Name: Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer live-cell microscopie voor het bestuderen van nucleaire dynamiek in splijtstofgist tijdens mitose en meiose. Deze methode maakt real-time observatie van eiwitgedrag mogelijk zonder toxische fixatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Natalia La Fourcade en Mon LaFerte bedanken voor het maken van de voorbereiding van dit manuscript een aangenamere inspanning. Dankzij leden van het Forsburg Lab die hebben bijgedragen aan de voltooiing van dit werk met hun inzicht, experiment ideeën en morele ondersteuning. Dit project werd gesteund door NIGMS R35 GM118109 naar SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
<li>Diffraction PSF 3D. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm">http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Convolve ED. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm">http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm">http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Live-celbeeldvorming tijdens mitose en meiose biedt de mogelijkheid om de nucleaire dynamiek te onderzoeken zonder het substantieel verstoren van splijtings gist fysiologie tijdens het verzamelen van gegevens. Echter, voorzichtigheid moet worden betracht om ervoor te zorgen dat cellen groeien tot de gewenste dichtheden vrij van milieu spanningen; en voor meiose, dat de cellen worden afgebeeld tijdens de tijd van terminale differentiatie en niet te vroeg of te laat. Overtollige cellulaire drukte, honger en ongepaste groei temperaturen zijn veelvoorkomende factoren die bijdragen aan irreproduceer bare waarnemingen. Bovendien is het tijdens het bouwen van de stam van cruciaal belang om te testen dat fluorescerende Tags niet interfereren met de functies van doel genen noch invloed hebben op de algehele celconditie. Het niet goed inspecteren van de fenotypes van stammen die fluorescerende markers dragen, kan leiden tot inconsistente en onvergelijkbare resultaten in vergelijkbare genotypes.
Hoewel Microscoop agarose pads eenvoudig te monteren zijn, kunnen ze ook een hindernis vormen bij het verkrijgen van waardevolle beeldvormings gegevens. Het maken van agarose pads is net zo eenvoudig als het plaatsen van drie Microscoop dia's parallel aan elkaar, doseren gesmolten agarose op de middelste dia, en het zetten van een dia die de top van de andere dia's transverzen. Het is echter nuttig om een Slide-Maker apparaat te monteren dat breedte wijzigingen mogelijk maakt om resistente, situatie-specifieke agarose pads te vervaardigen. Een eenvoudige Slide Maker die de flexibiliteit van de pad breedte geeft, bestaat uit een platform (pipettips houder of de Bank), twee Microscoop-dia's en labtape die fungeren als het pad-breedte aanpassingsmechanisme (Figuur 1a). Exacte dikte van de pad zal afhangen van de Imaging tijd vereisten, agarose merk, temperatuur, dekslip Sealant, verdampingssnelheid, enz. Daarom is het belangrijk om het imaging systeem te kalibreren vóór het verzamelen van gegevens om de technische reproduceerbaarheid te verhogen en de kwaliteit van Live-celbeeldvorming1,2,3te verbeteren. Pad oppervlak, stijfheid en samenstelling zijn essentieel tijdens langdurige beeld verwerving. Agarose heeft een lage achtergrond fluorescentie, kan gemakkelijk worden gegoten, en bij de juiste concentratie, bestand tegen structurele vervorming als gevolg van verdamping. Bovendien maakt het combineren van splijtings gist media met agarose geen afbreuk aan de beeldkwaliteit en zorgt voor uitgebreide observatie van meervoudige behandeling en meiosiscycli. Ook is het belangrijk om eventuele luchtbellen voor time-lapse microscopie te voorkomen. Binnen agarose pads en binnen het monster, luchtzakken uit te breiden na verloop van tijd, waardoor celverschuiving en het verstoren van de focal vliegtuigen. Mits de cellen efficiënt worden uitgespreid door de dekstrook rotatie, kunnen onderzoekers mitotische processen over verschillende generaties volgen en Meiotische gebeurtenissen van nucleaire fusie tot sporulatie. Het maken en kiezen van de juiste pad voor Imaging experimenten kost tijd om te beheersen, maar eenmaal bereikt, kan bijdragen aan zeer informatieve Microscoop observaties.
