Name: Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer een semi-geautomatiseerde methode voor real-time meting van luchtweg oppervlak vloeibare pH bij primaire menselijke luchtweg epitheelcellen. Deze techniek helpt ionkanalen te identificeren en therapeutische effecten te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door twee CF Trust strategisch onderzoekscentrum Grants (SRC003 en SRC013) en een medisch Onderzoekraad (MRC) vertrouwen in concept Grant (MC_PC_15030). JG werd gesteund door een toelage van de medische Stichting van het onderzoek (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB werd gesteund door een medisch Onderzoekraad clinicus Scientist Fellowship (de heer/M008797/1). IH werd ondersteund door een welkom Trust Clinical training Fellowship (203520/Z/16/Z). Het onderzoek werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor gezondheidsonderzoek Newcastle biomedisch onderzoekscentrum gevestigd in Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust en de Universiteit van Newcastle. De standpunten zijn die van de auteur (s) en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR of het ministerie van volksgezondheid. Primaire cellen van Dr. BOUCHE15R0 werden ondersteund door Cystic Fibrosis Foundation Grant (P30DK065988) en NIH Grant.

Primaire niet-CF (n = 3 donoren, leeftijd 34, 27 en 23 jaar oud) en CF (n = 3 donateurs, alle F580del/F508del; leeftijd 40, 41, onbekend) hAECs waren een vriendelijke gift van Dr. Scott H. (het Instituut van de Long van Marsico, de Universiteit van Noord-Carolina bij Chapel heuvel, Verenigde Staten) en waren obtai Ned onder Protocol #03-1396 goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina op Chapel Hill biomedische Institutional Review Board. De cellen werden geteeld volgens eerder gepubliceerde methoden met behulp van de groei en differentiatie media beschreven door Fulcher en35,36.
1. monstervoorbereiding
<ol><li>Grow primaire hAECs op 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteunt (tabel van materialen) op lucht-Liquid interface voor ten minste 28 dagen, zoals eerder beschreven35,36.</li>
	<li>Bereid 50 ml steriele oplossing van HCO3- bevattende Krebs-bufferoplossing (HCO3- krb, concentraties worden gegeven in mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl2 (1), MgCl2 (1), D-glucose (5)) en filter-steriliseren met behulp van een 0,2 μm spuit filter.</li>
	<li>Verander de basolaterale medium tot Fresh differentiatie medium zoals beschreven in 1,135,36. Nota: men heeft aangetoond dat de basolaterale glucoseconcentratie ASL pH33beïnvloedt. In dit stadium kan het glucosegehalte van het basolaterale compartiment worden gecontroleerd door het medium te vervangen door gebufferde oplossingen van bekende glucose concentraties.</li>
	<li>Was het apicale oppervlak van de cellen door toevoeging van 150 µ l van HCO3- krb en incubeer voor 20 min bij 37 °c, 5% Co2.</li>
	<li>Verwijder de apicale Wash zonder verstoring van het epitheel door opzuigen het zorgvuldig met behulp van een steriel glas Pasteur pipet en een steriele P200 pipet Tip gekoppeld aan een aspiratie pomp die een vacuüm in de collectie fles creëert. In dit stadium, moet er zo weinig vloeistof blijven op het apicale oppervlak mogelijk om de lucht-vloeibare interface te herstellen.</li>
	<li>Incubeer de cellen voor een verdere 30 min bij 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>2. achtergrond meting
<ol><li>Schakel de plaat lezer en de computer in.</li>
	<li>Open het dashboard.</li>
	<li>Klik op Spark 10m, open de temperatuur controle en ingesteld op 37 ° c. Open de gas-controle en stel de CO2 tot 5%.</li>
	<li>Wacht tot de temperatuur en CO2 hebben hun doelen bereikt.</li>
	<li>Open de plaat lezer lade, plaats de vocht cassette gevuld met 6 mL dH2O aan elke kant. Zorg ervoor dat het deksel en de onderkant van de plaat schoon zijn-zo niet, schoon met 70% van de ethanol op een stuk weefsel-en plaats de plaat in de luchtvochtigheid cassette. Opmerking: gedurende het experiment, de weefselkweek plaat deksel wordt gehouden op de plaat en alleen verwijderd bij het toevoegen van drugs of het veranderen van de basolaterale medium, die worden uitgevoerd in een weefselcultuur laminaire stroming kap om de culturen te houden in een steriele omgeving.</li>
	<li>Open de Spark Method Editor en stel de parameters op de software als volgt in:<ol>
<li>Selecteer de juiste plaat sjabloon (voor 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteunt, selecteert u de 24 goed plaat) en de putten die zullen worden gecontroleerd tijdens dit experiment.</li>
		<li>Voeg een temperatuur en CO2 bedieningspaneel en zet ze op 37 ° c en 5%, respectievelijk. Vink de wachttijd voor temperatuur/gas dozen.</li>
		<li>Voeg een kinetische lus paneel en selecteer de duur als de lus type en stel deze in op 5-10 min. Kies niet gedefinieerd als het interval type om continu lezen in te schakelen. Nota: de timing van het ononderbroken lezen hangt van het aantal putten/de voorwaarden af. 5 min is lang genoeg voor 6-12 putten terwijl een volledige plaat die 24 voorwaarden bevat 10 min van ononderbroken metingen zal vereisen.</li>
		<li>Binnen de kinetische lus, Voeg twee "fluorescentie intensiteit" panelen, met behulp van de drag and drop functie, die zal worden ingesteld voor de pH-gevoelige en de pH ongevoelig fluorescerende kleurstoffen respectievelijk. Stel excitatie en emissie golflengten tot 560 en 590 nm, respectievelijk voor de pH-gevoelige kleurstof en 495 en 520 nm, respectievelijk voor de pH-ongevoelig kleurstof.</li>
		<li>Stel het aantal flitsen op 30 en de z-positie tot 33200 voor elke fluorophore. Opmerking: de z-positie en gain instellingen zijn afhankelijk van de kenmerken van de plaat lezer. Stel de winst handmatig in op een waarde die hoog genoeg telt, zodat de verschillen tussen de monsters worden opgehaald, maar laag genoeg, zodat de toevoeging van een agonist niet zal genereren waarden uit het bereik van de detectie.</li>
		<li>Stel de meervoudige lezen per well naar de gebruiker gedefinieerd als een cirkel type van 3 × 3 formaat met een rand van 4750 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op de startknop om een achtergrond meting te maken en OK om het deksel van de luchtvochtigheid cassette te bevestigen is op zijn plaats.</li>
	<li>Aan het einde van de meting, open de plaat lezer lade, neem de plaat uit en Pplace de cellsit terug in de incubator tijdens de voorbereiding van de fluorescente Dye mix oplossing.</li>
	<li>Bereid de fluorescente kleurstof mengelings oplossing door 2 µ l van 1 mg/ml dextran-gekoppelde pH-gevoelige (pHsens) fluorescente kleurstof toe te voegen aan 0,2 µ l van 10 mg/ml dextran-gekoppelde pH-ongevoelig (pHins) fluorescerende kleurstof en 0,8 µ l van steriele HCO3- krb voor een finale volume van 3 µ L per voorwaarde. Opmerking: het totale volume van de kleurstof mix oplossing moet worden voorbereid voor n Wells + 1 als er tussen de 1 en 10 monsters, of n Wells + 2 als er tussen de 11 en 24 monsters. Dextran-gekoppelde kleurstoffen worden opnieuw samengesteld in gefilterde-steriele HCO3- krb oplossing, gepaard en opgeslagen bij-20 °c. Elke chemische stof kan worden toegevoegd in dit stadium voor een 16-24 h incubatietijd37 op het apicale oppervlak. Chemicaliën moeten worden bereid als 0,1 x, als het uiteindelijke volume, na absorptie van de overtollige vloeistof door de cultuur, zal rond 0,3 µ L voor een 6,5 mm diameter semi-doorlaatbare ondersteuning.</li>
