc, wordt vervolgens gebruikt voor de productie van de RECOMBINANT GTF-si.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Nippon Genetics</td><td>NE-AG02</td><td>Voor agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Anaeropack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical</td><td>A-03</td><td>Anaerob cultuur systeem</td></tr><tr><td>Anti-His-Tag monoklonaal antilichaam</td><td>MBL</td><td>D291-7</td><td>HRP-geconjugeerd</td></tr><tr><td>BCA eiwit assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Meetinstrument voor eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Brain heart infusion bouillon</td><td>Becton, Dickinson</td><td>237500</td><td>Bacterie cultuurmedium</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>Voor biofilm kleuring</td></tr><tr><td>Centrifugale ultrafiltratie unit</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Buffer vervanging en eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Kubota</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografische kolom</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Voor IMAC</td></tr><tr><td>Dialyse membraan klem</td><td>Fisher brand</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuis</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R045A</td><td>Hoge-fidelity DNA polymerase</td></tr><tr><td>DNA sequencing</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL substraat</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5060</td><td>Voor western blotting</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA buffer bereiding</td></tr><tr><td>Elektroporatio kuvet</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0,2 cm spleet</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr oplossing</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>Voor agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Gel band snijder</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel extractie kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91202</td><td>DNA extractie uit agarose gel</td></tr><tr><td>Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>29083461</td><td>Voor SDS-PAGE en western blotting</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Wako</td><td>095-00015</td><td>Binding buffer en elutie buffer bereiding</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nippon Medical &amp; Chemical Instruments</td><td>EZ-022</td><td>Temperatuur instelling: 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Nippon Medical &amp; Chemical Instruments</td><td>LH-100-RDS</td><td>Temperatuur instelling: 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Membraan filter</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0,2 &micro;m diameter</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Kubota</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Bereiding van binding buffer en elutie buffer</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>Wako</td><td>192-02815</td><td>Bereiding van binding buffer en elutie buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Bereiding van binding buffer en elutie buffer</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Wako</td><td>015-06737</td><td>Ammoniumsulfaat precipitatie</td></tr><tr><td>Ni-geladen hars</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>Voor IMAC</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Eurofins Genomics</td><td>Op bestelling</td><td></td></tr><tr><td>Eiwit standaard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>Voor SDS-PAGE en western blotting</td></tr><tr><td>Solvent filtratie apparaat</td><td>As One</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Wako</td><td>195-11531</td><td>Antibiotica; gebruik bij 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Steriele spuit filter</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0,22 &micro;m diameter</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916;gtfC</td><td>Stock stam in het lab.</td><td></td><td>gtfC vervangen door spcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>Stock stam in het lab.</td><td></td><td>S. mutans ATCC 700610, Wild-type stam</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>Voor biofilm ontwikkeling</td></tr><tr><td>TAE (50 &times; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>Voor agarose gel elektroforese</td></tr><tr><td>Thermische cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>314-90065</td><td>Tris-EDTA buffer bereiding</td></tr></tbody></table>

zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in streptococcus mutans

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

De Elucidatie van de functie van een gen impliceert doorgaans een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild type stammen en stammen waarin het gen van belang is verstoord. Verlies van functie na genverstoring wordt vervolgens hersteld door exogene toevoeging van het product van het verstoorde gen. Dit helpt om de functie van het gen te bepalen. Een eerder beschreven methode omvat het genereren van een Gtfc gen-verstoorde Streptococcus mutans stam. Hier wordt een niet-veeleisende methode beschreven voor het zuiveren van het Gtfc -genproduct uit de nieuw gegenereerde S. mutans -stam na de verstoring van het gen. Het gaat om de toevoeging van een sequentie van polyhistidine-Coding aan het 3 ′ uiteinde van het gen van belang, waardoor eenvoudige zuivering van het genproduct met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie mogelijk is. Voor de genetische modificatie in deze methode zijn geen andere enzymatische reacties nodig dan PCR. Het herstel van het genproduct door exogene toevoeging na gendisruptie is een efficiënte methode voor het bepalen van de genfunctie, die ook kan worden aangepast aan verschillende soorten.

Figuur 3 toont de grootte van elke ampliconlengte voor Temp van de eerste PCR (Figuur 3a) en de tweede PCR (Figuur 3b). De grootte van elke ampliconlengte voor temp correspondeerde met de voorspelde grootte, zoals beschreven in tabel 1. Fig. 4a toont S. mutans kolonies getransformeerd met het tweede PCR product en verguld op de BHI agar platen m...

Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.

Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld, zoals, hoe een gen product dat moeilijk uit te drukken in E.Coli zuivert. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat geen enzymatische reactie, andere dan PCR, is de drager, en gemeenschappelijke toepassingen voor eiwitzuivering kan worden gebruikt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitzuivering in streptokokken mutans, kan het ook een op de hoogte zijn van andere microbiota soorten.Het aantonen van de procedure zal Dr.Mamiko Yamashita, een grad student van ons laboratorium. Na primer ontwerp en genomic DNA extractie van streptokokken mutans, voer de eerste PCR met behulp van de wild-type streptokokken mutans en GFC verstoord streptokokken genoom als de PCR sjablonen. Versterk de regio's die het stroomafwaartse deel van het gtfC-gen herbergen en die het spectinomycine-resistentiegen herbergen met behulp van de voorbereide gtfC-forward en reverse primer en spc r-forward en reverse primer.Vervolgens elektroforese elk PCR-product op 1%agarose gel. Gebruik een gelbandsnijder om de gewenste DNA-fragmenten van ongeveer 1.000 basisparen en 2.000 basisparen uit de gel in microcentrifugebuizen te vereven. Voeg 500 microliter oplosbuffer in elke buis toe en broed ze gedurende 10 minuten uit bij 56 graden Celsius om de gelplakjes op te lossen.Zuiver de fragmenten met behulp van silica membraan gebaseerde gel extractie methode. Voer een tweede PCR uit met de producten van de eerste PCR als PCR-sjablonen met de geneste en geneste omgekeerde primers. Wanneer het tweede PCR-product niet kan worden bevestigd door elektroforese, moet het paar van een andere geneste primer worden ontworpen.elektrophorese vijf microliters van het PCR mengsel op de agarose gel. Bevestig de generatie van de juiste amplicon van ongeveer 3.000 basisparen door ethidium bromide gel kleuring beeld en ga volgens het manuscript. Meng nu vijf microliter van het geconcentreerde tweede PCR-product tot de 50-microliter aloquot van ijskoude, competente streptokokkenmutancellen van het hele wildtype, eerder bevroren.Voeg het mengsel in een elektroporatie cuvette en plaats de cuvette in de cuvette kamer van de elektroporatie-apparaat. Geef een enkele elektrische puls van 1,8 kilovolt, 600 ohm en 10 microfarads gedurende 2,5 milliseconden aan de cellen. Voeg 500 microliters van hersenhart infusiebouillon toe aan de cuvette.Verspreid onmiddellijk 10 tot 100 microliter van de suspensie op hersenhartinfusie augerplaten met spectinomycine. Broed de platen twee tot zes dagen bij 37 graden Celsius tot de kolonies voldoende zijn gegroeid om opgehaald te worden. Na het genereren van streptococcus mutans polyhistidine codering sequentie opgenomen stam en 's nachts inenting zonder spectinomycine volgens het manuscript, centrifugeren de bacteriële cultuur suspensie gedurende 20 minuten op 10.000 keer g bij vier graden Celsius.Breng de cultuur supernatant in een drie-liter glazen beker. Om de eiwitten uit de cultuur supernatant te concentreren, plaats de twee-liter supernatant op een magnetische roerder en beginnen krachtig roeren. Voeg 1, 122 gram ammoniumsulfaat toe en laat het neerslag zich vormen met krachtig roeren bij vier graden Celsius gedurende een periode van vier uur of 's nachts. Volgende.centrifugeren het ammoniumsulfaat neergeslagen oplossing op 15,000 keer g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer de supernatant. Met een spatel, verzamel het neerslag en breng het in een 200-milliliter glazen bekerglas.Resuspend de pellets in 35 milliliter bindende buffer. Breng vervolgens elk ongeveer 25 milliliter van de suspensie over in een geregenereerde cellulosedialysebuis. Plaats de dialysebuis in 2,5 liter van de roerende bindingsbuffer op een roerder bij vier graden Celsius om de suspensie te dialyseren.Vervang de dialyseoplossing na twee uur en ga 's nachts verder met dialyse. Breng vervolgens de gedialyseerde suspensie van de slang naar centrifugebuizen en plaats de buizen in de centrifuge op 20.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Met sectiefiltratieapparatuur giet u de supernatant over een membraanfilter van 0,2 micrometer om te filteren.Breng het filtraat over in een kolf van 75 milliliter. Om de polyhistidine-tagged gtfSI uit de gefiltreerde suspensie te fractioneren, moet u eerst een geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie voorbereiden. Na het equilibrating van de hars volgens het manuscript, sluit de Hoffman knijp pik.Voeg vijf milliliter van de gefilterde suspensie toe aan de kolom om een drijfmest te maken. Breng vervolgens alle drijfmest over op de resterende gefilterde suspensie en draai het mengsel voorzichtig gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Laad het mengsel terug in de kolom.Open de Hoffman pinch pik om de suspensie te verwijderen door de zwaartekracht stroom. Was de IMAC-hars met 20 milliliter bindingsbuffer en vervolgens 20 milliliter elutie buffer om de recombinant gtfSI te verkrijgen. Laad daarna het eluaat in een centrifugale ultrafiltratiebuis en centrifugeer de oplossing op 2.000 keer g gedurende één tot vijf minuten om de oplossing te concentreren.Leeg de filtraat container en voeg 15 milliliter opslagbuffer in de buis. Centrifugeren het monster opnieuw en herhaal het proces twee keer extra. De recombinant gtfSI oplossing is uiteindelijk geconcentreerd op ongeveer een milliliter.Breng het concentraat in een microcentrifugebuis en bewaar op vier graden Celsius. Ga verder met het restfunctioneel restauratieprotocol. In dit protocol toont de agarose gel elektroforese aan dat de grootte van elke amplicon van de eerste PCR en de tweede PCR overeenkwam met de voorspelde grootte.Streptococcus mutans kolonies werden getransformeerd met het tweede PCR-product en verguld op de hersenen-hart infusie vijzel platen met spectinomycine. Kolonie PCR producten draaien op de agarose gel laat zien dat elke amplicon was van de voorspelde grootte. Eiwit gezuiverd met geïmmobiliseerde metaal affiniteit chromatografie werd waargenomen als een enkele band door SDS-PAGE.Westerse vlek, uitgevoerd met behulp van het anti-polyhistidine antilichaam, bevestigde dat de waargenomen band het verwachte polyhistidine-gelabelde eiwit van 160 kilodaltons was. De sucrose-afgeleide biofilm vormen vermogen werd alleen gezien met streptococcus mutans wild-type en streptococcus mutans His-gtfC, die een aanhangende biofilm op de buiswand gevormd in aanwezigheid van 1%sucrose. Dit werd niet waargenomen in streptococcus mutans delta gtfC.Echter, de toevoeging van 25 microgram van de recombinant gtfSI herstelde de aanhangende biofilm vorming vermogen in streptococcus mutans delta gtfC. Aangezien het succes van deze methode afhangt van de tweede PCR-versterking, moet het tweede PCR-product worden bevestigd door elektroforese. Reeds, histidine-type eiwit verkregen door deze methode is ook bijeenkomen voor functionele zuren, zoals eiwit-eiwit interacties.Na de ontwikkeling maakte deze techniek, in combinatie met genverstoring, de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van microbiologie om de genfunctie te onderzoeken.