Zoals het geval is met andere methoden, is Live-cel microscopie niet vrij van technische beperkingen. Het gebruik van fluorescently-gelabelde eiwitten introduceert grenzen aan experimenten die de reikwijdte van wat kan worden bestudeerd beperken. Foto-bleaching en foto-toxiciteit zijn problemen die kenmerkend zijn voor langdurige beeld verwerving. Ze kunnen worden tegengedraaid door cellen te lang of te vaak niet bloot te stellen aan korte golflengten. Voor experimenten met GFP, CFP, yfp, mrfp en dsred, typische fluorescerende eiwitten die worden gebruikt in splijting gist Live-celbeeldvorming, is het gebruikelijk om 5-15% excitatie licht en 100-500 MS blootstellingstijd voor routine experimenten in dienst te nemen. Deze parameters veranderen echter, volgens de specifieke experiment eisen van de onderzoeker. Bovendien, z-stacks bestaat uit 9-13 secties met 0,5 μm afstand met behulp van een 60x doelstelling is genoeg om de dikte van een splijting gist cel op te lossen. Bovendien is het belangrijk om te bevestigen dat fluorescentie markers de juiste regulering of functie van doel eiwitten niet verstoren of valse fenotypes genereren. Daarom is het raadzaam om stammen te construeren die verschillende fluorescerende en affiniteits tags bevatten voor hetzelfde doel gen om waarnemingen met verschillende middelen te bevestigen. Bovendien is het de verantwoordelijkheid van onderzoekers om ervoor te zorgen dat experimentele parameters over experimenten kunnen worden gereproduceerd en dat de verzamelde gegevens geschikt zijn voor downstream-analyse1,3. Geen enkele technologie kan de beproefde praktijk van het nauwgezet valideren van experimentele systemen vervangen door een zorgvuldige observatie en een streng onderzoek van de lineariteit bij het opsporen van fluorescerende signalen.
Ten slotte is het cruciaal om microscopie gegevens te analyseren in indelingen die geen RAW-afbeeldingen wijzigen. Fiji biedt uitstekende documentatie hulpmiddelen om de metingen van onbewerkte gegevens bij te houden en stelt onderzoekers in staat om verschillende celparameters in één sessie te onderzoeken. Deze functies, evenals haar rijkdom aan online tutorials en uitgebreide literatuur dekking, maken Fiji een belangrijk hulpmiddel voor het meten, analyseren en presenteren van Live celbeeldvormings gegevens die de nucleaire dynamiek van splijtings gist in mitose en meiosis beschrijven.

Met Live-cel microscopie kunnen onderzoekers de nucleaire dynamiek onderzoeken zonder de gistcellen van splijting te doden en zijn er geen dodelijke fixeermiddelen en vlekken meer nodig. Het is mogelijk om de stabiliteit, beweging, lokalisatie en timing van fluorescently gelabelde eiwitten te observeren die betrokken zijn bij belangrijke gebeurtenissen zoals chromosoom replicatie, recombinatie en segregatie, naast het membraan en cytoskelet Bewegingen. Door het behoud van de levensvatbaarheid van de cel en niet-toxisch signaaldetectie, er is minimale fysiologische inbraak. Wanneer het goed wordt uitgevoerd, kan deze microscopie methode verstorende effecten die voortvloeien uit de uitgebreide technische behandeling of van valse chemische reactiviteit verminderen. Bovendien, tijdens een experiment, onderzoekers kunnen relevante waarnemingen van splijting gist voedings-en stress toestanden, proliferatieve efficiëntie, en apoptotic status die duiden op ongepaste imaging parameters of abnormale cel fysiologie maken1 ,2,3.