	<li>Voeg voorzichtig 3 µ L kleurstof mix (zie 2,8) toe aan het apicale oppervlak van de cellen en broed in een nacht bij 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>3. kinetische meting
<ol><li>Herhaal stap 2,1 tot 2,4 om de plaat lezer voor te bereiden.</li>
	<li>Klik op het pictogram openen en selecteer het methode bestand dat wordt gebruikt voor de achtergrondmetingen</li>
	<li>In de Kinetic loop paneel, houd de lus type als duur en zet deze op 08 uur. Wijzig het interval type in vast en stel het in op 5 minuten. Houd de fluorescentie-intensiteits panelen hetzelfde als voor de achtergrondmetingen Opmerking: interval type voor achtergrondmetingen is ingesteld op "niet gedefinieerd" om continu te kunnen lezen. Voor kinetische en kalibratie-experimenten, is het IntervalType ingesteld op "Fixed" met een interval van 5 min. Dit kan worden aangepast op basis van het ontwerp van het experiment en het aantal voorwaarden.</li>
	<li>Open de lade van de plaat lezer; plaats de vocht cassette gevuld met 6 mL dH2O aan elke kant. Zorg ervoor dat het deksel en de onderkant van de plaat schoon zijn-zo niet, schoon met 70% ethanol op een stuk weefsel-en plaats de plaat in de luchtvochtigheid cassette, met zijn deksel.</li>
	<li>Start fluorescentie lezingen door te klikken op Start. Klik op OK nadat u hebt verzekerd dat het deksel van de vochtigheids cassette op zijn plaats is.</li>
	<li>Na n cycli, meestal tussen de 12 en 24, die gelijk is aan 1 tot 2 uur, klikt u op onderbreken om het experiment te onderbreken. Neem de plaat uit en breng alle drugs/agonisten basolaterally aan de verschillende monsters. Opmerking: wanneer de cellen worden genomen uit de plaat lezer, CO2 ontsnapt en dit zal leiden tot een toename van de ASL pH, zoals blijkt uit een daling van de pH-gevoelige kleurstof fluorescentie. Deze CO2-geïnduceerde pH-verandering keert binnen 10-15 min na het plaatsen van de culturen terug in de plaat lezer.</li>
	<li>Zet de plaat terug in de luchtvochtigheid cassette op de lade, de positie van de luchtvochtigheid cassette deksel en klik op Doorgaan om verder record ASL pH en monitor het effect van de drugs/agonisten op ASL pH.</li>
</ol>4. in situ pH kalibratie
<ol><li>Neem de plaat uit de plaat lezer.</li>
	<li>Aspireren het basolaterale medium/oplossing.</li>
	<li>Voeg 750 µ L en 1 µ L van zeer gebufferde standaardkromme oplossingen toe aan het basolaterale compartiment en het apicale oppervlak, respectievelijk. Nota: de hoogst gebufferde standaardkromme oplossingen bevatten (in mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl2 (1,2), MgCl2 (1,2), NaHEPES of MES of tris (100 mm). Gebruik MES om oplossingen te bufferen met een pH lager dan 7, NaHEPES voor oplossingen van pH 7-7.5 en tris voor oplossing met pH 8. Klem de pH op de gewenste waarde met HCl.</li>
	<li>Schakel de CO2 uit op de plaat lezer of zet deze op 0,1% en plaats de plaat terug in de luchtvochtigheid cassette.</li>
	<li>Stel de plaat lezer met dezelfde parameters zoals eerder beschreven, maar met geen CO2 als in stap 3,2.</li>
	<li>Begin fluorescentie lezingen, elke 5 min voor 1-1.5 h.</li>
</ol>5. evaluatie van het effect van kleurstof concentratie en suspensie volume op kalibratie gegevens
<ol><li>Bereid voldoende pH-gevoelige en ongevoelig kleurstof mengsel om de fluorescentie op te nemen op een minimum van 4 verschillende pH-waarden in 3 verschillende volumes. Opmerking: hier, meng 1 werd bereid met 26 µ L pH-gevoelig (1 mg/mL) en 2,6 µ L van pH-ongevoelig (10 mg/mL) en Meng 2 met 13 µ L pH-gevoelig (1 mg/mL) en 1,3 µ L pH-ongevoelig (10 mg/mL).</li>
	<li>Verdeel 2,2 µ L of 1,1 µ L van mengeling 1 of mengeling 2, respectievelijk in 12 putten van een 96 goed plaat en voeg genoeg kaliber bepalings oplossingen toe om definitieve volumes van 50, 100 of 200 µ L te verkrijgen en goed te mengen. Opmerking: in deze set-up worden fluorescentie tellingen opgenomen voor concentraties van kleurstoffen van 5 µ g/mL (in 200 µ L); 10 µ g/mL (in 100 of 200 µ L), 20 µ g/mL (in 50 of 100 µ L) of 40 µ g/mL (in 50 µ L).</li>
	<li>Draai de plaat lezer op, zet de temperatuur op 37 ° c en plaats de plaat in de plaat lezer. Draai de CO2 -controller niet aan. Nota: aangezien dit een kort experiment is en slechts genoeg tijd vergt om de temperatuur te equilibrate, is de vochtigheids cassette niet vereist.</li>
	<li>Stel de z-positie en de winst voor de 96 goed plaat en gebruik dezelfde parameters als voor het experiment gedaan op semi-doorlaatbaar ondersteunt.</li>
</ol>6. gegevensanalyse
<ol><li>Sla alle gegevens op in spreadsheets en maak een nieuw bestand.</li>
	<li>In de achtergrondbestand, selecteert u alle gemiddelde gegevens voor elk monster/voorwaarde voor beide golflengten, kopiëren en plakken naar het nieuwe bestand. Bereken de gemiddelde achtergrond voor elk goed en elke golflengte.</li>
	<li>Herhaal dit met de kalibratie en kinetische gegevens en aftrekken van de achtergrond van elk gegevenspunt voor elke golflengte.</li>
	<li>Bereken voor elk tijdpunt en elk monster de verhouding tussen pH-gevoelige en pH-ongevoelig fluorescentie</li>
	<li>Als alle monsters zijn verkregen van een individuele donor, bereken het gemiddelde van de ratio's op elk moment punt van de kalibratiecurve Nota: het is belangrijk om zo vele kaliber bepalings krommen als donor of basolaterale oplossingen te produceren. Inderdaad, deze parameters kunnen invloed hebben op de achtergrond lezingen of de snelheid van de absorptie van de vloeistof, die op zijn beurt zal de kleurstof concentratie beïnvloeden en dus de berekende pH.</li>
	<li>Voor elke tijdpunt, het genereren van een standaard curve van de ratio's, plotten de bekende pH-waarden op de x-as en de ratio's op de y-as.</li>
	<li>Bepaal het tijdstip waarop verhoudingen stabiel zijn, past een lineaire regressielijn en het verkrijgen van de vergelijking voor deze lijn.</li>
	<li>Van de kinetische gegevens, bereken de pH voor elke tijdpunt en perceel de pH op de y-as en de tijd op de x-as Opmerking: rust/basale pH kan worden berekend door middel van gegevenspunten over de stabiele meting van de pH voor de toevoeging van een agonist of een andere interventie. Het effect van een agonist kan worden gekenmerkt door het berekenen van het verschil in pH voor en na (een bepaalde hoeveelheid tijd) de behandeling of door het monteren van een niet-lineaire kromme aan de gegevenspunten direct na de interventie. Dit zal extra informatie geven over de t1/2 en de maximale waarde. Ten slotte kunnen de tarieven van de verzuring of alkalinization ook worden verkregen uit de helling van een rechte lijn gemonteerd op de eerste punten na de interventie.</li>
</ol>

