Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Immunoprecipitatie is een zeer krachtige techniek om een doeleiwit te isoleren en te zuiveren. In gladde omstandigheden kunnen eiwitten, regelaars of substraten co-immunoprecipitated zijn. Een nieuw interactienetwerk kan dan worden ontdekt.

De activiteit van het immuunprecipiteerde eiwit kan ook worden beoordeeld. In het bijzonder kan de activiteit van een kinase op verschillende substraten worden getest door P32-ATP-etikettering. Niettemin kan de activiteit van remmers die zich richten op een kinase die betrokken is bij een ziekte worden geëvalueerd.

Zij kunnen loodverbindingen vormen om nieuwe geneesmiddelen te ontwikkelen. Deze methode kan worden uitgebreid van zoogdieren tot gist of bacteriën. Deze techniek is niet zo moeilijk.

Op belangrijke punten: zorg ervoor dat u een negatieve controle om er zeker van de gedetecteerde interactie is specifiek, en zorgvuldig kiezen lysis voorwaarden om interacties en activiteit te houden. Kleine details en gebaren zijn belangrijk om het succes van deze techniek te garanderen, en ze worden nooit beschreven in materialen en methoden van artikelen. Het aantonen van de procedure zal Fabienne Godin, een technicus uit ons laboratorium.

Nadat cellen zijn bereid in de cel kweekruimte binnen de biosafety kabinet, gebruik maken van een 10 milliliter pipet om de media te verwijderen uit de platen en gooi het in een speciale afvalfles met bleekmiddel. Voeg vervolgens 10 milliliter verse aanvullende DMEM toe en zet de platen terug in een couveuse bij 37 graden Celsius. Om het transfectiemengsel voor te bereiden, in een buis van 15 milliliter, voeg 450 microliter van 10 millimolar Tris hydrochlorideoplossing toe bij pH 7.5, aangevuld met één millimolar EDTA en 50 microliter van 2,5 molaire calciumchlorideoplossing.

Mix door inversie. Voeg in de buis een volume toe dat overeenkomt met 10 microgram plasma-DNA, versterkt door een DNA-midiprep-kit en verdund met de elutiebuffer van deze kit en waarvan de concentratie is bepaald. Keer de buis om te mengen.

Voeg vervolgens, met een soepele agitatie op een vortexmixer, langzaam 500 microliters BES gebufferd zoutoplossing 2X-concentraat toe, druppel voor druppel in de buis. Verplaats het zeer zorgvuldig, niet om de complexe vorming tussen DNA en calciumfosfaat te verstoren. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten, of tot 45 minuten, bij kamertemperatuur.

Breng de plaat over om van de couveuse naar de veiligheidskast te gaan. Voeg de voorbereide DNA-complexen druppel voor druppel op de cellen over het hele oppervlak van de plaat. Incubeer gedurende 24 tot 72 uur in de couveuse bij 37 graden Celsius.

Om eiwitafbraak te voorkomen, bereidt u lysebuffer op ijs, rekening houdend met vier milliliter lysebuffer voor elke transfected plaat. Neem de plaat met doorgefecteerde cellen uit de couveuse. Verwijder de media en gooi het weg in een speciale bleekmiddel afvalfles.

Om de cellen te wassen, voeg drie milliliter koude PBS aan de zijkant van de plaat druppel voor druppel, om te voorkomen dat losmaken van transfected cellen. En draai voorzichtig de plaat om de buffer over het oppervlak te verspreiden. Kantel de plaat om de PBS te verwijderen en gooi deze in de afvalfles.

Herhaal de was nogmaals. Leg de plaat op ijs. Verwijder aan het einde voorzichtig de rest van de PBS.

Voeg vervolgens 500 microliters koude lyse buffer toe aan de transfected gewassen cellen. Verdeel het over het oppervlak van de plaat. 10 minuten incuberen op ijs.

Van tijd tot tijd, opnieuw verspreid de buffer over het oppervlak van de plaat. Daarna gebruikt u een celspatel om de cellen van het oppervlak te schrapen en ze te verzamelen in een microcentrifugebuis. Centrifuge gedurende 10 minuten op 10,000 keer G en vier graden Celsius.

Verzamel het supernatant lysaat in een nieuwe microcentrifugebuis en verzamel een 50 microliter aliquot van deze fractie tot een andere nieuwe microcentrifuge buis. Deze aliquot zal worden gebruikt om te controleren of transfected eiwitten goed worden uitgedrukt. Gooi de pellet in de prullenbak.