Mitose en meiose worden gekenmerkt door nucleaire en cellulaire divisie. In de meiose, in tegenstelling tot de mitose, wordt het genetische gehalte gehalveerd, aangezien de moeder cellen leiden tot dochtercellen4. Omdat Live-celbeeldvorming een temporele dimensie biedt naast de ruimtelijke relatie, kunnen grote aantallen cellen in real-time worden bekeken. Live-Cell microscopie heeft onderzoekers in staat om de dynamiek van nucleaire divisie te onderzoeken met behulp van fluorescerende Tags voor histonen5, cohesin subeenheden6, microtubuli7, centromeren8, kinetochoren9, componenten van de spil paal Body (SPB)10, en die van het chromosoom passagiers complex (CPC)11. Buiten het chromosoom scheidings apparaat heeft Live-celbeeldvorming ook het gedrag van eiwitten nodig, maar niet direct betrokken bij chromosoomsegregatie. De functie van deze eiwitten is aangetoond dat het invloed heeft op replicatie, chromosoom recombinatie, nucleaire beweging en chromosoom gehechtheid aan microtubuli12,13,14. Deze waarnemingen hebben bijgedragen tot een beter begrip van cellulaire gebeurtenissen waarvan de functionele componenten niet vatbaar waren voor biochemisch of genetisch onderzoek. Met nieuwe vooruitgang in microscopie-technologie zullen beperkingen zoals slechte resolutie, foto bleken, fototoxiciteit en focus stabiliteit afnemen, waardoor betere real-time waarnemingen van mitotische en Meiotische nucleaire dynamica 1 worden vergemakkelijkt, 2,3. Meiose is bijzonder uitdagend omdat het een terminaldifferentiatie traject is dat nauw aandacht moet schenken aan timing.
Het doel van dit protocol is om een relatief eenvoudige methode te presenteren voor het onderzoeken van real-time splijtstof gist kern dynamiek in mitose en meiosis. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om cellen te gebruiken die niet zijn blootgesteld aan milieubelasting, agarose-pads voorbereiden die langdurige beeldvorming kunnen weerstaan, en cellen monteren op dichtheden die de visualisatie van eencellige dynamiek vergemakkelijken. Bovendien maakt dit protocol gebruik van cellen die fluorescentioneel gelabelde eiwitten dragen die dienen als nuttige markers voor nucleaire kinetiek (Hht1-mRFP of Hht1-GFP), chromosoomsegregatie (Sad1-DsRed), cytoskelet dynamiek (Atb2-mRFP), transcriptionele activering in G1/S (Tos4-GFP) en cohesie stabiliteit in de meiose (Rec8-GFP). Deze methode introduceert ook extra nucleaire en cytosolische markers (tabel I) die kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties om vragen over specifieke cellulaire processen aan te pakken. Bovendien zijn basis Fiji-tools beschikbaar om onderzoekers te helpen Live-celbeelden te verwerken en verschillende soorten gegevens te analyseren. De kracht van deze aanpak vloeit voort uit het gebruik van real-time waarnemingen van eiwit dynamica, timing en stabiliteit om processen te beschrijven die integraal zijn voor de goede uitvoering van mitose en meiosis.

<table><tbody><tr><td>60x Plan Apochromat objectieflens</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer rotator</td><td>Stovall</td><td>US Patent #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H20,</td><td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve 3D software plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD camera</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasje</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot;5H20,</td><td>END</td><td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision deconvolutiefluorescentiemicroscoop</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffraction PSF 3D software plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh minimaal medium (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023;1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot;6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Heat plate</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolutiesoftware</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris deconvolutiesoftware</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iterative Deconvolve 3D software plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Malt extract (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Molybdic acid</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04</td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid,</td><td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenic acid</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pombe glutamate medium (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 beeldverwerkingssoftware</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulation Medium poeder</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuur gecontroleerde centrifuge</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract plus supplementen (YES)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot;7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en meiotische splijtstof gist door fluorescentie-live-cel microscopie

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-Cell Imaging is een microscopie techniek die wordt gebruikt om cel-en eiwit dynamica in levende cellen te onderzoeken. Deze beeldvormings methode is niet giftig, heeft over het algemeen geen invloed op de celfysiologie en vereist een minimale experimentele behandeling. De lage niveaus van technische interferentie stellen onderzoekers in staat om cellen te bestuderen over meerdere cycli van mitose en om de meiose van begin tot eind te observeren. Met behulp van fluorescerende Tags zoals groene fluorescerende eiwitten (GFP) en rood fluorescerende proteïne (RFP), kunnen onderzoekers verschillende factoren analyseren waarvan de functies belangrijk zijn voor processen zoals transcriptie, DNA-replicatie, cohesie en segregatie. In combinatie met data-analyse met behulp van Fiji (een gratis, geoptimaliseerde ImageJ-versie), biedt Live-Cell Imaging verschillende manieren om de eiwit beweging, lokalisatie, stabiliteit en timing te beoordelen, evenals nucleaire dynamiek en chromosoomsegregatie. Echter, zoals het geval is met andere microscopie methoden, wordt Live-celbeeldvorming beperkt door de intrinsieke eigenschappen van licht, die een limiet stellen aan het afwikkelings vermogen bij hoge vergroingen, en ook gevoelig zijn voor fotobleaching of fototoxiciteit bij hoge golflengte Frequenties. Met enige zorg kunnen onderzoekers deze fysieke beperkingen echter omzeilen door zorgvuldig de juiste omstandigheden, stammen en fluorescerende markers te kiezen om de juiste visualisatie van mitotische en Meiotische gebeurtenissen mogelijk te maken.

