Name: In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor het maken van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire vesikels met behulp van filmrehydratatie van glazen parels. Deze techniek maakt de opname van gevoelige biologische monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen financiële steun via de DFG TRR 235 (opkomst van Life, project P15), de Europese Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst nr. 694410 AEDNA) en de TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (project nr. 9,05) . Wij danken E. Falgenhauer voor haar hulp met monstervoorbereiding. We bedanken A. Dupin en M. Schwarz-Schilling voor hun hulp bij het TX-TL-systeem en nuttige discussies. Wij danken N. B. Holland voor nuttige discussies.

1. expressie van Elastin-achtige polypeptiden
<ol><li>Dag 1: voorbereiding van een starter cultuur en benodigdheden voor Peptide expressie
	<ol>
<li>Bereiding en autoclaaf expressie kweek kolven (4 x 2,5 L) en 3 L LB medium. Voeg voor 1 L LB medium 25 g LB poeder toe aan 1 L ultrazuiver water.</li>
		<li>Bereid een starter cultuur met 100 mL LB medium, 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) chlooramfenicol oplossing (25 mg/mL in EtOH), en 50 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin oplossing (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrapuur water).</li>
		<li>Voeg een kleine streep uit een vooraf gemaakte bacteriële kolf met E. coli stam BL21 (DE3) plyss met de pET20b (+) expressie vector codering van de polypeptide sequentie MGHGVGVP ((gegvp) 4(gvgvp))4((gfgvp)4(gvgvp))3 (Gfgvp)4GWP (afgekort als EF) naar een pre-warmed 100 ml starter cultuur en incuberen bij 37 °c gedurende 16 uur met 250 rpm in een schud incubator (E. coli stammen en vectoren zijn beschikbaar op aanvraag).</li>
		<li>Verwarm de Expression Culture-kolven en de LB-media bij 37 °C 's nachts, zodat ze voorbereid zijn op de volgende dag.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 2: eiwit expressie
	<ol>
<li>Voeg 750 mL LB medium toe aan elke expressie kweek kolf, 375 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) chlooramfenicol voorraad (25 mg/mL in EtOH), en 375 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin voorraad (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrapuur water).</li>
		<li>Neem na het schudden de antibiotica te verdelen 2 mL van de media als referentiemonster voor de optische dichtheidsmeting bij 600 nm (OD600).</li>
		<li>Voeg 7,5 mL van de start cultuur toe aan de uitdrukkings kolf en incuberen gedurende 1 uur bij 37 °C met 250 rpm.</li>
		<li>Na deze stap wordt elke 20 minuten de OD600 van elke kolf gecontroleerd.</li>
		<li>Wanneer de optische dichtheid ongeveer 0,8 bereikt, verlaagt u de temperatuur tot 16 °C en induceert u peptide expressie door 750 μL van 1 M steriele-gefilterde β-isopropylthiogalactoside (IPTG) in ultrapuur water in elke uitdrukkings kolf te voegen.</li>
		<li>Inbroed de uitdrukkings kolf met de geïnduceerde bacteriën bij 16 °C gedurende 16 uur met 250 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Dag 3: extractie van de uitgesproken polypeptide
	<ol>
<li>Weeg de Centrifugeer kolf vooraf af om de massa van de celpellet na het oogsten te kunnen bepalen.</li>
		<li>Oogst alle bacteriën uit de uitdrukkings kolven door centrifugeren gedurende 20 minuten met een voorgekoelde centrifuge bij 4.000 x g en 4 °c.</li>
		<li>Giet het supernatant uit en DEP de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.</li>
		<li>Weeg de Centrifugeer kolven af en bereken de celpellet massa.</li>
		<li>Respendeer de cellen, die zijn gepelleteerd uit 750 mL oorspronkelijke celkweek, in 15 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) door pipetteren en centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Giet het supernatant uit en DEP de centrifuge flessen op een steriele papieren handdoek.</li>
		<li>Respendeer de celpellet voor de lysisstap in 2 ml buffer per 1 gram celpellet met PBS (pH 7,4) aangevuld met lysozym (1 mg/ml), 1 mm fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1 mm benzamidine en 0,5 U van DNase I.</li>
		<li>Soniceren de cellen voor verdere lysis op ijs met een sonicator op 8 W gedurende 9 minuten met afwisselend 10 s sonicatie en 20 s onderbroken stappen, gevolgd door een pauze van 9 minuten waarbij het monster op ijs moet worden gekoeld. Herhaal de 9 min ultrasoonapparaatstap nogmaals.</li>
