Karakteriseren van Mutationele belasting en klonale samenstelling van menselijk bloed

Met deze methode kunnen we nauwkeurig het aantal mutaties in één hematopoietische stamcel bepalen. Deze mutaties kunnen worden gebruikt om mutatieprocessen te ontcijferen en hematopoietische afstammingen te ontleden. Onze methode vermijdt het gebruik van hele-genoomversterkingstechnieken door de hematopoietische stamcellen in vitro te klonen, wat resulteert in lagere foutenpercentages en voordelen downstream-analyse.

De mutatiepatronen die aanwezig zijn in het genoom van hematopoietische stamcellen kunnen de mutagene en de DNA-herstelprocessen onthullen waaraan ze zijn blootgesteld. Begin deze procedure met de voorbereiding van monstermateriaal en kleuring zoals beschreven in het tekstprotocol en bereid vervolgens 25 milliliter hematopoietische stam- en voorvadercel of HSPC-kweekmedium voor. Vul een celcultuur 384 putplaat met 75 microliters van HSPC cultuurmedium in elke put.

Om verdamping van het medium in de buitenste putten te voorkomen, vul de buitenste putten met 75 microliter steriel water of PBS en gebruik deze putten niet voor celsortering. Correct sorteren van levensvatbare signaal HSPCs is de meest kritieke stap in dit protocol. Stel poorten in voor de HSPC-sortering op basis van een onbevlekte controle in 10.000 cellen uit het gekleurde monster.

Poort enkele cellen door het tekenen van een poort rond de lineaire voorwaartse spreiding hoogte versus voorwaartse verstrooiing gebied fractie. Gebruik de niet-bevlekte regelfractie om een poort te tekenen voor de lijnfractie. Teken poorten voor CD34 positieve cellen en verder karakteriseren deze subset door het instellen van een specifieke poort voor CD38 negatieve, CD45RA negatieve cellen.

Laad de 384-put plaat op de fax machine en sorteren enkele cellen. Indien van toepassing op het faxapparaat, schakelt u de optie in om indexsorteergegevens te behouden om het traceren van de gesorteerde cellen mogelijk te maken. Om cultuur afzonderlijk gesorteerd HSCs, wikkel de 384-well cultuur plaat met deksel in transparante polyethyleen wrap.

Breng de 384-well plaat naar een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5% kooldioxide en bewaar het in de couveuse voor drie tot vier weken totdat zichtbare klonen verschijnen. Na vier weken kweken, bepalen welke putten hebben een samenvloeiing van 30%of hoger. Voor elke kegel, prefill 1,5 milliliter microtubes met een milliliter van 1%BSA en PBS en label de buis volgens de overeenkomstige put.

Maak een pipettip voor met 1%BSA en PBS om het aantal cellen dat aan de pipetpunt blijft plakken te minimaliseren. Krachtig pipette het medium op en neer ten minste vijf keer tijdens het schrapen van de bodem van de put met de 200 microliter pipet ingesteld op 75 microliters. Verzamel de celsuspensie in de gelabelde microbuis die overeenkomt met de put.

Herhaal pipeting in de put met maximaal 75 microliters van verse 1%BSA en PBS om een maximale opname van cellen te garanderen. Clonally gekweekte cellen kunnen vasthouden aan de bodem van de put. Inspecteer de putten met behulp van een standaard, omgekeerde lichtmicroscoop om ervoor te zorgen of alle cellen zijn verzameld.

Als alle putten met meer dan 30% samenvloeiing zijn geoogst, plaatst u de 384-put plaat terug in de couveuse. Klonale culturen kunnen zich tot vijf weken vermenigvuldigen. Draai de celsuspensie vijf minuten naar beneden bij 350 keer g.

Een kleine pellet moet zichtbaar zijn. Verwijder voorzichtig alle, maar ongeveer vijf microliter van de supernatant. Celpellets kunnen worden ingevroren bij min 20 graden Celsius en meerdere maanden voor DNA-isolatie worden opgeslagen.