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live celmicroscopie stelt onderzoekers in staat om splijtingsgist nucleaire dynamiek in mitose en meiose in real time te bestuderen. De kracht van deze methode komt van het bestuderen van nucleaire processen in levende cellen onder normale fysiologische omstandigheden die de noodzaak van toxische fixatiemiddelen en vlekken elimineert. Deze techniek behandelt vragen met betrekking tot eiwittiming, stabiliteit en mobiliteit die mogelijk niet vatbaar zijn voor genetische of biomechanische manipulatie.Het is van cruciaal belang om veel aandacht te besteden aan de gezondheid en geschiktheid van splijting gistcellen voor beeldvorming. Onderzoek altijd morfologie en groeikenmerken om consistentie van de resultaten in verschillende experimenten te garanderen. Dit protocol toont de relatief eenvoudige manier om microscoopdia's voor te bereiden die, wanneer correct onder de knie worden, de consistentie en reproduceerbaarheid van langdurige live celbeeldvorming kunnen verbeteren.Om te beginnen pick-up cel materiaal van cryogene wake-up plaat, Streep het op JA platen, en uitbroeden ze op 25 graden Celsius of 32 graden Celsius, afhankelijk van de gist genotype wakker splijting gist stammen van cryogene behoud. Gebruik vervolgens een steriele lus om cellen te plukken uit individuele kolonies in de ontwaakte splijtingsgiststammen en inenting in reageerbuizen met drie milliliter YES vloeibaar medium. Plaats de buizen in een shaker op 150 tot 220 rpm om te groeien op 25 of 32 graden Celsius 's nachts tot laat-log fase met een gewenste optische dichtheid lezing van 0,7 tot 1,0.Breng 10 microliters van de cultuur over naar een microscoopdia. Leg een coverslip op en plaats het onder een microscoop om te controleren op een goede celmorfologie en voedingstoestand. Om het opzetten van een microscoop dia voor mitose of meiose analyse eerst twee gram agarose toe te voegen in de 500-milliliter fles met 100 milliliter van ofwel minimale medium plus supplementen voor mitose of vloeibare sporulating medium voor meiose.Verwarm de agarose oplossing in een magnetron op 60%vermogen in stappen van 10 seconden of plaats het bekerglas in een 55 graden Celsius waterbad gedurende 10 minuten. Draai de oplossing om efficiënt smelten te garanderen. Stel twee microscoopdia's op een pipettiphouder met de bovenste dia die op twee stapels labtape aan beide uiteinden rust als ondersteuning die een kruisvorm maakt.Pas de afstand tussen de twee dia's aan op meer dan twee millimeter om een dikke pad te vormen in de volgende stappen voor langdurige beeldvorming. Na het koelen van de gesmolten agarose gedurende een minuut bij kamertemperatuur, verwijder de bovenste schuif en gebruik een brede boring pipet tip om 50 tot 100 microliters af te geven op de onderste glijbaan om een plek te maken. Voordat de agarose afkoelt plaats de bovenste dia op de top om een spread pad van ongeveer een en 1/2 tot twee centimeter in diameter te genereren.Optimale live celbeeldvorming is essentieel voor volgende gegevensverwerkingsstappen. Zorg ervoor dat eventuele luchtballen in de gesmolten agarose te elimineren en maak een dunne pad voor beeldvorming periodes langer dan vier uur. Om mitotische gebeurtenissen te onderzoeken groeien cellen uit starter culturen in ofwel vloeibare EMM of PMG plus supplementen 's nachts.Breng een milliliter van de cultuur in een cuvette, en meten op de spectrofotometer op een golflengte van 595 nanometer. De celgroei wordt beschouwd als mid-log fase wanneer de optische dichtheid 0,4 bereikt. Dan centrifugeren een milliliter van de cel suspensie op 1, 375 keer g gedurende een minuut.Verwijder de supernatant en resuspend de cel pellet in minimale medium plus supplementen tot een uiteindelijk volume van 100 microliter. Om meiotische gebeurtenissen beeld groeien cellen uit starter culturen in minimale medium plus supplementen 's nachts. Celgroei wordt beschouwd als late-log fase wanneer de optische dichtheid op 595 nanometer is tussen 0,7 en een.Vervolgens, uit de late-log culturen te verkrijgen 500 microliter van elke mate type stam, H negatief en H positief, en combineren om een een milliliter cel suspensie te maken. Centrifugeren de cellen op 1, 375 keer g gedurende een minuut. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in een milliliter vloeibare maltose extract.Herhaal de maltose extract was nog drie keer om een efficiënte verwijdering van voedingsstoffen te garanderen. Na de laatste maltose extract wasbeurt resuspend de cellen in een milliliter maltose extract en breng het mengsel naar een 50-milliliter kolf met negen milliliter maltose extract. Incubeer gedurende 12 tot 16 uur bij 22 tot 25 graden Celsius bij een minimale rotatiesnelheid tussen 50 en 100 tpm.Het uiterlijk van vele ronde splijting gist klontjes als gevolg van overvloedige zelf-flocculatie duidt op efficiënte paring. Neem vervolgens een monster van één milliliter van de paringscultuur en centrifuge op 1, 375 keer g gedurende een minuut. Verwijder 750 microliter van de supernatant en resuspend de cellen in de resterende supernatant.Vortex krachtig gedurende vijf seconden om de klonten te verstoren. Geef 20 microliter van een mitotische of meiotische celsuspensie af op een agarosepad van 2%. Verwijder een overtollig medium door de glijbaan om te keren en twee tot drie seconden op de bovenkant van de pluisvrije papieren handdoek te leggen.Draai de glijbaan en plaats voorzichtig een glazen coverslip op de bovenkant van het pad, ervoor te zorgen geen luchtbellen te genereren. Om een celmonolaag te maken draai de coverslip met de wijsvinger voor één volledige draai voor mitosecellen of twee volledige draaien voor meiosecellen. Zorg ervoor dat de celmaterie zich verspreidt over het agarosepad, waardoor een betere scheiding van enkele cellen of asci mogelijk is.Met behulp van een kleine houten stok afzien gesmolten koolwaterstof kit langs de randen van de coverslip om elke agarose pad te verzegelen. Zodra de agarose pad is verzegeld plaats het op de microscoop stadium. Schakel de temperatuurkamer in en zet deze in op de gewenste temperatuur.Plaats een plaat met een natte papieren handdoek in de kamer om de vochtigheid van het microscoopsysteem te controleren. Laat het 10 tot 15 minuten equilibrate bij de juiste beeldvormingsomstandigheden. Hierdoor kunnen de resterende luchtbellen verdwijnen en eventuele last-minute agarose verschuivingen optreden.Gebruik de doelstelling 40X om de juiste weergavevelden naar afbeelding te zoeken. Schakel over naar de 60X-doelstelling om met gegevens te worden overgenomen. In de software die de microscoopfunctie regelt, kies je de microscoopfiltersets die het beste overeenkomen met de fluoroforen onder observatie.Pas de opwindingsgolflengten aan op de gebruikte fluorofoöres, gebruik het laagste excitatievermogen dat een consistent signaal produceert en gebruik blootstellingstijden van vier tot acht uur om aanvaardbare maar kwantificeerbare en reproduceerbare beeldvormingsgegevens te genereren. Verzamel minstens zes acquisitietijdpunten per uur. Selecteer in de beeldverzamelingssoftware ten minste één fluorescentiekanaal om gegevens te verkrijgen en gebruik te maken van een Z-voorraad bestaande uit 13 secties met een afstand van 0,5 micrometer.In de Fiji-software uploaden van een gedeconvolveerde afbeelding door het selecteren van de Bio-Formaten Importer functie onder de plug-ins menu. Selecteer in het pop-upvenster Opties importeren de optie