<ol><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+ion+transport.+Part+one%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human airway ion transport. Part one.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).</li>
<li>Roomans, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+airway+surface+liquid+height+and+mucus+transport+by+fluorescence+microscopy%2C+and+of+ion+composition+by+X-ray+microanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3, Suppl 2. 135-139 (2004).</li>
<li>Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+surface+liquid+homeostasis+in+cystic+fibrosis%3A+pathophysiology+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets.</a> Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).</li>
<li>Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+as+targets+to+treat+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).</li>
<li>Garland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+pH-dependent+mucosal+dehydration+in+cystic+fibrosis+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).</li>
<li>Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+exacerbates+in+vivo+IL-1-dependent+inflammatory+responses+and+neutrophil+recruitment+during+pulmonary+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).</li>
<li>Berkebile, A. R., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airway+surface+liquid+pH+on+host+defense+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).</li>
<li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+pH+increases+airway+surface+liquid+viscosity+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li>
<li>Hunt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+airway+acidification.+Implications+for+asthma+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).</li>
<li>Kostikas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+in+expired+breath+condensate+of+patients+with+inflammatory+airway+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).</li>
<li>Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaled+breath+condensate+pH+and+exhaled+nitric+oxide+in+allergic+asthma+and+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis.</a> Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).</li>
<li>Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+secretion+in+freshly+excised+sinonasal+mucosa+from+asthma+and+sinusitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Rhinology+%26+Allergy%22%5BJournal%5D)">Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients.</a> American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).</li>
<li>Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+and+base+secretion+in+freshly+excised+nasal+tissue+from+cystic+fibrosis+patients+with+DeltaF508+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).</li>
<li>Coakley, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+surface+liquid+pH+regulation+by+cultured+cystic+fibrosis+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).</li>
<li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+airway+surface+pH+impairs+bacterial+killing+in+the+porcine+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung.</a> Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).</li>
<li>Shah, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+acidification+initiates+host+defense+abnormalities+in+cystic+fibrosis+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice.</a> Science. 351 (6272), 503-507 (2016).</li>
<li>Saint-Criq, V., Gray, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CFTR+in+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of CFTR in epithelial physiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).</li>
<li>ECFS Patient Registry Annual Data Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf">https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf</a> (2016).</li>
<li>Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf">https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf</a> (2017).</li>
<li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+with+cystic+fibrosis+have+a+reduced+nasal+liquid+pH%3B+a+small+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).</li>
<li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ivacaftor-induced+sweat+chloride+reductions+correlate+with+increases+in+airway+surface+liquid+pH+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis.</a> JCI Insight. 3 (15), (2018).</li>
<li>McShane, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+surface+pH+in+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis.</a> European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).</li>
<li>Schultz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+surface+liquid+pH+is+not+acidic+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis.</a> Nature Communications. 8 (1), 1409(2017).</li>
<li>Abou Alaiwa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+tromethamine+as+inhaled+therapy+to+treat+CF+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease.</a> JCI Insight. 1 (8), (2016).</li>
<li>Ngamtrakulpanit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Intrinsic+Airway+Acidification+in+Pulmonary+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Journal+of+Health+Science%22%5BJournal%5D)">Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis.</a> Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).</li>
<li>Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airways+in+cystic+fibrosis+are+acidified%3A+detection+by+exhaled+breath+condensate%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate.</a> Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).</li>
<li>Jayaraman, S., Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+surface+liquid+pH+in+well-differentiated+airway+epithelial+cell+cultures+and+mouse+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).</li>
<li>Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+fluorescence+measurement+of+airway-surface+liquid+depth%2C+salt+concentration%2C+and+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).</li>
<li>Lennox, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP12A+promotes+mucus+dysfunction+during+Type+2+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2109(2018).</li>
<li>Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+chloride+concentrations%2C+pH%2C+and+depth+of+airway+surface+liquid+in+distal+airways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways.</a> The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).</li>
<li>Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+CFTR+inhibitor+produces+cystic+fibrosis-like+submucosal+gland+fluid+secretions+in+normal+airways%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways.</a> FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).</li>
<li>Garnett, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+and+Pseudomonas+aeruginosa+acidify+cystic+fibrosis+airway+surface+liquid+by+elevating+epithelial+monocarboxylate+transporter+2+dependent+lactate-H%28%2B%29+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion.</a> Scientific Reports. 6, 37955(2016).</li>
<li>Gorrieri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+Cell+Hyperplasia+Requires+High+Bicarbonate+Transport+To+Support+Mucin+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release.</a> Scientific Reports. 6, 36016(2016).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).</li>
<li>Matsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+periciliary+liquid+layer+depletion%2C+not+abnormal+ion+composition%2C+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease.</a> Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).</li>
<li>Ahmadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+profiling+of+CFTR+modulators+in+patient-derived+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Genomic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia.</a> npj Genomic Medicine. 2, 12(2017).</li>
<li>Delpiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esomeprazole+Increases+Airway+Surface+Liquid+pH+in+Primary+Cystic+Fibrosis+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1462(2018).</li>
<li>Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((31P-MRS+measurements+of+extracellular+pH+of+tumors+using+3-aminopropylphosphonate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate.</a> American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).</li>
<li>Tannock, I. F., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+pH+in+tumors+and+its+potential+for+therapeutic+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation.</a> Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).</li>
<li>Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+tumour+pH+to+the+treatment+of+malignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease.</a> Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).</li>
</ol>