		<li>Voeg 2 mL 10% (w/v) polyethyleenmine (PEI) toe per 1 L van de oorspronkelijke celcultuur voor de neerslag van nucleïnezuur.</li>
		<li>Verdeel het monster in 2 mL centrifugebuizen en incubeer gedurende 10 minuten bij 60 °C, gevolgd door een incubatie gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Centrifugeer de oplossing bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en verzamel het supernatant dat de Elp bevat.</li>
	</ol></li>
	<li>Eiwit zuivering via inverse temperatuur fietsen:
	<ol>
<li>Pas de supernatant aan op een pH van 2 om het hydrofiele deel van de peptide te schakelen naar hydrofoob en aggregatie te induceren. Om de pH aan te passen, worden fosforzuur en natriumhydroxide gebruikt. pH-strepen volstaan om de pH-graad te bepalen.</li>
		<li>Om de opbrengst van de zuivering van het monster te verbeteren, verwarm het monster tot 60 °C en voeg natriumchloride toe tot 2 M.</li>
		<li>Vervolgens Centrifugeer het monster op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en los de pellet opnieuw op in PBS (maar slechts de helft van het aanvankelijke volume wordt gebruikt in vergelijking met de vorige stap).</li>
		<li>Breng de pH op 7 met fosforzuur en natriumhydroxide. pH-strepen zijn voldoende nauwkeurig om de pH te bepalen.</li>
		<li>Centrifugeer het monster vervolgens op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Verzamel de supernatant en herhaal stappen 1.4.1 – 1.4.6 tot 3x totaal, behalve dat in de laatste herhaling van stap 1.4.4, alleen water wordt toegevoegd in plaats van PBS.</li>
		<li>Meet de concentratie van de peptiden met een absorptie spectrometer. Gebruik een extinctiecoëfficiënt van 5500/M/cm bij 280 nm.</li>
		<li>Stel de concentratie van de ELP in op 700 μM.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vesicle productie met behulp van de glas kralen methode
<ol><li>Concentreer de ELP-oplossing op 1,1 mM met een centrifugale vacuümconcentrator.</li>
	<li>Meng 200 μL van de geconcentreerde ELP-oplossing met 1.250 μL van een 2:1 chloroform/methanol mengsel, gevolgd door vortexing.</li>
	<li>Voeg 1,5 g bolvormige glas parels (212 – 300 μm in grootte) toe aan een ronde bodem kolf van 10 mL.</li>
	<li>Voeg de oplossing met ELP en het chloroform/methanol mengsel toe aan de ronde bodem kolf en meng door zacht schudden.</li>
	<li>Sluit de kolf aan op een roterende verdamper. Stel de snelheid in op 150 rpm en regel de druk tot-0,2 x 105 PA (-200 mbar) gedurende ongeveer 4 minuten totdat de vloeistof bij kamertemperatuur is verdampt.</li>
	<li>Plaats de ronde bodem kolf gedurende ten minste 1 uur in een exsiccator om ervoor te zorgen dat de resterende chloroform en methanol worden verdampt. Om verlies van de glas kralen te voorkomen, moet losjes bevestigde aluminiumfolie worden gewikkeld rond de opening van de ronde bodem kolf.</li>
	<li>Meng voor een enkel experiment 100 mg van de met peptide bedekte glas parels met 60 μL van de zwellingen oplossing, zoals PBS. Inincuberen dit monster bij 25 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Centrifugeer het monster snel met een tafel-top centrifuge om de glas kralen te sediment.</li>
	<li>Gebruik een pipet om het supernatant te verzamelen dat de blaasjes bevat.</li>
</ol>3. transcriptie van RNA Aptamer dBroccoli in de blaasjes
<ol><li>Reinig de labbank met doekjes met een decontaminatieoplossing van RNase om een RNase-vrije werkomgeving te creëren.</li>
	<li>Meng de ssDNA (5 μM), bestaande uit de T7 promotor en de dBroccoli sequentie (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), naast de niet-Codeer bare streng (5 μM) in Nuclease-vrij water, aangevuld met RNAPol-reactiebuffer [40 mm tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm dithiotreïtol (DTT) en 2 mm spermidine], om de DNA-template voor de transcriptie reactie voor te bereiden.</li>
	<li>Inbroed de oplossing gedurende 5 minuten bij 90 °C, gevolgd door een langzame temperatuurverlaging tot 20 °C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Bereid een 1 mM (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-hydroxybenzylideen)-2, 3-dimethyl-3, 5-dihydro-4H-imidazol-4-One (DFHBI) oplossing door het oplossen van 1,26 mg DFHBI in 5 mL DMSO.</li>
	<li>Bereid de transcriptie reactie voor door de RNAPol-reactiebuffer te mengen [40 mm tris-HCl (pH = 7,9), 6 mm MgCl2, 1 mm dithiotreïtol (DTT) en 2 mm spermidine] met 125 mm KCl, 15 mm MgCl2, 4 mm rntp, 10 μM dfhbi, 200 nm DNA-template, 0,5 U/μL RNase remmer van Murine en water.</li>