Mutaties aanwezig in de eerste takken van de afstamming zullen ook sub clonally aanwezig zijn in het bulkmonster. Latere vertakkingslijnen worden bepaald door mutaties die alleen tussen HSPCs worden gedeeld. Om mutaties te identificeren die aanwezig zijn in een subset van de klonen en subclonaly aanwezig zijn in de bulk, eerste filter voor somatische mutaties gedeeld tussen klonen.

Bewerk in een terminal op basis van Unix de filtersomatische. ne bestand om de aaien in te stellen en de andere parameters aan te passen. Voer de filtersomatic.

pi script. Filter op mutaties die subclonaly aanwezig zijn in de bulk met behulp van de determine lowVAF bulk. r-script in een Unix-gebaseerde terminal.

Dit genereert aparte vcf-bestanden voor gedeelde en unieke nucleotidevarianten. Bepaal alle mutaties die worden gedeeld tussen klonen die niet aanwezig zijn in het bulkmonster, door alle mutatieposities te overlappen. Sluit false positives uit door handmatige inspectie met integrative genomic viewer, afgekort IGV.

Mutaties worden als vals beschouwd wanneer deze niet aanwezig is wanneer de mutatie aanwezig is in de kiembaan in alle klonen of wanneer deze aanwezig zijn in slecht in kaart gebrachte gebieden. Echte mutaties kunnen worden gedeeld tussen twee klonen of subclonaly aanwezig zijn in de bulk. Resequence alle gedeelde loci onafhankelijk met behulp van gerichte of sanger sequencing.

Gebruik de gedeelde mutaties om een binaire tabel van mutaties versus gesequencede klonen te bouwen, waarbij nul aangeeft dat de mutatie niet aanwezig is en een tabel die de aanwezigheid van de mutatie aangeeft. Output de mutatie binaire tabel als een heat map samen met een dendrogram met vermelding van afstamming relaties tussen cellen met behulp van R gebaseerde functies. De heatmap geeft de mutatiestatus voor elke cel aan.

Getoond als een voorbeelduitvoer van de analyse van het kopienummer die door besturingselement drie c wordt gegenereerd om te controleren op wijzigingen in het kopienummer. De variant alleel fractie plot gemaakt door enkele nucleotide variant filteren, is een histogram van variant allel frequenties in het monster. Een piek in het dichtheidsperceel op 0,5 geeft aan dat het monster klonaal is.

Hier afgebeeld is een typische mutatiepatronen analyse produceren van een 96 trinucleotide plot. Naast kwantificering van verschillende mutatietypes, kan ook met deze tool de extractie van de handtekening worden uitgevoerd. Mutaties die worden gedeeld tussen klonen of aanwezig zijn in een kloon in de kiembaancontrole worden gevalideerd met behulp van IGV.

Mutaties worden als waar beschouwd wanneer ze in het monster aanwezig zijn en niet bij hoge variantallelfrequentieniveaus in de kiembaan. Mutaties worden als vals beschouwd wanneer ze niet aanwezig zijn in IGV, wat kan gebeuren in slecht in kaart gebrachte regio's. In andere gevallen worden gebeurtenissen gedetecteerd die worden gedetecteerd door het filteren van één nucleotidevariant, gemiste kiembaanvarianten.

Onafhankelijke resequencing van mutaties door gerichte resequencing wordt sterk aanbevolen voor deze mutaties in geselecteerde klonen. Na detectie van gedeelde somatische mutaties tussen klonen wordt een binaire matrix gegenereerd, wordt een warmtekaart samengesteld met cellen met en zonder de gedeelde mutaties A tot en met M.De ontwikkelingslijnboom wordt aangegeven. Als volgende stap voor de hier gepresenteerde meta kunnen mutatieprocessen die actief zijn in hemopoietische stamcellen worden bepaald aan de hand van mutatiesignatuuranalyse.