MB: niet gerelateerd aan dit werk: onderzoeker-geleid onderzoek subsidies van Pfizer en Roche diagnostiek; luidsprekers vergoedingen betaald aan de Universiteit van Newcastle van Novartis, Roche diagnostiek en TEVA. Reiskosten aan educatieve vergaderingen van Boehringer Ingelheim en Vertex Pharmaceuticals.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de dynamische meting van de ASL pH in de primaire menselijke luchtweg epitheelcellen. De kritieke stappen omvatten het wassen van het slijm van het apicale oppervlakte van de cellen, het meten van en het aftrekken van de achtergrond gebruikend de zelfde parameters zoals in het experiment, het optimaliseren van de z-positie en de aanwinst en het uitvoeren van een in situ pH kaliberbepaling.
De eerste stap van het wassen van de cellen is van cruciaal belang als een dikke laag slijm kan (i) voorkomen dat de kleurstoffen van het bereiken van de periciliary laag (PCL) en (II) vertraging of voorkomen dat de detectie van veranderingen in de fluorescentie in reactie op agonisten/remmers. Onze methode werd ontwikkeld om te bestuderen hoe primair hAECs de activiteit van HCO3- en H+ vervoerders in reactie op agonisten moduleerde. Hoewel het interessant zal zijn om te onderzoeken hoe veranderingen in PCL pH betrekking hebben op veranderingen in slijm pH, verdere ontwikkeling van dit protocol nodig is, met inbegrip van het gebruik van verschillende moleculaire gewicht-dextrans te differentiëren de 2 lagen en z-scans door middel van de hele ASL.
Achtergrond meting is een andere belangrijke stap van dit protocol. De apicale oppervlakte van volledig gedifferentieerde primaire luchtweg epitheel is zelden volledig vlak dat de lichte weg en daarom de achtergrond zal beïnvloeden. Ervoor zorgen dat de achtergrond lezingen worden uitgevoerd in dezelfde lokale punten van de putten als tijdens het experiment is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid en stabiliteit van de opnames.
Het optimaliseren van de z-positie en Gain zijn noodzakelijke stappen die moeten worden ingesteld voor elke verschillende concentratie van fluorescerende kleurstof die zal worden gebruikt. Dit voorkomt een hoge variatie tussen experimenten. Eenmaal ingesteld, onze assay biedt stabiele en reproduceerbare resultaten. Één van de redenen voor dit is dat de kleurstoffen op het apicale oppervlakte op de cellen in een klein volume van vloeistof worden toegevoegd die gemakkelijk door het epithelium wordt geabsorbeerd, dat een homogeen geëtiketteerde ASL verlaat. Een andere methode om de ASL vlek, dat kan even succesvol zijn, gebruikt droog poeder of een "Suspension" in PFC. Hoewel dit kan worden tijdbesparende (als de experimenten worden meestal uitgevoerd binnen 2 uur), is het onwaarschijnlijk dat de droge kleurstoffen volledig solubilize in de ASL en kan dus vormen klontjes. Aldus zullen de verschillende concentraties van pH-gevoelige kleurstof over de oppervlakte van de epitheelcellen worden gevonden.
De pH-kalibratie in situ is een belangrijke stap om accurate, reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Zoals getoond en toegelicht in de resultaten sectie, verschillen in ASL volumes zal invloed hebben op de fluorescentie telt en dus de geïnterpoleerde pH-waarden (Figuur 2 en Figuur 3). Terwijl verschillende groepen eerder de pH-metingen van de ASL hebben gepubliceerd, is er een breed scala aan waarden verkregen, zelfs tussen verschillende studies die door dezelfde groep8,17zijn gepubliceerd. Wij geloven dat door het uitvoeren van kalibraties in situ, de resultaten zullen worden meer reproduceerbaar. Vergeleken met andere pH-kalibratie technieken, die gebruik maken van de hogeK+/nigericin (of multiple ionophores) methode om de standaard curve28,29,30te genereren, de hier gepresenteerde assay heeft het voordeel dat , zolang elke stap wordt uitgevoerd in een veiligheidskabinet, de cellen gebruikt voor de ASL pH kan worden gewassen, bewaard en hergebruikt voor andere experimenten op voorwaarde dat de uitgevoerde behandelingen niet onherroepelijk invloed op de epitheelcellen.
De ontwikkeling en optimalisering van deze test heeft reproduceerbare resultaten opgeleverd en wij geloven dat deze methode andere groepen met hun ASL pH meting zal helpen. Nochtans, heeft deze techniek ook sommige beperkingen toe te schrijven aan opstelling en het type van cellen die worden gebruikt. Monitoring ASL pH over een langere periode dan die hier gepresenteerd (> 8-10 h) kan moeilijk blijken als een lange-termijn hoge luchtvochtigheid omgeving kan schade aan de apparatuur en het feit dat de meeste plaat lezers bieden alleen de mogelijkheid om kinetische lezingen record over een bepaalde hoeveelheid tijd (meestal 24 uur). Het gebruik van volledig gedifferentieerde primaire hAECs is van cruciaal belang in de manier waarop verschillende stadia van differentiatie zal de expressie van HCO3- en H+ vervoerders beïnvloeden. Er is echter vrijwel geen mogelijkheid om nauwkeurig de controle van het volume van de ASL in cellen geteeld onder dunne film omstandigheden. Zoals vermeld in het protocol en de resultaten secties, veranderingen in volume van invloed op de fluorescentie-ratio en het is helaas noodzakelijk om te veronderstellen dat in cellen gekweekt uit een enkel individu, gezaaid op dezelfde dag op verschillende semi-doorlaatbaar ondersteunt, ASL volumes hetzelfde zal zijn. Als gevolg van deze beperking, zal elke agonist of remmer die invloed hebben op vocht afscheiding of absorptie van invloed op de ASL volume en vermoedelijk de fluorescentie ratio's. Echter, in onze Assay, de kalibratiecurve wordt uitgevoerd aan het einde van het experiment, dus we kunnen veronderstellen dat deze veranderingen in het volume van invloed op de kalibratie ratio's op dezelfde manier als tijdens de kinetische experiment. Om deze reden adviseren wij groepen die geïnteresseerd zouden zijn in de ontwikkeling van deze test, om ten minste 2-3 repliceren per voorwaarde getest, omdat dit zal zorgen voor de oprichting van een standaard curve voor elke aandoening te gebruiken.
Hier presenteren we een eenvoudige, semi-geautomatiseerde, Assay die het mogelijk maakt real-time meting van mucosale oppervlak pH onder dunne-film omstandigheden. Het heeft de capaciteit om dynamische pH reacties in vele culturen in een dichtbijgelegen-gelijktijdige manier te onderzoeken die inter en intra-donor vergelijkingen toestaat. Opschaling deze methode om een 96 goed plaat formaat met behulp van gepolariseerde systeem (HTS 96 goed platen)38 zou nog hogere doorvoersnelheid als een Drug Discovery assay. Bovendien hebben we laten zien hoe deze techniek kan worden gebruikt om de acute effect van agonisten op ASL pH studie en we hebben al gepubliceerd dat deze methode kan worden gebruikt om de lange-termijn effect van een apicale proton pomp remmer studie op CF hAECs ASL39. Zoals pH is aangetoond dat de infectie te reguleren, ontsteking, slijm viscositeit en Ion transport, het identificeren van moleculaire doelen die kunnen verhogen pH zal waardevol zijn in het onderzoekgebieden van chronische longziekten en deze techniek zal mogelijk vergemakkelijken de ontwikkeling van drug screening in gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen. Tot slot, aangezien ontregeling in zuur-base homeostase speelt een belangrijke rol in andere ziekten, kan dit protocol worden aangepast, met optimalisatie stappen, om verschillende apparatuur (plaat lezers) en cel types, zoals andere epitheelcellen. Extracellulaire zuurgraad is een kenmerk van kanker40,41,42 en deze test kan helpen bepalen hoe solide tumoren produceren lage pHe of kan worden gebruikt als een low-throughput drug screening assay voor restauratie van pH homeostase. Evenzo, zoals voor chronische luchtwegaandoeningen, kan het ook een platform voor de ontwikkeling van een gepersonaliseerde geneeskunde aanpak.