	<li>Voeg, vlak voordat de reactie begint, 4 U/μL T7 polymerase toe.</li>
	<li>Gebruik deze reactiemix als de zwellingen oplossing in stap 2,7 en inbroed bij 37 °C gedurende de duur van het experiment, meestal 1 uur.</li>
</ol>4. transcriptie-translatie (TX-TL) reactie
Opmerking: Voor de transcriptie-Vertaal reactie is een ruw celextract nodig, evenals een reactiebuffer en DNA. Het ruwe celextract wordt bereid zoals beschreven in zon et al.18. Voor een TX-TL-reactie gebruikt u het volgende: 33% (v/v) van het ruwe E. coli -extract, 42% (v/v)-reactiebuffer en 25% (v/v) fenol-chloroform gezuiverd DNA plus additieven. De uiteindelijke concentraties zijn ongeveer 9 mg/ml eiwit, 50 mm HEPES (pH = 8), 1,5 mm ATP, 1,5 mm GTP, 0,9 mm CtP, 0,9 mm UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mm co-enzym A, 0,33 mm nad, 0,75 mm kamp, 68 mm folinezuur acid, 1 mm spermidinerijk , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM maltose, 1 U T7 RNA polymerase en 50 nM plasmide DNA in ultrapuur water.
<ol><li>
Fenol-chloroform zuivering van de DNA-template
	<ol>
<li>Bereid zes nachtelijke culturen met 5 mL LB medium en 5 μL steriel-gefilterd (0,22 μm filter) carbenicillin oplossing (100 mg/mL in 50% EtOH en 50% ultrazuiver water).</li>
		<li>Voeg een kleine streep toe van een vooraf gemaakte bacterie kolf met DH5α E. coli met de pET20b (+) expressie vector aan elke voorverwarmde 5 ml nachtelijke kweek en inincubate bij 37 °c gedurende 16 uur met 250 rpm. Afhankelijk van welke peptide (EF) of eiwit (YPet of mVenus) moet worden uitgedrukt, wordt een specifieke codering plasmide gebruikt.</li>
		<li>Extraheer het plasmide met een mini-prep Kit zoals beschreven in de gebruikershandleiding of door het protocol te volgen dat wordt geleverd door Zhang et al.24.</li>
		<li>Bereid 100 μL van het voorgezuiverde plasmide DNA (concentratie kan variëren van 200 – 600 ng/μL) en meng met 100 μL Roti-fenol/chloroform/Isoamylalcohol (pH = 7,5 – 8,0) in een micro centrifugebuis om een betere fasescheiding mogelijk te maken.</li>
		<li>Keer de buis voorzichtig om tot 6x en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij RT.</li>
		<li>Voeg 200 μL chloroform toe aan de bovenste fase van de buis en keer de buis om tot 6x.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij RT.</li>
		<li>Pipet de supernatant naar een aparte buis en voeg 10 μL van 3 M Natriumacetaat toe voor de neerslag van ethanol.</li>
		<li>Voeg 1 mL van-80 °C koude ethanol toe en bewaar het monster bij-80 °C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 16.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Decanterende het supernatant en voeg 1 mL-20 °C koude 70% (v/v) ethanol toe.</li>
		<li>Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.</li>
		<li>Verwijder de vloeistof door pipetten. Wees voorzichtig om de DNA-pellet niet te storen.</li>
		<li>Bewaar het monster op RT gedurende ongeveer 15 minuten om de resterende ethanol te verdampen.</li>
		<li>Voeg ultrapuur water toe aan het monster om de monsterconcentratie aan te passen tot ongeveer 300 nM, dat wordt gemeten door absorptie bij 260 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de TX-TL-reactie
	<ol>
<li>Het bereide ruwe celextract en de reactiebuffer op ijs ontdooien.</li>
		<li>Voeg voor een reactiemengsel van 60 μL het plasmide DNA (fenol-chloroform gezuiverde) toe aan 37,5 μL van de reactiebuffer [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM co-enzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM kamp, 68 mM folinezuur, 1 mM spermidine, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 en 13,3 mM maltose), gevolgd door de toevoeging van 28,7 μL ruw celextract. Vul aan tot een eindvolume met ultrapuur water tot 58,8 μL.</li>
		<li>Voeg, vlak voordat de reactie begint, 1,2 μL van de T7 RNA polymerase oplossing toe en meng het monster door Pipetteer op en neer.</li>
		<li>Gebruik deze reactiemix als een zwellingen oplossing in stap 2,7 en inbroed bij 29 °C gedurende de duur van het experiment, meestal 4 – 8 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. conjugatie van Elastin-achtige polypeptiden met Fluoroforen via koper gekatalyseerde azide-alkyne Huisgen cycloadditie
<ol><li>Bereid een 20 mM NHS-azide linker (γ-azidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester) oplossing in DMSO.</li>
	<li>Meng 250 μL van de ELP-oplossing (600 μM) met PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L na2HPO4, 0,27 g/l K2hpo4, pH = 7,2) en NHS-azide (1,2 mm) en incuberen gedurende 12 uur bij RT.</li>
