Vergelijkende laesies analyse door middel van een gerichte sequentie benadering

Ons protocol maakt het vastleggen van de genetische verwantheid tussen primaire en gemetastaseerdlaesies mogelijk door de identificatie van moleculaire veranderingen die betrokken zijn bij ziekteprogressie. Onze methode biedt de mogelijkheid om genetische verwantschap in klinisch monster met een hoge gevoeligheid en specificiteit te verkennen. Dit is te wijten aan de integratie van moleculaire en histopathologische analyse.

De beoordeling van intratumor heterogeniteit in het kankeronderzoek is van het grootste belang bij het ontwerpen van effectieve anti-tumor strategieën en onze methode is breed toepasbaar op vele vaste tumortypes. Verdun elke bibliotheek na het voorbereiden en kwantificeren van de bezienswaardigheden tot een concentratie van 100 picomolar in nucleasevrij water en combineer 10 microliters van elke verdunde bibliotheek voor één enkele run in één buis. Meng vervolgens de gepoolde bibliotheken door pipetting.

Als u een sequencing-run wilt starten, opent u eerst de Torrent-browser op een computer die is aangesloten op het sequencing-systeem. Plan een nieuwe run met behulp van de generieke sjabloon voor de geselecteerde toepassing en selecteer onder het tabblad kits het Ion Proton-systeem of het Ion Gene Studio S5-systeem. Selecteer de juiste chip in het vervolgkeuzemenu van het chiptype en selecteer Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit in de vervolgkeuzelijst bibliotheekkit.

Selecteer de knop Ion Chef voor de sjabloonkit en selecteer de juiste Chef Kit in de vervolgkeuzelijst van de sjabloonkit. Selecteer de juiste sequencing kit in het vervolgkeuzemenu sequencing kit en selecteer Ion Express in de vervolgkeuzelijst barcodeset. Selecteer onder het tabblad plugin de plug-in voor dekkingsanalyse.

Selecteer onder het tabblad Plannen het GRCH37HG19-genoom in de vervolgkeuzelijst van de referentiebibliotheek. Selecteer in de vervolgkeuzelijst doelregio's het juiste deelvenster dat moet worden gesequenced. Stel vervolgens het aantal streepjescodes in dat moet worden gesequenced en stel de naam en voorbeeldnaam voor elke bibliotheek in.

Voor een gepoolde bibliotheken verdunning, verdun de voorraad bibliotheek met nuclease-vrij water tot een 25 picomolar concentratie voor een ion proton chip en pipet 50 microliters van elke verdunde bibliotheek naar de bodem van de juiste bibliotheek monster buis. Laad monsterbuizen met de samengevoegde verdunde bibliotheken op het bibliotheekvoorbereidingssysteem en start de kloonversterking. Volg voor de volgende generatie sequencing de instructies op het scherm om het instrument te initialiseren.

Wanneer de kloonversterking is voltooid, opent u de ionchef-instrumentdeur en opent u het deksel van de centrifuge van de chiplading en verwijdert u de twee chips uit het voorbereidingssysteem van de bibliotheek. Plaats de chips in aparte chipopslagcontainers en laad een van de spanen in het chipcompartiment in het instrument. Sluit vervolgens het deksel van het chipcompartiment en start de volgorde.

Open voor mutatieanalyse de dekkingsanalyse plugin en gebruik de dekkingsanalyse-output om de diepte van de dekking en uniformiteit te verifiëren. Gebruik de Torrent Variant Caller-plug-in om de variant uit te voeren waarin de kiemlijn of somatische workflow wordt geselecteerd. Download vervolgens gefilterde varianten variant call format bestanden en gebruik maken van de variant effect voorspeller software in de NCBI RefSeq database om de varianten annoteren.

Om de variaties van het kopieernummer te schatten, gebruikt u de ion reporter-uploader-plug-in om de sequencing-gegevens in de ionenverslaggeversoftware te laden en de uitgebreide normale pairworkflow van het kankerpaneel te gebruiken om de gegevens te analyseren. Filter handmatig de mutaties en copy-number variaties op basis van de scores die door de software zijn toegewezen en controleer de variaties visueel met de Integrative Genomics Viewer. Inspecteer vervolgens visueel de uitlijning op ongebruikelijke reads die artefactuele oproepen kunnen genereren en inspecteer de genormaliseerde dekking voor alle amplicons in een bepaald gen tegen de genormaliseerde dekking van de basislijn om de variaties van het kopienummer te verifiëren.

Index voor elk geval de mutatieoproepen van de volgorde van normaal weefsel of bloed of primaire tumor of metastase. Vlag als kiembaan en teruggooi oproepen die ook blijken uit de volgorde gegevens van kiembaan DNA. Vlag als kloon of stichter de mutaties die worden gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt.

Vlag dan als subklonale of progressor de mutaties die worden gedetecteerd in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt. In dit representatieve experiment identificeerden multi-laesiessequentie van vijf vaste pseudopapillary neoplasma-gevallen gericht op de coderingssequenties van 409 kankergerelateerde genen in totaal 27 somatische mutaties in acht genen. Mutaties werden gedefinieerd als stichter of kloon wanneer gedeeld tussen alle laesies van een bepaalde patiënt en progressor of subklonale wanneer gedetecteerd in sommige, maar niet alle laesies van een bepaalde patiënt.

Immunohistochemische kleuring voor bèta-catenine en KMD6A was constant homogeen onder de diverse laesies van gevallen met mutaties van de overeenkomstige genen. De matige kleuring voor KMD6A in gemuteerde exemplaren suggereren dat genetische verandering waarschijnlijk de functie zal veranderen in plaats van de expressie van het eiwit. KMD6A verlies van functie bij alvleeskliertumoren wordt geassocieerd met up regulatie van de hypoxie marker GLUT-1.

En dienovereenkomstig was GLUT-1 meer dan uitgedrukt in gevallen met KMD6A-mutaties. Immunohistochemie voor BAP1 en TP53 bevestigde dat mutaties in die genen subklonal waren. In dit virtuele karyotype van een representatief geval met de locatie, nabijheid en kopie-nummer status van veranderde genen, de kopie-nummer variatie analyse met behulp van sequencing gegevens bleek veranderingen in alle geanalyseerde monsters.

En in tegenstelling tot puntmutaties, waren de meeste variatiewijzigingen van het aantal exemplaren subklonale. Validatie en indexering van mutaties en variatie van het kopieernummer en het gebruik van de tumor normale DNA-vergelijking zijn belangrijk voor het vermijden van het genereren van artefactuele oproepen die de resultaten kunnen ongeldig maken. Deze procedure kan ook worden toegepast op hele genoomsequencingstudies gericht op het ondervragen van het gehele genoom voor de identificatie van mutatie tussen laesie van verschillende vaste tumortypen.

In het gebied van kankeronderzoek zijn deze technieken essentiële instrumenten om de biologie van ziekten met belangrijke klinische implicaties te begrijpen die gericht zijn op het ontwerpen van gepersonaliseerde en effectieve gerichte therapieën.