De luchtweg epitheel wordt gedekt door een dunne (~ 10 μm) vloeibare laag genoemd de luchtweg oppervlakte vloeistof (ASL). De samenstelling en diepte (hydratatie) van deze ASL is strak gereguleerd en regelt de efficiëntie van de luchtwegen ontruiming door de mucociliary roltrap1,2,3,4. In de afgelopen jaren, het belang van de ASL H+/HCO3- inhoud is aangetoond door verschillende groepen te wijten aan de mogelijkheid om ASL hydratatie te reguleren5, luchtwegontsteking6 en infectie7, 8 evenals slijm viscositeit8,9. Belangrijk, hoewel er sommige controversen bestaat, hebben vele studies ontregeling van de luchtweg pH bij chronische luchtweg ziekten zoals astma10,11,12, COPD11gemeld, Bronchiëctasieën11, chronische rhinosinusitis13,14 en Cystic Fibrosis (CF)5,9,15,16,17, die suggereert dat therapieën die te herstellen ASL pH nuttig kan zijn om meerdere vormen van chronische luchtwegaandoeningen te behandelen. CF is de meest voorkomende autosomaal recessieve genetische ziekte in Kaukasische populaties en is te wijten aan mutaties in de CF transmembraan geleidings regulator (CFTR) gen. Dit gen codeert een anion (HCO3- en cl-) kanaal dat een cruciale rol speelt in ion en Fluid transport en homeostase over epitheel18. Hoewel CF is een multi-orgaan ziekte, de Long pathologie is de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit19,20 en gezien het primaire defect in CF is een verminderde transport van cl- en HCO3-, Men kan veronderstellen dat extracellulaire vloeistof pH bij mensen met CF zal worden dysregulated in vergelijking met mensen die niet hebben CF. zo is de meting van de ASL pH is een actueel gebied van CF onderzoek en verschillende groepen hebben ontwikkeld technieken om ASL pH te meten in CF Airways.
In vivo, luchtweg pH is gemeten met behulp van verschillende technieken, van micro-sondes (Fiber-Optic, goud of mobidium sondes)5,21,22,23,24 tot pH metingen van expectorated materiaal of uitgeademd adem condensaat (EBC)10,11,12,25,26,27. Op het gebied van onderzoek van CF, pH wordt op grote schaal bestudeerd vanwege de mogelijke klinische implicaties. Theoretisch, waardoor de luchtwegen meer alkalische zou kunnen verhogen bacteriële doden en verbeteren mucociliary klaring en luchtweg homeostase als geheel. Echter, in vivo/ex vivo studies rapporteren een breed scala van pH-waarden, en tot op heden, de resultaten zijn niet overtuigend met betrekking tot het bestaan van een verschil in pH tussen niet-CF en CF Airways. In het begin van de jaren 2000 rapporteerden verschillende groepen de pH van de EBC. In niet-zieke groepen, pH-waarden varieerde van 4,6 tot 8,5, maar interessant, EBC pH werd gevonden zuurder tijdens verergeringen bij mensen met CF12,27. Meer recentelijk, in vivo metingen van de ASL in menselijke en dierlijke modellen van CF hebben gemeld tegenstrijdige resultaten16,17,21,22,23, 24 en het is nog onduidelijk of CF Airways zijn zuurder dan niet-CF luchtwegen.
Zoals in vivo meting van de lagere ASL pH heeft bewezen moeilijk te wijten aan de zeer kleine hoeveelheid vloeistof voering van de luchtwegen en de mogelijke aanwezigheid van slijm pluggen in de ziekte, hebben veel groepen zich tot in vitro experimenten te meten ASL pH, voornamelijk met behulp van drie verschillende Methoden. De eerste aanpak maakt gebruik van dextran-gekoppelde cel-impermeant pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen die worden toegevoegd als een droog poeder, hetzij rechtstreeks aan de ASL of met behulp van een inerte vloeistof genaamd perfluorocarbon (PFC)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. deze techniek geeft echter weinig controle over de exacte hoeveelheid kleurstof die aan de culturen wordt toegevoegd en geeft een risico van kleurstof aggregaten en grote verschillen in concentratie tussen monsters en/of experimenten en zelfs binnen hetzelfde monster . Het is ook in het algemeen uitgevoerd met een confocale Microscoop, die de toepasbaarheid beperkt en in veel gevallen, voorkomt gedetailleerde monitoring van meerdere monsters en veranderingen in de opname-omstandigheden. De tweede methode gebruikt om te meten ASL pH is het gebruik van pH-gevoelige micro-elektroden5,15. ASL pH metingen zijn dus niet afhankelijk van fluorescerende kleurstof concentratie en moeten meer robuuste en reproduceerbare resultaten geven. Echter, deze methode niet mogelijk voor dynamische, real-time metingen van de ASL pH, noch is het gemakkelijk om meerdere lezingen te maken onder verschillende omstandigheden. Het is ook een arbeidsintensieve, complexe, proces dat specialistische apparatuur (microelektrode fabricage/elektrofysiologische opnameapparaten) en opleiding voor het verzamelen van de monsters voor de daaropvolgende pH-meting en kalibratie vereist. Bovendien hebben deze twee technieken ook een aantal inconsistenties getoond in de mogelijkheid om reproduceerbare resultaten te produceren: met behulp van de pH-gevoelige fluorescerende kleurstof methode, Tang et al. gerapporteerde waarden van 7,35 voor niet-CF ASL en 7,0 voor CF ASL8 overwegende dat in een meer recent papier uit dezelfde groep, ASL pH was 6,9 en 6,4 voor niet-CF en CF, respectievelijk17. Op een gelijkaardige manier, gaven de microelektrode metingen waarden van 6,4 in niet-CF ASL en 6,1 in CF ASL in een studie van 200315 terwijl de zelfde groep waarden van 6,7 voor niet-CF asl en 6,45 voor CF ASL in een studie van 20135rapporteerde. Ten slotte, in de derde benadering, onderzoekers voegen een relatief groot volume van zwak gebufferde oplossing op de apicale (mucosale) oppervlak van de culturen, waardoor de vernietiging van dunne film voorwaarden en het veranderen van ASL samenstelling, en mogelijk haar regelgeving. pH wordt vervolgens gemeten, hetzij met behulp van pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen33, door een pH-stat titratiemethode in een Ussing kamer13,14, of vereist de verdunde ASL te worden verwijderd uit de culturen en pH gemeten met behulp van een pH elektrode, analysator of Lakmoes stroken34. Een andere moeilijkheid in de nauwkeurige meting van ASL pH is de oprichting van een standaardkromme die zo nauwkeurig mogelijk is. Inderdaad, of de lezingen worden uitgevoerd met een elektrode die het verschil in elektrisch potentieel te meten via een hars of met behulp van pH-gevoelige fluorescerende kleurstoffen, zullen beide benaderingen worden beïnvloed door de lokale microomgeving van de monsters worden Gemeten. Meer in het bijzonder, de dissociatieconstante (KD) van de kleurstoffen kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de temperatuur, Ionische sterkte, viscositeit en mogelijke interacties van de kleurstof met cellulaire bestanddelen zoals eiwitten en potentieel slijm.
Om te proberen en te overwinnen veel van deze technische problemen, evenals de ontwikkeling van een meer dynamische, eenvoudiger en hogere doorvoersnelheid methode, hebben we een in vitro-techniek die records ASL pH in primaire hAEC culturen met behulp van een cel-impermeant pH-gevoelige fluorescerende kleurstof in een standaard commerciële plaat-lezer. De methode genereert reproduceerbare, dynamische, semi-geautomatiseerde, real-time metingen van de ASL pH van volledig gedifferentieerde 3D-cel culturen onder dunne film omstandigheden. Door het gebruik van een Multiple-well plaat lezer, kan deze semi-geautomatiseerde assay te maken in de buurt gelijktijdige metingen van de pH voor maximaal 24 voorwaarden meer dan 12 uur en kan het effect van het toevoegen van verschillende agonisten of remmers te controleren. In deze paper beschrijven we de methodologie in detail en rapporteren representatieve resultaten onder positieve en negatieve controle voorwaarden die de techniek valideert.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m spuitfilter</td><td>Starlab</td><td>E4780-1226</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mm Transwell met 0.4 &micro;m Pore Polyester Membraan Inzet</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>CFTRInh172</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>3430</td><td>Voorraadconcentratie: 50 mM; Eindconcentratie: 20 &micro;M</td></tr><tr><td>Costar 24-well Heldere TC-behandelde Meerdere Putjes Platen</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>dextran-gekoppelde pH-insensitive fluorescerende kleurstof: AlexaFluor488-dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Voorraadconcentratie: 1 mg/mL; Eindconcentratie: 0.67 mg/mL</td></tr><tr><td>dextran-gekoppelde pH-gevoelige fluorescerende kleurstof: pHrodo-dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>P10361</td><td>Voorraadconcentratie: 1 mg/mL; Eindconcentratie: 0.67 mg/mL</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>1099</td><td>Voorraadconcentratie: 50 mM; Eindconcentratie: 10 &micro;M</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 wel platen</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Vochtigheidscassette</td><td>TECAN</td><td>30090495</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader: TECAN SPARK 10M</td><td>TECAN</td><td>30086375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Universele pH elektroden DJ 113</td><td>VWR</td><td>662-1385</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare ph van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In de afgelopen jaren is het belang van mucosale oppervlak pH in de luchtwegen is gemarkeerd door haar vermogen om te reguleren luchtweg oppervlakte vloeistof (ASL) hydratatie, slijm viscositeit en activiteit van antimicrobiële peptiden, belangrijke parameters die betrokken zijn bij ingeboren verdediging van de Longen. Dit is van primair belang op het gebied van chronische ademhalingsziekten zoals cystische fibrose (CF) waar deze parameters dysregulated zijn. Terwijl de verschillende groepen ASL pH zowel in vivo als in vitro hebben bestudeerd, rapporteren hun methodes een vrij brede waaier van ASL pH waarden en zelfs tegenstrijdige bevindingen betreffende om het even welke pH verschillen tussen niet-CF en CF cellen. Bovendien, hun protocollen niet altijd voldoende details om te zorgen voor reproduceerbaarheid, de meeste zijn lage doorvoersnelheid en vereisen dure apparatuur of gespecialiseerde kennis uit te voeren, waardoor ze moeilijk vast te stellen in de meeste Labs. Hier beschrijven we een semi-geautomatiseerde TL-plaat lezer assay die de real-time meting van de ASL pH in staat stelt onder dunne film voorwaarden die meer lijkt op de in vivo situatie. Deze techniek zorgt voor een stabiele metingen voor vele uren van meerdere luchtweg culturen tegelijk en, belangrijker, dynamische veranderingen in de ASL pH in reactie op agonisten en remmers kunnen worden gecontroleerd. Om dit te bereiken, de ASL van volledig gedifferentieerde primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (hAECs) zijn 's nachts gekleurd met een pH-gevoelige kleurstof om te zorgen voor de heropname van de overtollige vloeistof om dunne film voorwaarden te garanderen. Nadat de fluorescentie in aanwezigheid of afwezigheid van agonisten wordt bewaakt, wordt pH kalibratie in situ uitgevoerd om de volume-en kleurstof concentratie te corrigeren. De beschreven methode biedt de vereiste controles om stabiele en reproduceerbare ASL pH metingen, die uiteindelijk kunnen worden gebruikt als een Drug Discovery platform voor gepersonaliseerde geneeskunde te maken, evenals aangepast aan andere epitheelweefsels en experimentele voorwaarden, zoals inflammatoire en/of host-pathogeen modellen.