	<li>Laad het monster in een 10 kDa dialyse cassette en bewaar het bij 4 °C gedurende 12 uur in 1 L ultrapuur water om de zouten en de residuele NHS-azide te verwijderen.</li>
	<li>Meng de geactiveerde ELP (500 μM) met de alkyne-geconjugeerde kleurstof (500 μM), Cy5-alkyne of Cy3-alkyne.</li>
	<li>Meng dit monster met 1 mM TBTA (tris (benzyltriazolylmethyl) amine), 10 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl)-Fosfine hydrochloride) en 10 mM CuSO4 en incuberen bij 4 °c gedurende 12 uur.</li>
	<li>Laad het monster in een 10 kDa dialyse cassette en bewaar het bij 4 °C gedurende 12 uur in 1 L ultrapuur water, om de zouten en de residuele alkyne-geconjugeerde kleurstoffen te verwijderen.</li>
	<li>Deze kleurstof gemodificeerde Elp's worden gebruikt in een 1:1 mengsel van de Cy3 gelabeld ELPs en de Cy5 gelabeld Elp's analoog aan de peptiden in deel twee.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).</li>
<li>Hardy, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproducing+catalyst+drives+repeated+phospholipid+synthesis+and+membrane+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).</li>
<li>Scott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Phospholipid+Biosynthesis+by+Gene-Encoded+Enzymes+Reconstituted+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes.</a> PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).</li>
<li>Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+macromolecules+by+lipid+vesicles+under+simulated+prebiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions.</a> Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).</li>
<li>Adamala, K., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+Template-Directed+RNA+Synthesis+Inside+Model+Protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells.</a> Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).</li>
<li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+growth+and+division+of+model+protocell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coupled growth and division of model protocell membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).</li>
<li>Kurihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-reproduction+of+supramolecular+giant+vesicles+combined+with+the+amplification+of+encapsulated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA.</a> Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).</li>
<li>Chu, H. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+an+elastin-like+polypeptide+%28ELP%29+in+a+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system.</a> Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).</li>
<li>Martino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Expression%2C+Aggregation%2C+and+Triggered+Release+from+Polymersomes+as+Artificial+Cell-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+purification+by+reversible+phase+transition+following+Escherichia+coli+expression+of+genes+encoding+up+to+251+repeats+of+the+elastomeric+pentapeptide+GVGVP%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP.</a> Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+chemistry+of+biological+free+energy+transduction+as+demonstrated+by+elastic+protein-based+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+communication+between+bacteria+and+cell-free+gene+expression+systems+within+linear+chains+of+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets.</a> Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).</li>
<li>Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+All+E.+coli+TX-TL+Toolbox+2.0%3A+A+Platform+for+Cell-Free+Synthetic+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).</li>
<li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+polymersomes%3A+a+comparative+review+towards+cell+mimicking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li>
<li>Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broccoli%3A+Rapid+Selection+of+an+RNA+Mimic+of+Green+Fluorescent+Protein+by+Fluorescence-Based+Selection+and+Directed+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+Plasmid+DNA+from+Bacterial+Colonies+Using+the+Qiagen+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Film rehydratie is een veelgebruikte procedure voor het maken van kleine unilamellaire blaasjes. De belangrijkste bron van falen is de verkeerde omgang met de materialen die in de procedure worden gebruikt.