Hyperstack, Standaardkleurmodus, schakel Automatisch schalen in en druk op de knop OK. Zorg ervoor dat het weergegeven venster het juiste aantal fluorescentiekanalen en tijdframes heeft door zijwaarts te scrollen op de respectievelijke balken aan de onderkant.Opslaan als een Tiff-bestand dat geen gegevens comprimeert. Gebruik vervolgens onder het menu Analyseren de optie Metingen instellen om verschillende parameters te kiezen. Bijvoorbeeld:Gebied, Min max grijswaarde, Geïntegreerde dichtheid, Gemiddelde grijze waarde, Mediaan, Stapelpositie, Omtrek en Weergavelabel.Selecteer Kleur en klik op het gereedschap Kanalen. Controleer in het pop-upvenster Kanalen het kleurkanaal voor welke intensiteit of gebied wordt gemeten. Selecteer Afbeelding en typ en klik op 32-bits.Kies de functies Aanpassen en Drempelwaarden onder het menu Afbeelding. Schakel het vak Donkere achtergrond in, schakel de standaardmethode in en kies Rood om de signalen van interesse te overlayen. Gebruik het toverstokgereedschap om elke interessestructuur te markeren en druk op de letter T op het toetsenbord om de geselecteerde ROI toe te voegen aan het pop-up ROI-beheervenster.Open vervolgens de roi-map met rits om de ROI-manager te laden en klik op elke ROI-id in het linkerzijpaneel. Selecteer Meten in het menu Analyseren en herhaal deze opdracht op elke ROI-id om de objecten van belang te kwantificeren in alle segmenten van de afbeeldingsstack. Sla de resultaten op als een CSV-bestand voor statistische analyse.In deze studie als cellen verhongeren als gevolg van beperking van voedingsstoffen of overgroei, zullen ze overtollige vacuoles en verminderde celgrootte vertonen. Logaritmische cellen tonen actieve DNA-replicatie en celdeling, evenals pan-nucleaire Tos4-GFP-expressie en Sad1-DsRed foci-scheiding. Niet paren, zoals het geval is wanneer cellen niet voldoende uitgehongerd van stikstof, zal voorkomen dat ze van het invoeren van meiose.Een paar splijtingscellen die karyogamie ondergaan worden getoond. Robuuste flocculatie van de paringscelsuspensie verhoogt de interactie tussen cel en cel en duidt dus op een succesvolle paring en efficiënte meiotische inductie. Zygotische asci neemt meerdere vormen aan, waaronder de zigzag- en bananencelvormen.In mitose als cellen overgang van metafase naar telophase, de eerste verandering impliceert een samentrekking van de nucleaire grootte in metafase, terwijl de tweede toont kern splitsen tijdens anafase. Naast het delen van een zekere segregatiedynamiek met mitotische cellen, vertonen meiotische cellen nucleaire oscillatie tijdens homologe recombinatie en verdere vermindering van nucleosiden aan het einde van de anaphase II.It is de verantwoordelijkheid van onderzoekers om ervoor te zorgen dat experimentparameters kunnen worden gereproduceerd in experimenten, en dat de verzamelde gegevens geschikt zijn voor downstream-analyse. Live cel beeldvorming heeft onderzoekers in staat gesteld om de mechanica van nucleaire divisie in mitose en meiose in de gaten te brengen.Als fluorescerende tags en microscoop mogelijkheden verbeteren van het aantal en het type processen die we kunnen waarnemen zal toenemen.

examination-mitotic-meiotic-fission-yeast-nuclear-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Hier beschrijven we een basic protocol om beeld en kwantificeren van de mitotische timing van levende zoogdieren weefselkweek cellen na siRNA transfectie.

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Leer live-cell microscopie voor het bestuderen van nucleaire dynamiek in splijtstofgist tijdens mitose en meiose. Deze methode maakt real-time observatie van eiwitgedrag mogelijk zonder toxische fixatie.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Meer video's verkennen