De hierboven beschreven techniek maakt de dynamische meting van de ASL pH in maximaal 24 afzonderlijke primaire hAECs culturen mogelijk. Figuur 1 toont een schematische weergave van de belangrijkste stappen en apparatuur opgezet. De 's nachts geladen cellen worden geplaatst in een CO2 en temperatuur gecontroleerde plaat lezer waarin fluorescentie van dextran-gekoppelde pH-gevoelige en pH-ongevoelig kleurstoffen worden geregistreerd om de 5 minuten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> Figuur 1: schematische van de ASL pH meetmethode. Na het wassen van de culturen en het uitvoeren van een achtergrond lezen, primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (hAECs) ASL zijn geladen met dextran gekoppeld pH-gevoelige en pH-ongevoelig kleurstof mengsel overnachting bij 37 ° c, 5% CO2. De volgende dag, de plaat wordt overgebracht naar een temperatuur en CO2-gecontroleerde plaat lezer en fluorescentie van beide kleurstoffen wordt geregistreerd in de tijd. Na het experiment, een in situ kalibratie wordt uitgevoerd en de gegevens geanalyseerd en gepresenteerd als ASL pH in de tijd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Eerst onderzochten we het effect van verschillende volumes en kleurstof concentraties op de fluorescentie tellingen en dus op de 560/495 ratio. Inderdaad, het doel van het toevoegen van de pH-ongevoelig voor de pH-gevoelige kleurstof is te corrigeren voor de variabiliteit in de ASL laden. Nochtans, was het belangrijk om deze veronderstelling te testen en te evalueren als wij een standaard kaliberbepalingskromme konden gebruiken die in de afwezigheid van cellen in een 96 goed plaat voor alle experimenten en cel types wordt uitgevoerd. We bewaakten fluorescentie telt meer dan 1 uur in 50, 100 of 200 µ l van kalibratie oplossingen (bij pH 5,5, 6,5, 7 of 8) met 5, 10, 20 of 40 µ g/mL kleurstoffen. De resultaten worden gepresenteerd in Figuur 2a-C, en laten zien dat voor dezelfde pH en dezelfde concentratie van kleurstoffen, de gerapporteerde pHsens/pHins emissie ratio (560/495 op de y-as) verschilde afhankelijk van het volume (Figuur 2a). Bovendien, op dezelfde pH en hetzelfde volume, verschillende kleurstof concentraties bieden verschillende ratio waarden (Figuur 2b). Daarom, veranderingen in volume of kleurstof concentratie zal invloed hebben op de absolute waarde van de pH berekend op basis van de emissie ratio. Figuur 2c laat zien dat de tijd die nodig is voor de temperatuur evenwicht is ongeveer 15-20 min. Ter bevestiging van het effect van de kleurstof concentratie en het volume op de emissie ratio's, hebben we fluorescentie opgenomen van kleurstoffen geladen in de ASL van de primaire niet-CF en CF hAECs in situ. Vervolgens hebben we de kalibratie uitgevoerd en analyseerden de resultaten door (1) het genereren van een wereldwijde standaard curve van alle monsters of (2) het genereren van twee onafhankelijke standaard bochten voor elk type cel (niet-CF en CF). ASL pH van beide soorten cellen werden vervolgens uitgezet tegen de tijd (Figuur 3a, B) en gemiddeld (figuur 3c). ASL pH waarden verkregen uit een enkele wereldwijde standaard curve toonde een significant verschil tussen niet-CF-en CF-culturen (Figuur 3a, C),terwijl de ASL pH niet significant verschilde tussen CF en non-CF hAECs toen de pH werd berekend uit onafhankelijke standaard krommen (Figuur 3b, C). Deze resultaten tonen het belang van het genereren van onafhankelijke kalibratie bochten voor elk experiment en binnen experiment, voor elke donor monster, sinds wanneer de kalibratie bochten werden samen gemiddeld, hogere pHsens/pHins ratio waarden werden gevonden in CF-culturen , met vermelding van een zuurder pH (figuur 3c).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> Figuur 2: optimalisering van de pH kalibratie in vitro. De verschillende volumes van oplossingen van bekende pH en het bevatten van verschillende kleurstof concentraties werden geladen op een 96 goed plaat en de fluorescentie werd geregistreerd meer dan 1 h. effect van volume (a) en de concentratie vandekleurstof (B) op fluorescentie verhoudingen. Ratio's werden uitgezet tegen de pH voor de tijd-punt 24 min. (C) de helling van de verandering in fluorescentie werd berekend voor elke oplossing en uitgezet als een functie van de tijd (in min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> Figuur 3: optimalisering van de analyse van de pH kalibratie op primaire hAECs in situ. (A) representatieve sporen van ASL pH verkregen uit één enkele standaardkromme die gegevens van niet-CF-en CF-culturen gemiddeld. (B) representatieve sporen van ASL pH verkregen uit onafhankelijke standaard curve uitgevoerd op niet-CF-of CF-culturen. Elke gegevensset werd berekend op basis van zijn eigen kalibratiecurve. (C) evaluatie van de verschillen in ASL pH tussen non-CF en CF culturen als een functie van hoe de kalibratie werd uitgevoerd. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten, 2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Om onze techniek verder te valideren, hadden we een positieve controle nodig om aan te tonen dat de techniek in staat was om een ' verwachte ' verandering in ASL pH te detecteren. Aangezien de aanwezigheid van een meer zure ASL in CF-cellen is nog steeds controversieel, gebruikten we de camping agonist Forskolin, als een positieve controle voorwaarde, te stimuleren HCO3- secretie door middel van CFTR. Verwachte resultaten zou een Forskolin-geïnduceerde gealkaliseerd van de ASL in niet-CF-cellen die grotendeels zou worden verlaagd of afgeschaft in CF-cellen, afhankelijk van de ernst van de mutaties. Figuur 4a toont representatieve sporen van de ASL pH van niet-CF-en CF-cellen in de tijd en figuur 4b toont de gemiddelde gegevens van de ASL pH voor en na de behandeling met Forskolin in beide typen cellen. We kunnen verschillende informatie krijgen van deze resultaten. In de eerste plaats, zoals reeds getoond in Figuur 3b, C, de rust ASL pH was niet anders tussen niet-CF en CF epitheel. Ten tweede, de eerste 3-4 tijd-punten na het onderbreken van het experiment om de cellen met Forskolin te behandelen, toonde een grote verhoging van pH die binnen ~ 15 min. terugkreeg. Dit was te wijten aan de daling in CO2 concentratie tussen de plaat lezer (5%) en het weefselcultuur veiligheidskabinet (~ 0%). Volgens de Henderson Hasselbalch vergelijking, een pH van 7 in een 5% Co2 omgeving komt overeen met een concentratie van HCO3- van ~ 9,3 mm. Wanneer de cellen worden verwijderd uit de plaat lezer, een daling in CO2 concentratie op 0% zal theoretisch leiden tot een verhoging van de pH van > 8. Figuur 4a toont aan dat ASL pH verhoogd tot ~ 7,8, die kan worden verklaard door het verstrijken van de tijd herpositionering van de plaat in de plaat lezer (dat wil zeggen, in een 5% Co2 omgeving). Ten slotte, zoals voorspeld, toevoeging van basolaterale 10 µ M Forskolin (FSK) significant toegenomen ASL pH in niet-CF-culturen alleen. Zoals het is aangetoond door verschillende groepen dat er een verschil in steady-state ASL pH bestaat tussen CF en non-CF epitheel, wilden we verder onderzoek naar de schijnbare afwezigheid van een pH verschil in onze experimenten en de rol van CFTR. Om dit te doen hebben we pre-incubatie non-CF culturen met de specifieke CFTR remmer, CFTRinh172 (172). Zoals vermeld in het protocol sectie 2,8, de kleurstof mix werd voorbereid zoals hierboven vermeld en de remmer werd toegevoegd bij een concentratie van 0,1 X = 2 µ M. Volgens de literatuur, ASL hoogte van niet-CF-cellen is ongeveer 10 µm. In een semi-doorlaat steun van 6,5 mm diameter, is het theoretische volume van de ASL dus π × 3,252 = 0,3 µ l. Door toevoeging van 3 µ L van Dye + 172 op 2 µ M, zal de concentratie van de inhibitor, na absorptie van de overtollige vloeistof, theoretisch 20 µ M (1x, gewenste concentratie) zijn. Representatieve sporen in figuur 4c en gemiddelde samenvatting in figuur 4D laten zien dat 172 niet verminderen rusten ASL pH, maar heeft voorkomen dat de Forskolin-geïnduceerde stijging van de ASL pH, dus bevestiging van onze resultaten verkregen uit niet-CF versus CF en verder valideren van onze techniek.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> Figuur 4: dynamische ASL pH meting in reactie op CFTR activering door Forskolin. (A) representatieve sporen van het effect van Forskolin (FSK, 10 µ m) op de KINETIEK van ASL pH na verloop van tijd in niet-CF en CF hAECs. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten. (B) samenvatting van het effect van FSK op ASL pH in niet-CF-en CF-culturen. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van n = 69 non-CF culturen en 35 CF culturen (2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). Crepresentatieve sporen van het effect van CFTRinh172 (172, 20 µ m) op de door FSK geïnduceerde toename van de ASL pH in niet-CF-hAECs. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 5 experimenten. (D) samenvatting van het effect van 172 op FSK-geïnduceerde gealkaliseerd van de ASL in niet-CF-culturen. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 5 experimenten (2-weg ANOVA, Monica meerdere vergelijkingen test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Ten slotte, zoals vermeld in het protocol sectie 6,8, kunnen de tarieven van de verzuring/alkalinization worden berekend door een lineaire regressie te monteren op de initiële tijdpunten na de interventie. Figuur 5a toont aan dat het verwijderen van de basolaterale HCO3- bevattende oplossing (HCO3- krb) en vervangen door een Hepes Buffered oplossing, bij afwezigheid van co2, een duidelijke verzuring van de ASL veroorzaakte. Dit is in overeenstemming met het ontbreken van HCO3- remmende transepitheel HCO3- secretie, die het mogelijk maakt constitutieve Proton secretie door deze luchtweg cellen om gestaag te verminderen ASL pH15, 17. Interessant is dat de aanvankelijke verzuring van niet-CF-cellen beduidend langzamer was dan de CF-culturen (Figuur 5b).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> Figuur 5: dynamische veranderingen in de ASL pH in reactie op HCO3- verwijdering. (A) representatieve sporen waaruit het effect van HCO3- verwijdering op de kinetiek van ASL pH in de tijd in niet-CF en CF hAECs. De initiële tarieven van de verzuring werden verkregen via de helling van een rechte lijn gemonteerd op 7 tijd-punten na HCO3- verwijdering. Gegevens vertegenwoordigen de middelen ± SEM van n = 6 en 7 experimenten op niet-CF-en CF-culturen respectievelijk. Bsamenvatting van de initiële tarieven van de verzuring na HCO3- verwijdering. Gegevens vertegenwoordigen de middelen ± SEM van n = 6 en 7 experimenten op non-CF en CF culturen respectievelijk (Mann-Whitney test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

