Het induceren en karakteriseren van vesiculaire steatose in gedifferentieerde HepaRG cellen

Dit protocol beschrijft hoe lever vesiculaire steatose te induceren in gedifferentieerde HepaRG cellen en methoden voor detectie en kwantificering van lipide accumulatie. Dit in vitro menselijke celmodel is een waardevol alternatief voor in vivo muizenmodellen en voor primaire menselijke hepatocyten. Ontdooi een stikstof cryopreserved low-passage batch van HepaRG cellen door ze onder te dompelen in een 37 graden Celsius bad tot ontdooid.

Breng de cellen snel over naar een buis van 15 milliliter met 10 milliliter vermenigvuldigend medium. Na vijf minuten centrifugeren, gooi je de supernatant weg en roep je de cellen opnieuw op in vijf milliliter vermenigvuldigend medium. Tel de cellen en verdun om 250.000 cellen per vierkante centimeter te plaatsen.

Plaats de cellen op 100-millimeter celkweekschotels en vernieuw het medium om de twee of drie dagen. Cellen vermenigvuldigen zich met een verdubbelingstijd van ongeveer 24 uur. Zodra de HepaRG cellen bereiken 80%confluency, los ze via een drie-tot vijf minuten incubatie met 0,05% trypsin oplossing.

Verzamel de cellen in vermenigvuldigend medium en centrifuge gedurende vijf minuten als voorheen. Gooi de supernatant weg en verhoog de cellen met vijf milliliter vermenigvuldigend medium. Tel nogmaals de cellen en verdun om 250.000 cellen per vierkante centimeter te plaatsen.

Versterk in dit stadium de cellen door deze stappen te herhalen om een passend aantal cellen te bereiken om experimenten te starten. Om HepaRG-cellen te cryopreserveen, maak je de cellen 24 uur na het beplating los via een incubatie van drie tot vijf minuten met 0,05% trypsineoplossing. Verzamel de cellen in vermenigvuldigend medium en centrifuge gedurende vijf minuten als voorheen.

Gooi de supernatant, resuspend de cellen in een milliliter per partij van het vriesmedium, en cryopreserve de partijen in vloeibare stikstof. Op dag nul, zaad HepaRG cellen op 250,000 cellen per vierkante centimeter in cultuur behandelde gerechten met een passend volume van proliferatie medium. Twee gerechten moeten worden verguld voor elke test, een voor controlecellen en een voor oleaat behandelde cellen.

Op dag twee en dag vier, verander het medium met een passend volume van proliferatie medium en laat de cellen groeien totdat ze samenvloeiing te bereiken. Op dag zeven moeten de cellen 100% samenvloeiend zijn. Was de cellen één keer met 1X PBS.

Verwijder vervolgens de 1X PBS en voeg een geschikt differentiatiemedium toe. Op dag acht, negen, 12, 15 en 18 was je de cellen één keer met 1X PBS voordat je een passend volume differentiatiemedium toevoegt. Observeer op dag 21 HepaRG-cellen onder een microscoop en zorg ervoor dat de cellen gedifferentieerde culturen zijn.

Als een controle, oogst een controle schotel om genexpressie analyse van differentiatie marker genen uit te voeren. Op dag 21 kunnen gedifferentieerde HepaRG-cellen cryopreserved in vloeibare stikstof. Verdun op dag 21 natriumolelaat met een passend volume van volledig differentiatiemedium tot een uiteindelijke concentratie van 250 micromolar.

Voeg 99% methanol bij een verhouding van een tot 400 in een andere aliquot van differentiatie medium om het voertuig controle behandeling te maken. Was de cellen eenmaal met 1X PBS en voeg voertuig of natriumoleate medium toe. Verander op dag 23 en dag 25 het medium met het juiste volume vers bereid medium.

Observeer de cellen op dag 26 door optische microscopie. Lipidedruppels accumuleren in de met natriumoleaat behandelde cellen en zijn gemakkelijk zichtbaar als doorschijnende druppels in het cytoplasma. Om Oil Red O kleuring uit te voeren, eerst wassen de cellen een keer met 1X PBS en verwijder de 1X PBS volledig.

