Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Dit protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om het immuunsysteem repertoire van menselijke donoren te ondervragen om zeldzame, antigeen-specifieke B-cellen te identificeren. Deze techniek stelt ons in staat om native-paired zware en lichte kettingen te verkrijgen, die snel kunnen worden gekloond, en vervolgens direct getest tegen het antigeen of antigenen van belang. Het aantonen van de procedure zal Mike Morton zijn, een technicus van ons laboratorium.

Neem ten minste een uur na ontdooien en herstel de donor PBMC op door middel van centrifugatie. En opnieuw op te schorten de cellen in 50 milliliter van ijskoude MES Buffer voor het tellen. Pellet de cellen door een andere centrifugatie, en isoleren van de CD22-positieve B-cellen door positieve selectie met CD22 microbeads volgens standaard protocollen.

Verzamel de kraal geïsoleerde CD22-positieve cellen door centrifugatie en resuspend de cellen op vier keer 10 tot de zevende cellen per milliliter vax bufferconcentratie. Voeg een IgG CD19 CD27 antilichaam cocktail aan de cellen volgens de verdunning van de fabrikant aanbevelingen met zachte mengen, en aliquot 10 aan de zevende cellen in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis voor de negatieve controle. Voeg een dual-label biotine steptavidin tetramers aan de negatieve controle buis bij een uiteindelijke concentratie van 36 nanomolar elk met een PE en APC, vermenigvuldigd met het aantal peptiden in de soort buis.

Breng het uiteindelijke volume in elke buis 2,5 milliliter met verse Vax buffer en voeg de peptide tetramers aan de buis sorteren op 36 nanomolar elke PE en APC. Na het centrifugeren, breng de cellen naar twee keer 10 tot de 6e per 100 microliter van tbs-concentratie voor een 30 tot 60 minuten incubatie, in het donker, op vier graden Celsius, met rotatie. Aan het einde van de incubatie, was de cellen twee keer in verse TBS buffer per wasbeurt voordat de monsters in individuele vijf milliliter filter-cap buizen.

Bevlek de monsters met een 0,3 micromolar uiteindelijke concentratie van DAPI als een marker van celmembraan integriteit. En voer de volledige negatieve controle uit op de celsorteerder om de stroomcytometriepoorten in te stellen voor het isoleren van de juiste celpopulaties voor eencellige sortering. Plot het antigeen PE versus antigeen APC en stel de R8-poort in als een antigeen PE-positief, en APC-positief kwadrant met een laag aantal gebeurtenissen in de dubbele positieve poort.

Sorteer vervolgens de enkele CD19-positieve CD27-positief antigeen PE-positieve, antigeen APC-positieve cellen in individuele putten van een Master Mix bereid 96 goed plaat. Aan het einde van de soort, bedek de plaat met aluminium tape pads, en centrifugeren de cellen voor een minuut op 400 keer g voor min 80 graden opslag. Om een omgekeerde transcriptase reactie uit te voeren, ontdooien de gesorteerde B-cellen op ijs gedurende twee minuten voordat het draaien van de plaat gedurende twee minuten op 3300 keer g om de put inhoud te trekken naar de onderkant van de plaat voor het openen.

Na de behandeling van de cellen met een geschikte enzym Master Mix, voeg 2,5 microliter gratis DNA als een sjabloon voor elke PCR-reactie, en voeg primers aan een uiteindelijke concentratie van 1 micromolar aan elke reactie. Voeg vervolgens een 2X-concentratie van 10x polymerase buffer toe aan elke put om het uiteindelijke volume op 25 microliter per reactie te brengen. En voer de zware en lichte keten PCR reacties elk voor 50 cycli.

Aan het einde van de reacties, voer de monsters op 1%agarose gel om de positieve versterking hits visualiseren. Isoleer zowel de gepaarde zware als lichte kettingreacties uit dezelfde cel via gelextractie. Bepaal de concentratie van het DNA-fragment door de optische dichtheid tot 60 voor nauwkeurige ligatiemixberekeningen.

Combineer de teruggewonnen zware en lichte kettingfragmenten met een linkerfragment en de expressievectorback met behulp van een vierfragmentige ligatiereactie volgens de instructies van de fabrikant. En zet de ligatiereacties om in chemisch competente bacteriën volgens de instructies van de fabrikant. Eenmaal verguld op antibiotica platen, voeg vier milliliter groeimedium met antibiotica aan de resterende transformatie cultuur voor incubatie 's nachts bij 37 graden Celsius bij 250 rotaties per minuut.

De volgende ochtend, bereid een miniprep DNA van de 's nachts ligatie mix culturen volgens de instructies van de fabrikant en bepalen van de resulterende plasmide DNA-concentratie. Om de antigen specificiteit van de geïsoleerde antilichamen te bevestigen, transfect 10 microgram van het miniprep DNA met kationisch lipide basisreagens in een 10 milliliter suspensie van 293 cellen. Broed de celcultuur drie tot vier dagen bij 37 graden Celsius en 8% kooldioxide en 125 rotaties per minuut.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de cultuur voor 10 minuten op 1000 keer g, en herstellen van de verduidelijkt medium. Meet de IgG-concentratie in het supernatant via affiniteit met eiwit A en test elk antilichaam in het supernatant met een concentratie van 25 microgram per milliliter door ELISA tegen de individuele peptiden die voor de soort worden gebruikt volgens de standaard ELISA-protocollen. Bevestig vervolgens de positieve hits van het scherm met een extra ELISA met behulp van verdunningen van IgG-supernatant om een concentratiecurve te genereren die begint bij 20 microliter per milliliter en plotten tegen de optische dichtheid voor elk antigeen dat reactiviteit toont op het oorspronkelijke scherm ELISA.

Om antigeenspecifieke antilichamen van menselijke donoren te isoleren, kan een reeks cytometriepoorten worden bedacht om het doelgeheugen B-cellen te isoleren. De lymfocyten worden geïsoleerd op basis van hun celgrootte en granulariteit, met behulp van voorwaartse en zijverstrooiing. Na de uitsluiting van doubletten en dode cellen, phenotypic markers toestaan dat de segregatie van IgG-positieve CD19-positieve B-cellen en CD27-positieve geheugen B-cellen.

De eerste uitlezing van het eencellige klonen is een bevestiging van versterking van de respectievelijke zware en lichte variabele ketens. Hier, een voorbeeld van een zeer efficiënte versterking van 24 enkele cellen met een 42%gekoppeld herstel nadat PCR wordt getoond. Na het IgG klonen wordt de IgG expressie vector omgezet in menselijke embryonale nier 293 cellen.

Teruggewonnen antilichamen worden gescreend op het oorspronkelijke paneel van Tau peptiden gescoord voor reactiviteit door ELISA. Aanvullende bevestiging wordt vervolgens voltooid met behulp van een concentratiecurve van dezelfde recombinante antilichaammonsters tegen de peptiden die in het oorspronkelijke scherm zijn geïdentificeerd. Voor elke positieve treffer kan een individuele plasmidek worden geïsoleerd uit de getransformeerde pool en opnieuw worden bevestigd door dezelfde ELISA-methode.

Het doel is de versterken sequenties van enkele cellen, dus het belangrijkste om te onthouden is dat elke verontreiniging zal worden versterkt tijdens de PCR gedeelte van deze procedure. Deze procedure levert intacte menselijke recombinante antilichamen op, die de zuivering en de functionele karakterisering van zo veel antilichamen mogelijk maakt aangezien u wenst te produceren.