We presenteren een protocol om dynamische metingen van de luchtweg oppervlak vloeibare pH te maken onder dunne film voorwaarden met behulp van een plaat-lezer.

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Ons protocol is de eerste die het mogelijk maakt de dynamische meting van luchtwegoppervlak vloeistof, of ASL pH, in real-time onder zowel rusten en na agonistische of remmer behandeling. Deze methode helpt bij het identificeren van ionenkanalen en transporteurs die betrokken zijn bij extracellulaire pH-regulatie en kan worden toegepast op andere celsystemen waarin dit belangrijk is, zoals kanker. Nu in vergelijking met eerder gepubliceerde methoden, deze nieuwe techniek is relatief eenvoudig uit te voeren.Er is geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig. En kan ASL pH-metingen tegelijkertijd in meerdere culturen onder lucht vloeistof interface, of dunne film omstandigheden. Belangrijk is dat deze nieuwe techniek het potentieel heeft om de effecten van nieuwe therapieën te beoordelen, niet alleen voor cystische fibrose, maar ook voor andere chronische luchtwegziekten, zoals astma en COPD.Na ten minste 28 dagen van cultuur, was het apicale oppervlak van een menselijke luchtwegen epitheelcelcultuur met 150 microliters van bicarbonaat met Krebs buffer oplossing voor 20 minuten op de celcultuur incubator. Gebruik aan het einde van de incubatie een steriele glazen pipet met een steriele P200 pipetpunt gekoppeld aan een aspiratiepomp, om de was zorgvuldig aan te sporen zonder het epitheel te verstoren. Er moet zo weinig mogelijk vloeistof overblijven op het apicale oppervlak om de luchtvloeistofinterface te herstellen.Breng de cellen vervolgens 30 minuten terug naar de celkweek incubator. Als u een achtergrondmeting wilt uitvoeren, schakelt u de plaatlezer en de computer in. Nadat u het dashboard hebt geopend, klikt u op Spark 10M en stelt u de temperatuurregeling in op 37 graden Celsius.Open vervolgens de gasregeling en stel de kooldioxide in op 5%Wanneer de temperatuur en het gas hun doelen hebben bereikt, opent u de lade van de plaatlezer en voegt u een vochtigheidscassette met zes milliliter gedestilleerd water aan elke kant in de lezer. Bevestig dat het deksel en de onderkant van de celkweekplaat schoon zijn en plaats de plaat op de vochtigheidscassette, doe het deksel er weer op en sluit de lade. Open de Editor Spark Method, selecteer de juiste plaatsjabloon en selecteer de putten die tijdens het experiment moeten worden gecontroleerd.Voeg een temperatuur- en kooldioxideregelpaneel toe en stel de panelen in op respectievelijk 37 graden Celsius en 5%. Vink vervolgens het wachten op temperatuur/gas boxen aan. Voeg een kinetische luspaneel toe en selecteer de duur als lustype.Stel de duur in op vijf minuten en stel het intervaltype van het experiment in op niet gedefinieerd, om een continue meting te verkrijgen. Binnen de kinetische lus, gebruik maken van de drag and drop functie om twee fluorescentie intensiteit panelen die individueel zal worden ingesteld voor de pH-gevoelige en de pH-ongevoelige fluorescentie kleurstoffen toe te voegen. Stel de excitatie- en emissiegolflengte in op respectievelijk 560 en 590 nanometer voor de pH-gevoelige kleurstof.En respectievelijk 495 en 520 nanometer voor de pH-ongevoelige kleurstof. Stel het aantal flitsen in op 30 en de z-positie op 33, 200 voor elke fluorofophore. Stel de meervoudige lezen per goed voor de gebruiker gedefinieerd, als een drie bij drie door cirkel met een rand van 4, 750 micrometer.Klik op start om de achtergrondmeting te starten en klik goed, om te bevestigen dat het deksel van de vochtigheidscassette op zijn plaats is. Breng aan het einde van de meting de plaatlezer over naar een veiligheidskast voor weefselkweek en voeg drie microliters van vers bereide fluorescerende kleurstofoplossing toe aan het apicale oppervlak van de cellen. Breng de plaat dan 's nachts terug naar de couveuse van de celcultuur.Open voor de kinetiekmeting het methodebestand dat wordt gebruikt voor de achtergrondmetingen. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, opent u de plaatlezerlade en voegt u de vochtigheidscassette in. Plaats de schone plaat in de vochtigheidscassette met de hoes en klik op start om de fluorescentiemetingen te starten.Klik vervolgens goed, om te bevestigen dat het deksel van de vochtigheidscassette op zijn plaats is. Na een minimum van 12 cycli, klik op pauze om het experiment te onderbreken en verwijder de plaat om basolateraal toe te passen alle drugs of agonisten op de juiste monsters. Breng de plaat terug naar de vochtigheidscassette op de lade en plaats het vochtigheidscassettedeksel, voordat u klikt, om de ASL pH verder op te nemen en het effect van de behandeling te controleren.Voor pH-kalibratie in situ verwijdert u de plaat van de plaatlezer en zuigt u de basolaterale oplossing aan. Voeg 750 microliters van sterk gebufferde standaardcurveoplossing toe aan het basolaterale compartiment en een microliter oplossing aan het apicale oppervlak. Schakel de kooldioxide op de plaatlezer uit en breng de plaat terug naar de vochtigheidscassette.Stel vervolgens de plaatlezer in met dezelfde parameters als aangetoond, maar zonder kooldioxide, en start de fluorescentiemetingen om de vijf minuten gedurende één tot anderhalf uur. Selecteer voor gegevensanalyse alle gemiddelde gegevens voor elk voorbeeld en of de voorwaarde voor beide golflengten in het achtergrondbestand en kopieer en plak de gegevens in een nieuw bestand. Bereken vervolgens de gemiddelde achtergrond voor elke put en elke golflengte.Nadat u de kalibratie- en kinetische gegevens op dezelfde manier hebt gekopieerd en geplakt, trekt u de achtergrond van elk gegevenspunt voor elke golflengte af. Bereken voor elk tijdspunt en elk monster de verhouding tussen de pH-gevoelige en de pH-ongevoelige fluorescentie. Voor elk tijdpunt genereert u een standaardcurve van de verhoudingen en plott u de bekende pH-waarden op de x-as en de