In eerste instantie worden de Elp's geproduceerd door E. coli cellen. De opbrengst na de zuivering van de ELP kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van hoe zorgvuldig het protocol wordt uitgevoerd tijdens de crucia...

De creatie van synthetische levende cellulaire systemen wordt meestal benaderd vanuit twee verschillende richtingen. In de top-down methode wordt het genoom van een bacterie gereduceerd tot de essentiële componenten, wat uiteindelijk leidt tot een minimale cel. In de bottom-up benadering, worden kunstmatige cellen geassembleerd de Novo van moleculaire componenten of cellulaire subsystemen, die functioneel moeten worden geïntegreerd in een consistente cel-achtige systeem.
In de de Novo aanpak wordt de compartimenlise ring van de noodzakelijke biochemische componenten meestal bereikt met behulp van membranen gemaakt van fosfolipiden of vetzuren1,2,3,4. Dit komt omdat "moderne" celmembranen voornamelijk bestaan uit fosfolipiden, terwijl vetzuren worden beschouwd als plausibele kandidaten van prebiotische membraanbehuizingen5,6. Voor de vorming van nieuwe membranen of om membraan groei te vergemakkelijken, moeten amfifiele bouwstenen worden geleverd vanaf de buitenkant7 of idealiter door productie binnen een membraneus compartiment met behulp van de overeenkomstige anabole processen4 ,8.
Hoewel lipide-synthese een relatief complex metabolisch proces is, kunnen peptiden vrij gemakkelijk worden geproduceerd met behulp van celvrije genexpressie-reacties9,10. Vandaar, peptide membranen gevormd door amfifiele peptiden vertegenwoordigen een interessant alternatief voor lipide membranen als Behuizingen voor kunstmatige cel nabootst die in staat zijn om te groeien11.
Amfifiele elastïne-achtige di-Block copolymeren (Elp's) zijn een aantrekkelijke klasse van peptiden, die als bouwsteen voor dergelijke membranen12kunnen dienen. Het basis aminozuursequentie motief van ELPs is (gagvp)n, waarbij "a" elk aminozuur kan zijn behalve Proline en "n" het aantal motief herhalingen13,14,15,16,17 . Elp's zijn gemaakt met een hydrofoob blok met voornamelijk fenylalanine voor a en een hydrofiel blok, voornamelijk samengesteld uit glutaminezuur11. Afhankelijk van een parameter en oplossings parameters, zoals pH en zoutconcentratie, vertonen Elp's een zogenaamde inverse temperatuur overgang bij temperatuur Tt, waarbij de peptiden een volledig omkeerbare faseovergang ondergaan van een hydrofiele naar hydrofobe Staat. De synthese van de peptiden kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in blaasjes met behulp van de "TX-TL" bacteriële cel extract11,18,19,20,21, die biedt alle benodigde componenten voor gekoppelde transcriptie-en vertaal reacties.
Het TX-TL-systeem werd samen ingekapseld, met de DNA-sjabloon die de Elp's codeert in ELP-blaasjes met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas parels als een solide ondersteuning. De vorming van blaasjes gebeurt door rehydratatie van de gedroogde peptiden van het kraal oppervlak11. Andere methoden22 voor de vorming van blaasje kunnen worden gebruikt, die mogelijk een lagere polydispersiteit en grotere blaasje grootten vertonen (bijv. elektro vorming, emulsie faseoverdracht of microfluidics-gebaseerde methoden). Om de levensvatbaarheid van de inkapings methode te testen, kan een transcriptie van de fluorogene aptamer dBroccoli23 ook worden gebruikt11, wat minder complex is dan GENEXPRESSIE met het TX-TL-systeem.
Door de expressie van de membraan bouwstenen in vesiculo en hun daaropvolgende opname in het membraan, beginnen de blaasjes11te groeien. Membraan opname van de Elp's kan worden aangetoond door middel van een FRET assay. Daartoe worden de elp's die worden gebruikt voor de vorming van de initiële blaasje populatie geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen in gelijke delen die een fret paar vormen. Na expressie van niet-gelabelde Elp's in vesiculo en hun opname in het membraan, worden de gelabelde Elp's in het membraan verdund en bijgevolg daalt het FRET-signaal11. Als een veelzijdige en gemeenschappelijke methode voor conjugatie, koper gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie wordt gebruikt. Met het gebruik van een stabiliserende ligand zoals tris (benzyltriazolylmethyl)-amine, kan de reactie worden uitgevoerd in een waterige oplossing met een fysiologische pH zonder de hydrolyse van reactanten11, die geschikt is voor conjugatie reacties waarbij peptiden betrokken zijn.
Het volgende protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding op het kweken van peptidosomes op basis van ELP. De uitdrukking van de peptiden en vesikel vorming met behulp van de glas kralen methode wordt beschreven. Bovendien wordt beschreven hoe u de transcriptie van de fluor Gene dBroccoli aptamer en de transcriptie-Vertaal reactie voor eiwit expressie in de ELP-blaasjes implementeert. Tot slot is er een procedure voor de conjugatie van Elp's met fluoroforen, die kan worden gebruikt om de groei van de vesikel te bewijzen door middel van een FRET assay11.