Ten eerste, voorzichtig resuspend de voorraad oplossing van agarose kralen in combinatie met de juiste antilichaam. Snijd het einde van een 200 microliter tip om een een tot twee millimeter opening te maken. Bevestig de punt aan een micropipet en maak 40 microliter van de oplossing, zodat kralen in de punt kunnen komen.

Pipette de kralen op en neer meerdere malen om de tip te verzadigen om het juiste volume van kralen te garanderen en de overdracht van de kralen naar een microcentrifuge buis. Voeg 500 microliters TNET-buffer toe, meng door inversie en centrifuge gedurende twee minuten bij 1,000 keer G en vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 500 microliter TNET-buffer toe.

Broeden op een roterend wiel gedurende ten minste een uur op vier graden Celsius. Vercentrifugeert vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 1.000 keer G en vier graden Celsius en was de kralen twee keer met 500 microliters lysisbuffer door omkeren en centrifugeren. Breng na het wassen het eerder verzamelde totaalfractie in de buis en broed twee tot vier uur op een draaiend wiel bij vier graden Celsius.

Centrifuge de buis met de immuunprecipiteerde kralen gedurende twee minuten bij 1.000 keer G en vier graden Celsius. Was de kralen vijf keer met 500 microliters lysebuffer door het omkeren en centrifugeren. Let er bij het wassen van de kralen op dat je niet te dicht bij de kralen komt terwijl je supernatant verwijdert.

Anders worden kralen aangezogen en aan het einde van het experiment blijven er geen kralen meer over. Voor elutie, eerste centrifuge gedurende twee minuten op 1,000 keer G en vier graden Celsius. Gebruik een micropipet van één milliliter om de supernatant voorzichtig te verwijderen.

Dan, met een Hamilton spuit uitgerust met een gecementeerde naald, verwijder de laatste druppels van de supernatant om aspiratie van de kralen te voorkomen. Voeg vervolgens 40 microliter van 4X Laemmli buffer toe. Homogeniseren door zachtjes op de buis te tikken.

Vijf minuten incubeer maken bij kamertemperatuur. Dan, centrifuge gedurende vijf minuten op 10,000 keer G en kamertemperatuur. Met een Hamilton spuit, breng de supernatant eluate in een nieuwe microcentrifuge buis.

Bewaar op min 80 graden Celsius. HEK-293 cellen werden doorfected met niet-gelabelde LIMK 2-1 of een van de HA gelabelde isovormen van LIMK 2. LIMK 2-1 wordt goed uitgedrukt in de verschillende omstandigheden.

Anti LIMK 2-1 antilichaam herkent LIMK 2a en LIMK 2b-isovormen niet, en het is specifiek, omdat het signaal afneemt wanneer cellen worden getransfecteerd met LIMK2 klein storend RNA, in vergelijking met kleine storende RNA. In verschillende menselijke cellijnen bleek LIMK 2-1 te worden uitgedrukt in HEK-293 en HeLa, maar niet in C6. Co-immuunsyxatie-experimenten werden gebruikt om de interactie van LIMK2-1 met upstream kinase ROCK te beoordelen. Elk van de verschillende eiwitten gecodeerd door de transfected vectoren werden goed uitgedrukt.

De drie isovormen van LIMK2, evenals larp6, werden efficiënt geïprecipiteerd. In de eluates werd ROCK ontdekt en dus gecoördineerd met de drie isovormen van LIMK2, maar niet met larp6. De gedetecteerde interactie is dan specifiek.

Coimmunoprecipitated LIMK 2-1 werd getest op zijn kinase activiteit via gamma P32 ATP etikettering. LIMK 2-1 heeft geen cofilin gefossileerd, terwijl het fosforylelaatyeïne, of MBP deed. LIMK 2-1 wordt in deze test efficiënt geïprecipiteerd.

Het is van cruciaal belang om negatieve controle te hebben tijdens het uitvoeren van immunoprecipitatie om er zeker van te zijn dat de interactie specifiek is. De samenstelling van een lysebuffer moet zorgvuldig worden ingesteld om interactie en activiteit te behouden. Bij immunoprecipitatie kan kinaseactiviteit worden beoordeeld om verschillende substraten te tellen.

Mutatie kan gemakkelijk worden geïntroduceerd en kan de rol van specifieke residuen ontrafelen. Functionele studies kunnen ook worden uitgevoerd om de fysiologische rol van nieuwe gemarkeerde interacties te begrijpen. Cellen moeten worden gekweekt in een speciale cultuurruimte in een bioveiligheidskast.

P32 ATP moet met specifieke voorzichtigheid worden behandeld. Schild om te beschermen tegen straling, Geiger teller, specifieke afval verzamelen, persoonlijke borst en vinger badges om radioactieve blootstelling en filter tips te detecteren.