verhoudingen op de y-as.Bepaal het tijdstip waarop de verhoudingen stabiel zijn, pas op een lineaire regressielijn en verkrijg de vergelijking voor deze regel. Bereken vervolgens de pH voor elk tijdspunt en plot de pH op de y-as en de tijd op de x-as. In dit representatieve voorlopige experiment zonder cellen met dezelfde pH en dezelfde concentratie verschilden de pH-gevoelige en pH-ongevoelige emissieverhoudingen afhankelijk van het volume van de kleurstof.Bovendien bevatten verschillende kleurstofconcentraties bij hetzelfde pH en hetzelfde volume verschillende verhoudingswaarden, wat aangeeft dat veranderingen in het volume of de kleurstofconcentratie van invloed zijn op de absolute waarde van de pH die is berekend op basis van de emissieverhouding. Bovendien is de tijd die nodig is voor temperatuurevenwicht ongeveer 15 tot 20 minuten, ongeacht het kleurstofvolume of de concentratie. ASL pH-waarden verkregen uit één wereldwijde standaardcurve tonen een significant verschil aan tussen niet-cystische fibrose en cystische fibroseculturen.Overwegende dat de ASL pH niet significant verschilt tussen cystische fibrose en niet-cystische fibrose menselijke luchtwegeptropelale cellen wanneer de pH wordt berekend op basis van onafhankelijke standaardcurven. Daarom is het belangrijk om onafhankelijke kalibratiecurven te genereren voor elk experiment en binnen elk experiment, voor elk donormonster, zoals wanneer de kalibratiecurven samen worden gemiddeld, hogere pH-gevoelige, pH-ongevoelige ratiowaarden worden gevonden in cystische fibroseculturen die wijzen op een zuurdere pH. Zoals verwacht verhoogt de toevoeging van basolaterale forskolin de ASL-pH in alleen niet-cystische fibroseculturen aanzienlijk.Aangezien deze cellen onder steriele toestand zijn gehouden, kunnen ze worden gewassen, opnieuw worden gevoed en een paar dagen later worden gebruikt voor toekomstige experimenten. Alle biologische menselijke specimens moeten als potentieel gevaarlijk worden beschouwd. Dus zorg ervoor dat u het juiste niveau van opsluiting en persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken, afhankelijk van uw monsters.Het is belangrijk om de achtergrondmetingen en de pH-kalibraties voor elke set monsters uit te voeren om de variabiliteit tussen de donoren te verminderen en de nauwkeurigheid te verbeteren.

real-time-semi-automated-fluorescent-measurement-airway-surface

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Centers for Disease Control and Prevention.

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Beschreven is de celkweek en blootstellingsmethode van een in vitro bronchiaal model voor realistische, herhaalde inhalatieblootstelling aan deeltjes voor toxiciteitstests.

Een lucht-vloeistof interface bronchiale epitheel model voor realistische, herhaalde inhalatie blootstelling aan deeltjes in de lucht voor toxiciteit testen

Dit protocol beschrijft nasale epitheelcelverzameling, uitbreiding en differentiatie naar organotypische luchtwegepitheelcelmodellen en kwantificering van de trilharenslagfrequentie via live-cell imaging en op maat gemaakte scripts.

Verzameling, uitbreiding en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcelmodellen voor kwantificering van Cilia Beat Frequency

Het huidige protocol beschrijft door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelachtige cellen (iAT2s). Deze cellen kunnen worden gekweekt als zelfvernieuwende bollen in 3D-cultuur of worden aangepast aan de air-liquid interface (ALI) -cultuur.

Het genereren van 3D-bollen en 2D-lucht-vloeistofinterfaceculturen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen

Recente ontwikkelingen in door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatieprotocollen maken de stapsgewijze afleiding van orgaanspecifieke celtypen mogelijk. Hier geven we gedetailleerde stappen voor het onderhoud en de uitbreiding van iPSC-afgeleide luchtwegbasale cellen en hun differentiatie in een mucociliair epitheel in lucht-vloeistof interfaceculturen.

Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Lucht-vloeistof interfacecultuur wordt vaak gebruikt om pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen door primaire normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren die de apicale zijde van de longluchtweg nabootsen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bepalen van de kwaliteit door de biofysische eigenschappen te monitoren, zoals ciliaire functie en membraanintegriteit.

Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

Levendcelbeeldvorming van calciumsignalering wordt uitgebreid gebruikt om calciummobilisatie te bestuderen in stabiele cellijnen die in monolagen zijn gekweekt. Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming van calciumsignalering in levende cellen met behulp van levende-celkleurstoffen op complex, primair weefsel, en maakt ook gebruik van machine learning-software om de fluorescentieintensiteit van duizenden individuele cellen gelijktijdig te kwantificeren, waardoor analyses worden...

Fluorescentie-gebaseerde calciumbeeldvorming in primaire epitelkweken van de menselijke luchtweg met behulp van geautomatiseerde celsegmentatie

Dit protocol beschrijft een methode om de productie van stikstofoxide (NO) te kwantificeren in luchtwegepitelculturen die gedifferentieerd zijn bij het lucht-vloeistofinterface (ALI) door nitriet te meten in apicale secreties met behulp van een trijodide-gebaseerde chemiluminescentie-assay.

Meting van stikstofmonoxideproductie in muizen-tracheale epitheelcelculturen, onderscheiden aan de lucht-vloeistofgrens

Leer een semi-geautomatiseerde methode voor real-time meting van luchtweg oppervlak vloeibare pH bij primaire menselijke luchtweg epitheelcellen. Deze techniek helpt ionkanalen te identificeren en therapeutische effecten te beoordelen.

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen (Video) | JoVE Journal

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

Meer video's verkennen