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>alkine-conjugated Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>alkine-conjugated Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, acid-washed</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-isopropyl thiogalactoside )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-azide linker (y-azidobutyric acid oxysuccinimide ester)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>pH stripes</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleneimine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>RNAPol reaction buffer</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor murine</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Wipes</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Sterile-filtered (0.22 &micro;m filter)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

in vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome vesicle groei

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartimenalisatie van biochemische reacties is een centraal aspect van synthetische cellen. Voor dit doel, peptide-gebaseerde reactie compartimenten dienen als een aantrekkelijk alternatief voor liposomen of vetzuur gebaseerde vesicles. Uitwendig of binnen de blaasjes kunnen peptiden gemakkelijk worden uitgedrukt en de synthese van membraan precursoren vereenvoudigen. Hier is een protocol voor het maken van blaasjes met diameters van ~ 200 nm gebaseerd op de amfifiele elastïne-achtige polypeptiden (ELP) met behulp van uitdroging-rehydratatie van glas kralen. Ook zijn de protocollen voor bacteriële ELP expressie en zuivering via inverse temperatuur fietsen, evenals hun covalente functionalisatie met fluorescerende kleurstoffen. Bovendien beschrijft dit verslag een protocol om de transcriptie van RNA aptamer dBroccoli in ELP-blaasjes als een minder complex voorbeeld voor een biochemische reactie mogelijk te maken. Ten slotte wordt een protocol verstrekt, dat toelaat in vesiculo expressie van fluorescerende eiwitten en het membraan peptide, terwijl de synthese van de laatste resulteert in vesikel groei.

Vesicle productie Figuur 1 toont transmissie elektronenmicroscopie (TEM)-beelden van blaasjes, bereid met verschillende zwelling oplossingen en de glas kralen methode (Zie ook vogele et al.11). Voor het monster in Figuur 1awerd alleen PBS gebruikt als zwelling oplossing om de vorming van blaasjes te bewijzen en om hun grootte te bepalen. Toen TX-TL werd gebruikt als zwelling oplossing (Figuur 1b</s...