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Mama is een uniek Magnetosome geassocieerd eiwit dat werd aangetoond dat het betrokken is bij magnetosome activering. Hier presenteren we de zuivering protocol van Mama deletiemutant (MamAΔ41)...

Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Source: Murata, T., et al. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a step-by-step procedure for the purification of a polyhistidine-tagged protein secreted from Streptococcus mutans.

A Procedure for the Purification of a Polyhistidine-Tagged Protein from Streptococcus mutans

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.

Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)

Elastine-achtige polypeptiden zijn stimulus-responsieve biopolymeren met toepassingen variërend van recombinant eiwit zuivering naar drug delivery. Dit protocol beschrijft de zuivering en karakterisering van elastine-polypeptiden en hun peptide of eiwit fusies uit Escherichia coli met hun lagere kritische oplostemperatuur faseovergang gedrag als eenvoudig alternatief voor chromatografie.

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em&gt; Escherichia coli</em

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is een uitgescheiden metalloprotease en veelbelovend geneesmiddel-doelwit van de humane ziekteverwekker Clostridium difficile. Hier beschrijven we alle methoden die nodig zijn voor de productie en structuurbepaling van dit eiwit.

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

Dit protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor recombinant tag-vrij calcium bindend proteïne S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor humane monocyt stimulatie testen.

Zuivering van de menselijke S100A12 en de ionen-geïnduceerde oligomeren voor Immuuncelstimulatie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Dit protocol beschrijft een snelle, reproduceerbare organische, oplosmiddelgebaseerde extractie- en neerslagmethode voor het zuiveren van elastine-achtige polypeptide (ELP) uit Escherichia coli, waarmee een potentieel schaalbaar alternatief wordt geboden voor conventionele ELP-zuiveringsmethoden.

Efficiënte zuivering van elastine-achtige polypeptiden (ELP's) uit E. coli met behulp van een organisch-oplosmiddelgebaseerde extractie- en precipitatiemethode

Leer een efficiënte methode voor eiwitzuivering in Streptococcus mutans met PCR-gebaseerde technieken. Deze aanpak is bijzonder geschikt voor membraaneiwitten en hoog molecuulmassa-eiwitten.

Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Meer video's verkennen