Voeg 4% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de paraformaldehyde en was de cellen twee maal met 1X PBS. Na het verwijderen van de PBS, incubeer de cellen met 60% isopropanol gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder het isopropanol en laat de cellen volledig drogen bij kamertemperatuur. Voeg nu oil red o werkoplossing aan de cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Het volume van de werkoplossing die voor elk monster nodig is, komt overeen met het volume van de media die worden gebruikt voor het kweken van de cellen.

Verwijder de Oil Red O-oplossing en voeg onmiddellijk dubbel gedestilleerd water toe. Na het wassen van de cellen vier keer met dubbel gedestilleerd water, verwerven beelden onder de microscoop voor analyse. Om de Olie Rode O kleurstof elute, verwijder al het water en laat drogen.

Voeg vervolgens een milliliter van 100% isopropanol toe en incubbate gedurende 10 minuten met zacht schudden bij kamertemperatuur. Pipette de isopropanol met eluted Oil Red O kleurstof op en neer meerdere malen, ervoor te zorgen dat alle olie Red O is in de oplossing. Breng de oplossing over naar een cuvette.

Meet de optische dichtheid op 500 nanometer door spectrofotometrie en gebruik 100% isopropanol als blanco. Was de cellen één keer met 1X PBS. Dan, incubeer met 100 nanomolar van Bodipy verdund in 1X PBS in het donker gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius.

Een niet-bevlekte controle moet worden opgenomen in de stroom cytometrie metingen. Verwijder de kleuroplossing en was de cellen eenmaal met 1X PBS. Was vervolgens de cellen opnieuw en verwijder de PBS volledig.

Voeg 4% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de paraformaldehyde en was de monsters drie keer gedurende vijf minuten in PBS. Cellen kunnen worden bewaard in 1X PBS op vier graden Celsius of onmiddellijk afgebeeld.

Voor opslag, wikkel met Parafilm en bedek met aluminiumfolie om te voorkomen dat de cellen drogen. Om te controleren of efficiënte inductie van steatose, oleate-behandelde en controle HepaRG cellen werden gekleurd met Oil Red O kleurstof. Na het bevlekken zijn lipidedruppels goed zichtbaar als rode druppeltjes.

Kleuring kan worden gekwantificeerd door spectrofotometrische meting van Olie R O kleurstof geëuterd met isopropanol. Absorptie van eluted Oil Red O uit de cellen is direct evenredig met cytoplasmische lipide druppel accumulatie. Natriumoleaatconcentratie en blootstellingstijd werden bepaald door MTT colorimetrische cel levensvatbaarheidstest.

Het Formosan product wordt gekwantificeerd door zijn absorptie op 490 nanometer en is direct evenredig met het aantal levende cellen in de cultuur. Natriumoleaat behandeling werd vergeleken met natrium palmitaten behandeling. De apoptotische drug doxorubicine werd gebruikt als een controle.

Om de toename van cellulaire lipidegehalte na natriumolelaatbehandeling te kwantificeren, werd kleuring met Bodipy-kleurstof gebruikt om lipidedruppels te labelen. Met behulp van cytofluorometrische analyse is het mogelijk om het triglyceridegehalte te kwantificeren met Bodipy gemiddelde fluorescerende intensiteit, die hoger is in met oleate behandelde cellen in vergelijking met controlecellen. Dit duidt op een efficiënte vetophoping na de behandeling met oleaat.

Inderdaad, beelden van Bodipy-gekleurde cellen tonen felgroene fluorescerende lipide druppels in oleaat behandelde cellen die niet zichtbaar zijn in de controlecellen. Om de accumulatie van lipidedruppels na natriumoleatebehandeling verder te karakteriseren, kan CARS-microscopie worden uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol, waardoor lipidedruppels kwantificering mogelijk maken zonder etikettering. Dit op cellen gebaseerde model kan de kennis van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij niet-oncotische leververvetting vergroten en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe markers voor vroegtijdige diagnose en nieuwe behandelingsstrategieën.