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor de creatie van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire blaasjes in staat van groei. Om de vesiculo productie van het membraan peptide te vergemakkelijken, zijn deze blaasjes uitgerust met een transcriptie-vertaalsysteem en de peptide-encoding plasmide.

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

In ons protocol gebruiken we filmrehydratatie van kleine glazen kralen om reactiecompartimenten te vormen die zijn gemaakt van peptiden. In experimenten profiteren we van de eenvoud en robuustheid van het protocol. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om zelfs gevoelige monsters op te nemen, zoals het gebruikte ruwe celextract.Contact met organische oplosmiddelen zal het monster aanzienlijk beïnvloeden. Gebruik om deze procedure te starten met een centrifugaalvacuümconcentrator om de ELP-oplossing te concentreren op 1,1 millimolar. Meng 200 microliter van deze geconcentreerde oplossing met 1,250 microliter van een twee-op-een chloroform en methanolmengsel.Vortex de oplossing om grondig te mengen. Voeg vervolgens 1,5 gram bolvormige glazen kralen toe aan een tien milliliter ronde bodemkolf. Voeg de ELP en chloroforme methanoloplossing toe aan de ronde bodemkolf en schud voorzichtig om te mengen.Sluit de kolf aan op een roterende verdamper. Pas de snelheid aan op 150 RPM en regel de druk ongeveer vier minuten op 20.000 pascalen, totdat de vloeistof bij kamertemperatuur verdampt is. Het is belangrijk om voorzichtig te zijn bij het gebruik van de roterende verdamper als gevolg van mogelijke kokende retardatie.Daarna wikkel je aluminiumfolie losjes rond de opening van de ronde bodemkolf om het verlies van glazen kralen te voorkomen en plaats je de kolf minstens een uur in een desiccator, om ervoor te zorgen dat de resterende chloroforme en methanol worden verdampt. Voor een enkel experiment, meng 100 milligram van het peptide bedekte glazen kralen met 60 microliter van een zwelling oplossing. Broed dit monster vijf minuten lang uit op 25 graden Celsius.Gebruik een tafelblad centrifuge om de monsters snel te centrifugeren en sediment de glazen kralen. Gebruik vervolgens een pipet om de supernatant te verzamelen, die de akeltjes bevat. Meng eerst 100 microliter van het vooraf gezuiverde plasmide-DNA met 100 microliter van roti-fenol, chloroform of isoamylalcohol in een microcentrifugebuis om een betere fasescheiding mogelijk te maken.Draai de buis voorzichtig tot zes keer om en centrifuge op 16.000 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe aan de bovenste fase en keer de buis tot zes keer om. Centrifugeren het monster op 16.000 keer g en kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Pipet hierna de supernatant aan een aparte buis en voeg 10 microliter van drie molaire natriumacetaat toe voor ethanolneerslag. Voeg een milliliter koude ethanol toe bij 80 graden Celsius en bewaar het monster een uur lang op 80 graden Celsius. Vervolgens centrifugeren het monster op 16,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Decanteer de supernatant en voeg een milliliter koude 70% ethanol toe bij 20 graden Celsius. Centrifuge op 16.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de vloeistof door pipetten, voorzichtig te zijn om de DNA-pellet niet te verstoren.Bewaar het monster ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur om de resterende ethanol te verdampen. Voeg hierna ultra zuiver water toe aan het monster om de monsterconcentratie aan te passen aan ongeveer 300 nanomolar, die wordt gemeten door absorptie op 260 nanometer. Om de transcriptie-vertaling reactie voor te bereiden, volg de voorbereide ruwe celextractie en de reactiebuffer op ijs.Voor een 60 microliter reactie mix, voeg het plasma-DNA tot 37,5 microliter van de reactiebuffer, voeg 28,7 microliter ruw celextract toe en vul met ultra zuiver water tot een eindvolume van 58,8 microliter. Vlak voordat de reactie begint, voeg 1,2 microliter van de T7RNA polymerase oplossing, en pipet op en neer te mengen. Incubeer het monster en een zwellingsoplossing bij 29 graden Celsius voor de duur van het experiment, dat meestal vier tot acht uur is.Transmissie elektronenmicroscopie beelden van akeltjes tonen aan dat verschillende zwelling oplossingen, zoals TX / TL of zelfs alleen PBS kan worden gebruikt om vesicles te vormen. Voor beide oplossingen is groottebepaling een stap voorwaarts. Dynamische lichtverstrooiing toont aan dat vesicles bereid zonder de glazen kralen methode resulteren in een diameter van 134 nanometer, met een polydispersiteit van 25%Wanneer glazen kralen worden gebruikt, resulteert de diameter in 168 nanometer, met een polydispersiteit van 21%De fluorescentieintensiteit van twee fluorescerende eiwitten, die worden uitgedrukt in de ELP-fluitjes, worden vervolgens gemeten met behulp van een fluorescentieplaatlezer.Het is belangrijk op te merken dat na de vorming van blaasjes, de inhoud van de blaasjes en de buitenste oplossing hetzelfde zijn, dus het antibioticum Kanamycine wordt toegevoegd aan de buitenoplossing om eiwitexpressie te onderdrukken. Als controle wordt Kanamycine ook toegevoegd aan de zwellingsoplossing, in welk geval eiwitexpressie in de blaas in wordt onderdrukt. Dit geeft aan dat Kanamycine niet diffuus door het membraan, en onderdrukt interne expressie voortdurend, de hele tijd.De FRET-test wordt vervolgens uitgevoerd om elp-integratie in het membraan aan te tonen. Bij expressie van het membraan nemen extra peptiden op in het membraan, wat de gemiddelde afstand tussen de FRET-paren verhoogt en resulteert in een toename van het donorsignaal. De gepresenteerde techniek kan worden gebruikt om eenvoudige reactiecontainers te produceren of om kunstmatige cellen te maken met op peptide gebaseerde membranen.De inhoud binnenin kan naar behoefte worden gekozen. Door het gebruik van deze peptide vesicles, kunnen we nu vooruit kijken op meer complexe synthese reacties binnen hen.

