Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Isolatie in fenotypische analyse van immuuncellen uit de darm met behulp van dit protocol zijn van toepassing gebleken op het begrip van GI en systemische ontstekingsstoornissen. Deze methode isoleert een aanzienlijk aantal levensvatbare mononucleaire cellen door het minimaliseren van vervuilend puin waardoor latere immuun fenotypering door Fleur's Atomistry of andere methoden. Aangezien de darm is een belangrijke doelplaats van ontsteking in veel ziekten, dit protocol kan nuttig zijn voor de studie van de darm immuun populaties in muismodellen van kanker, allergie, transplantatie, en auto-immuniteit.

Om de opbrengst en efficiëntie van dit protocol te optimaliseren, wordt aanbevolen om belangrijke oplossingen en materialen vooraf te voorbereiden, zoals opgemerkt. Na het euthanaseren van de muis en het maken van een verticale middellijn incisie, gebruik fijne dissectie schaar om het buikvlies te openen. Met behulp van tangen, verplaats de dunne darm aan de ene kant en bloot de dalende dikke darm.

Trek iets omhoog op de dalende dikke darm om het rectale gedeelte van de dikke darm maximaal bloot te leggen. Snijd vervolgens het distale rectum diep in het bekken en ontleed de hele dikke darm als één eenheid van het distale rectum tot de cecal cap. Plaats eerst de dikke darm op een bevochtigde papieren handdoek en gebruik het stompe uiteinde van een schaar of tang om milde druk op de darmwand toe te passen en de vaste ontlasting te extraheren.

Plaats vervolgens de dikke darm in een petrischaaltje en gebruik een 10 milliliter spuit met een 18-gauge botte gevulde naald om de darm te spoelen met 10 milliliter gekoelde dikke darmbuffer. Plaats de dikke darm in een petrischaal gevuld met 5-10 milliliter gekoelde dikke darm buffer en roeren handmatig om de resterende darminhoud te wassen. Herhaal deze was 2-3 keer, met behulp van een nieuwe petrischaal met verse buffer voor elke wasbeurt.

Breng hierna de dikke darm over naar een nieuwe petrischaal met verse gekoelde dikke darmbuffer. Snijd de dikke darm in de lengterichting van de meer gespierde rectale einde aan de proximale dikke darm, om een enkele rechthoekige open dikke darm stuk te genereren. Gooi de mediaan in de schotel en vervang deze door schone gekoelde dikke darmbuffer.

Plaats de rechthoekige dikke darm weefsel op een papieren handdoek die is bevochtigd met dikke darm buffer en snijd het door het horizontaal snijden en vervolgens in kleine fragmenten. Gebruik fijne tangen om de dikke darm fragmenten te verzamelen in een 50 milliliter polypropyleen kegelvormige buis met 20 milliliter van gekoelde dikke darm buffer. Was vervolgens de fragmenten door de buis gedurende 30 seconden krachtig te wervelen.

Laat na de wasbeurt de weefselfragmenten zich op de bodem van de buis nestelen voordat u de supernatant decanteert of stofzuigt, zorg ervoor dat u weefselfragmenten niet verliest, herhaal dit hele wasproces 3 keer met behulp van verse dubbele puntbuffer voor elke wasbeurt. Om te beginnen, voeg 20 milliliter collagenase spijsvertering buffer aan de buis met de gewassen dikke darm fragmenten. Verzegel de buis en plaats deze in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius met een rotatiesnelheid van 2 keer G gedurende 60 minuten.

Zorg ervoor dat de weefselfragmenten constant in beweging zijn tijdens het roeren. Giet eerst 5 milliliter van 66% op silica gebaseerde dichtheidsscheidingsmedia in elk van 3 afzonderlijke 15 milliliter polypropyleenbuizen. Gebruik vervolgens een serologische pipet van 25 milliliter om alleen de supernatant van Collagenase Digestion 1 te verzamelen.

Filter de supernatant door een 40 microliter slechte filtratie stof cel zeef geplaatst in een schone 50 milliliter polypropyleen conische buis. Vul de buis volledig met gekoelde dikke darm buffer om de collagenase spijsvertering buffer te blussen. Draai dan de cellen, aspirate de supernatant, en houd de pellet op ijs.

Ga door met het uitvoeren van Collagenase Digestion 2 zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat Collagenase Digestion 2 is voltooid, spoel de weefselfragmenten krachtig heen en weer tussen de buis en een 10 milliliter spuit door een 18-gauge stompe eindnaald. Herhaal deze flush voor ten minste 7-8 passages, voortzetting totdat er geen bruto weefselfragmenten of debri zichtbaar zijn.

