Kwantificering van atherosclerose bij muizen

Hart- en vaatziekten is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Muismodellen zijn nuttige hulpmiddelen voor het bestuderen van deze ziekte en ons protocol kan worden gebruikt om atherosclerose bij muizen te kwantificeren. Met behulp van dit protocol kan de grootte van de laesie worden gemeten op drie vasculaire locaties.

De aortawortel, de aortaboog en de brachiocephalic slagader. De kwantificering van atherosclerose bij muizen kan een vervelende taak zijn. We hebben gedetailleerde stappen gegeven waarvan we hopen dat ze het proces kunnen versnellen.

Sommige van deze stappen zijn moeilijk schriftelijk te beschrijven. We hopen dat deze video u zal helpen bij het verkrijgen van robuuste atherosclerotische laesiegrootteanalyse. Na het oogsten van een muis hart volgens de standaard protocollen, plaats het hart op een kurkbed, ventrale kant onder een ontleden microscoop en gebruik een naald om het hart vast te stellen aan de kurk door de top.

Houd de basis van het hart met anatomische tangen, gebruik een scalpel gehouden in een hoek van 20 graden caudally in het sagittale vlak, en 20 graden cranially in het transversale vlak, weg te snijden de apicale twee derde van het hart. Sluit de aortawortel en de basis van het hart in een optimale snijtemperatuur verbinding, of OCT, en knijp zachtjes het hart met de tangen om de aortawortel te vullen met verbinding en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Breng het monster naar de bodem van een cryomold gevuld met LGO met de aortawortel loodrecht op het onderste oppervlak en vries de verbinding op droogijs.

Bewaar vervolgens het weefselmonster in een diepvrieszak bij min 80 graden Celsius tot cryosectioning. Om een pinning bed voor en gezichtsanalyse voor te bereiden, vouw een segment van paraffinewasfilm acht keer om een vlak oppervlak van 25 bij 25 mm te maken en zwarte elektrische isolatietape rond de film te wikkelen om een donkere achtergrond voor de aorta te maken. Plaats een label op de achterkant van de pinning bed en gebruik een loden potlood om de muis identificatienummer op te nemen.

Breng de aortaboog naar de pinning bed en voeg een druppel PBS aan het weefsel. Met behulp van een stereomicroscoop reinigt u de aorta van het resterende periadventitial vetweefsel en gebruikt u Vannas-scharenschaar en Dumont om alle omringende vetweefsel voorzichtig weg te pellen zonder de aorta te manipuleren of te beschadigen. Introduceer vervolgens de Schaar Vannas in het aortalumen om het intimale oppervlak bloot te leggen.

Begin met het snijden van de buitenste kromming van de opgaande boog in de distale richting, en blijf de takken opensnijden, inclusief de brachiocephalische slagader en spaar het dorsale deel van het dalende thoracale gebied. Om het intimale oppervlak weer te geven, opengesneden de mindere kromming en vouw de aorta open. Met behulp van een micro Castroviejo naaldhouder, zet de open boog aan de pinning bed met het stompe uiteinde van minuten insect pinnen zonder het uitrekken van het monster, voorzichtig buigen van de pinnen uit de buurt van het monster als het weefsel wordt gehouden op zijn plaats.

Bewaar vervolgens de vastgemaakte boog met het gezicht naar beneden in een petrischaaltje PBS op vier graden Celsius. Voor Sudan IV kleuring, spoel het monster gedurende vijf minuten in een petrischaaltje van 70%-ethanol met de boog naar beneden, voordat u het exemplaar gedurende zeven minuten overzet naar een schotel van Sudan IV werkoplossing. Aan het einde van de incubatie spoelt u het monster met twee wasbeurten van drie minuten in 80% ethanol om het normale intimale oppervlak te ontvlekken, gevolgd door een laatste spoeling in PBS voordat het weefsel terugkeert naar de oorspronkelijke petrischaal.

Dan verwerven micrografen onder een stereo microscoop aangesloten op een digitale camera op een 10X vergroting, het verkrijgen van beelden van de gespelde boog ondergedompeld in PBS, met behulp van kleine metalen gewichten aan de pinning bed te houden aan de onderkant van de petrischaal. Om cryosections van de ingebedde aortawortel te verkrijgen, stelt u de cryostattemperatuur op min 20 graden Celsius en de sectiedikte op 10 micrometer. Monteer het OCT-blok met de aortawortel op de monsterhouder met het ventriculaire weefsel naar buiten gericht.

Beveilig de positionering met een aantal extra OCT indien nodig. De aortawortel moet nu loodrecht op het mes worden geplaatst. Verzamel de eerste controlesecties met hartspierweefsel op gewone microscoopdia's en controleer de progressie door het weefsel om de 200 micrometer onder een lichtmicroscoop.

Wanneer de eerste aorta cusp verschijnt, kantel het monster naar het punt nul cusp om de sectie vlak uit te lijnen met de twee andere cusps en tellen elke 10 micrometer sectie die wordt gesneden vanaf punt nul verder. Begin met het verzamelen van secties voor analyse vanaf 90 micrometer en verder volgens de geplande dia, tot 800 micrometer van punt nul is bereikt. Het berekenen van de laesiefractie van het totale vatgebied van de aortawortel maakt de gegevens minder gevoelig voor mogelijke hoekverschillen tijdens het sectioneren.

Bovendien kan het illustratief zijn om het gebied onder de curve of de atherotolaesiegrootte per muis te berekenen en de gegevens in een stipplot te presenteren om individuele variaties binnen groepen verder te visualiseren. Lesional lipide accumulatie kan worden gekwantificeerd door kleur thresholding olie rode O positieve gebieden van de totale laesie gebied. De rechter en linker kransslagaders meestal afwijken van de aorta ongeveer 250 micrometer van de aorta sinus die vaak samenvalt met de meest prominente laesie maten.

Het verwijderen van de donkere achtergrond in representatieve afbeeldingen van de aortabogen van het gezicht kan het visuele display verbeteren. De laesiegrootte wordt meestal meestal verdeeld binnen groepen, waardoor statistische analyse met behulp van student t-test tussen groepen. We raden aan om met wat testmateriaal te oefenen totdat je voldoende vaardigheden hebt verkregen voor het verwerken van je experimentele monsters.

Als de laesiegrootte tussen groepen verschilt, moet u het mechanisme bepalen, omdat een laesiesamenstellingsanalyse meestal de volgende stap is om na te streven.