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

We presenteren een protocol voor het reconstitueren van membraaneiwitten en het inkapselen van enzymen en andere in water oplosbare componenten in lipideblaasjes van submicrometer en micrometer grootte.

Constructie van metabolische netwerken uit evenwicht in blaasjes ter grootte van nano- en micrometer

We gesynthetiseerd stervormige gouden nanostars met behulp van een zilveren zaad gemedieerde groei methode. De diameter van de nanostars varieert van 200 tot 300 nm en het aantal tips variëren van 7 tot 10. De nanodeeltjes hebben een brede oppervlakte plasmon resonance-modus in het midden van het nabij-infrarood.

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.

Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

We beschrijven hier een verbeterde werkwijze Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) waarin we introduceren protease splitsingsplaats tussen de donor en acceptor fluorofoor sites. Deze modificatie kunnen wij specifieke LRET signalen die door membraaneiwitten plaats, waardoor de studie van membraaneiwitten zonder eiwitzuivering verkrijgen.

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Electrospun nanovezels hebben een hoge oppervlak tot gewichtsverhouding, uitstekende mechanische integriteit gewicht en ondersteunen celgroei en proliferatie. Deze nanovezels hebben een breed scala van biomedische toepassingen. Hier fabriceren we keratine / PCL nanovezels, met behulp van de electrospinning techniek en karakteriseren van de vezels voor mogelijke toepassingen in de tissue engineering.

Synthese van Keratine-gebaseerde Nanovezel voor Biomedische Technologie

Zelf-geassembleerde polyelektrolyetcomplexen (PEC) gemaakt van heparine en protamine werden afgezet op alginaatkralen om osteogene groeifactoren vast te houden en de afgifte ervan te reguleren. Deze afgiftestrategie maakt een 20-voudige vermindering van de BMP-2 dosis mogelijk bij toepassingen voor spinale fusie. Dit artikel illustreert de voordelen en fabricage van PEC's.

Polyelectrolyte Complex voor Heparine Binding Domain osteogeen Growth Factor Delivery

Leer een eenvoudige methode voor het maken van peptide-gebaseerde kleine unilamellaire vesikels met behulp van filmrehydratatie van glazen parels. Deze techniek maakt de opname van gevoelige biologische monsters mogelijk.

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

Meer video's verkennen