Vervolgens passeren het weefsel disaggregatie suspensie door middel van een 40 micrometer slechte filtratie stof cel zeef geplaatst in een schone 50 milliliter polypropyleen buis. Vul de buis aan de rand met gekoelde dikke darm buffer om de spijsvertering te blussen en centrifuge op 800 keer G in bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant via vacuüm aspiratie en trek de opnieuw opgehangen pellet van Collagenase Digestion 1 naar de bijbehorende buis.

Na deze, opnieuw opschorten elke pellet in 24 milliliter van 44%silica gebaseerde dichtheid scheiding media per dikke darm. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om langzaam laag 8 milliliter van deze media op elk van de 3 buizen met 66%silica gebaseerde dichtheid scheiding media. Breng de buizen in centrifugebakken zorgvuldig in balans met een weegschaal of een balans.

Centrifuge op 859 keer G in bij 20 graden Celsius gedurende 20 minuten zonder de pauze. Laat de roders om te komen tot rust te komen voordat het verwijderen van buizen, zorg ervoor dat niet te verstoren de cellen op de gradiënt interface. Visualiseer eerst de verloopinterface in de buurt van het 5 milliliterteken, waar meestal een 1-2 milliliter dikke witte band aanwezig is.

Vacuüm aanzuigen en gooi de bovenste 7 milliliter van de helling om gemakkelijker pipet toegang tot de interface. Met behulp van continue handmatige zuigkracht en gestage roterende polsbeweging, het verzamelen van de interface laag van cellen. Verzamel totdat de interface tussen de twee hellingen duidelijk is en refractile en breng de interface over naar een nieuwe 50 milliliter polypropyleen conische buis.

Voeg vervolgens FACS Buffer toe aan dit bad totdat de totale suspensie 50 milliliter bereikt. Centrifuge op 800 keer G in bij 4 graden Celsius gedurende 5 minuten. Dan, aspirate de supernatant via vacuüm aspiratie en opnieuw op te schorten de pellet in 1 milliliter van FACS Buffer.

De procedure beschreven in deze video kan worden gebruikt om mononucleaire cellen te isoleren van de dikke darm of, met wijzigingen, van de dunne darm. Bovendien wordt cytometrie en gegevensanalyse uitgevoerd om de fracties van apoptotische en necrotische/dode lymfocyten te vergelijken bij het gebruik van Collagenase E of D voor de isolatie, met onze zonder DNAse 1-behandeling. Na bijlage 5 en vast te stellen levende dode blauwe kleurstof op eencellige suspensies na elke isolatie, vertoonde Collagenase E zonder DNAse een aanzienlijk hoger percentage levende cellen na isolatie in vergelijking met Collagenase D zonder DNAse.

Zelfs in vergelijking met een van beide collagenase met DNAse. Daarnaast identificeerden we necrotische cellen met een mediaanpercentage van 41,0% in de Collagenase E-groep versus 90,0% in de Collagenase D-groep. 75,9% in de Collagenase E DNAse-groep en 80,3% in de Groep Collagenase DNAse.

Multi perimetrische stroomcytometrie wordt vervolgens toegepast op MNC geïsoleerd van CD45.2 klep-C ontvanger muizen op dag 7 na ontvangst van BMT of allogene of syngeneic BMT modellen. De gemiddelde absolute aantallen Donor CD4 positieve en CD8 positieve T-cellen gewonnen uit de BMT ontvanger dikke darm worden berekend en vergeleken. Het kan dus belangrijk zijn om zeldzame immuuncelpopulaties in dergelijke muismodellen te identificeren en/of te kwantificeren.

Zeldzame subsets, waaronder door donoren afgeleide FOX-P3 positieve T-regulerende cellen worden beoordeeld in zowel syngeneic als allogene BMT-modellen. Met behulp van deze methode, zelfs zeldzame subsets, zoals donor afgeleide colonic T regelgevende infiltrerende ontvanger muis dikke darm, na BMT, kan worden geanalyseerd. Opgemerkt moet worden dat Collagenase E actief is bij 37 graden Celsius.

Dus alle collagenase oplossingen moeten worden voorverwarmd voor voldoende collagenase activiteit en grondig geblust om activiteit te beëindigen. Dit protocol maakt een groot aantal mononucleaire cellen mogelijk die kunnen worden gebruikt voor latere karakterisering door een Fleur cytometrie, moleculaire biologietechnieken, microscopie, cultuur en plaats van o.a. Dit protocol voorzag in een betrouwbare beoordeling van ontsteking in de dikke darm van experimentele versus gecontroleerde muizen in een beenmergtransplantatiemodel.

Aldus vergemakkelijkend de ontdekking van nieuwe regelgevende immune mechanismen van transplantatietolerantie. Collagenase van Clostridium Istoliticum is een reagens dat moet worden behandeld met lab veiligheidstechnieken. Het vormt een gevaar voor de gezondheid bij inademing en kan huid- en oogirritatie veroorzaken.