Name: Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer intravitale beeldvorming van epitheliale lymfocyten in de dunne darm van muizen met behulp van omgekeerde spinning disk confocale microscopie. Deze techniek maakt real-time tracking van levende immuuncellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch biomedische Grant (KLE). Wij danken Madeleine hu voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript en het verstrekken van de gegevens in de representatieve resultaten.

Alle studies werden uitgevoerd in een vereniging van de beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care (AALAC)-geaccrediteerd faciliteit volgens protocollen goedgekeurd door de Rutgers New Jersey Medical School vergelijkende geneeskunde middelen.
1. muis voorbereiding
Opmerking: De volgende procedure, met inbegrip van dierlijke voorbereiding en chirurgie, duurt 30 tot 40 min. voorafgaand aan de operatie, zet de Microscoop en warming-up van de bijgevoegde incubator op de Microscoop tot 37 ° c.
<ol><li>Voer experimenten uit op 8 – 10 weken oud TcrdEGFP muizen op een C57BL/6 achtergrond, die werden verkregen van Bernard Malissen (INSERM, Parijs, Frankrijk). Volgens dec-goedgekeurde procedure, verdoven de muis door i.p. injectie van ketamine (120 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) die op het gewicht van het dier wordt gebaseerd. Evalueer het niveau van anesthesie door ademhalingstarief (55-65 ademhalingen per minuut)21, Teen snuifje en palpebrale reflex.</li>
	<li>Zodra chirurgische vliegtuig anesthesie is bereikt, veilig de achterpoten van de muis met behulp van tape om een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te handhaven, die kan worden gecontroleerd door rectale thermometer. Als er tekenen zijn dat de anesthesie is het dragen van uit (bijv. verhoogde ademhalingssnelheid, knipperen en/of ogen spier twitching reactie op palpebrale reflex), opnieuw te beheren 50 l van ketamine/xylazine op een moment totdat de muis is volledig verdoofd.</li>
	<li>Bereid de nucleaire kleurstof door verdunning 50 µ L van Hoechst 33342 (10 mg/mL) met 315 µ L van 0,9% zoutoplossing; de uiteindelijke concentratie is 37,5 mg/kg op basis van het gewicht van de muis (200 µ L benaderende volume). Zodra de muis is verdoofd, langzaam injecteren van de Hoechst met behulp van een tuberculinespuit door de retro-orbitale veneuze sinus. Opmerking: Wacht 1 – 2 min alvorens over te gaan tot de volgende stap om de muis te acclimatiseren aan de verandering in Circulerend volume na retro-orbitale injectie.</li>
	<li>Plaats een kleine hoeveelheid smeermiddel over de ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen.</li>
</ol>2. muis chirurgie: laparotomie om intestinale mucosa bloot
<ol><li>Maak een 2 cm verticale incisie door de huid en het buikvlies langs de middellijn van de onderbuik te externaliseren de regio van de darm te worden afgebeeld.</li>
	<li>Met behulp van schuine Tang, voorzichtig Trek de blindedarm uit de buikholte en Identificeer het gebied van de dunne darm te worden afgebeeld. Wees voorzichtig niet te scheuren mesenterica bloedvaten tijdens dit proces. Om potentiële schade of bloeden te minimaliseren, te voorkomen grijpen of knijpen de darm met de Tang.</li>
	<li>Bepaal de plaats van een geschikte streek van dunne darm (2-3 cm) voor weergave die minimale fecale inhoud bevat. Voorzichtig terug de blindedarm en de resterende dunne darm in de buikholte, terwijl het verlaten van het segment van de rente extern. Opmerking: Vermijd prikken de blindedarm of het onderbreken van de mesenterica vasculatuur tijdens deze stap.</li>
	<li>Plaats twee paren van een tang aan beide zijden van de onderliggende mesenterium tussen de bloedvaten, en wrijf de uiteinden van de Tang samen om een gat in het membraan te maken (Figuur 1)22. Hierdoor kan de naald door de mesenterium gaan bij het sluiten van de buikholte onder de darm.</li>
	<li>Sluit de incisie terwijl het houden van de lus van de darm extern. Met behulp van schuine Tang en een gebogen, spitse punt naald bevestigd aan een 5 cm hechting, doordringen een kant van het buikvlies, ga door het gat gemaakt in de vorige stap, en omhoog door de andere kant van het buikvlies voering. Plaats een hechtdraad aan de bovenkant, en een andere in de buurt van de onderkant van de incisie. Opmerking: Voorkom beschadiging van de vasculatuur tijdens deze stap.</li>
	<li>Herhaal dit proces om de huid te sluiten onder de intestinale lus, door het plaatsen van een hechting in het midden van de incisie, tussen de vorige hechtingen in de onderliggende peritoneum. Opmerking: Het is belangrijk om alleen externaliseren het gebied dat moet worden afgebeeld; Dit zal verminderen vreemde beweging tijdens de beeldvorming. Zorg ervoor om te voorkomen dat koppelverkoop van de mesenterica slagaders.</li>
	<li>Gebruik een elektrocauterisatie om een lijn van perforatie langs de anti-mesenterica grens te maken. Onmiddellijk na cauterisatie, breng een paar druppels water op het oppervlak van de darm om extra warmte-geïnduceerde beschadiging van het weefsel te voorkomen. Blot met een Kimwipe om residueel water te verwijderen.</li>
	<li>Snijd een kleine horizontale spleet aan de distale rand van de dichtgeschroeid weefsel met behulp van Vannas schaar en ga verder te snijden langs de lengte van de dichtgeschroeid lijn in de richting van de proximale einde van het uitgesneden weefsel segment (ongeveer 1,5 cm in lengte) om het slijmvlies bloot Oppervlak. Opmerking: Indien nodig, gebruik een tang om voorzichtig te verwijderen overtollige fecale inhoud resterende op de blootgestelde mucosale oppervlak.</li>
	<li>Bedek de buik van de muis met een vochtige Kimwipe om te voorkomen dat het weefsel van steeds uitgedroogd. Transporteer de muis naar de Microscoop in een overdekt vat.</li>
</ol>3. image acquisitie door spinnen schijf confocale microscopie
<ol><li>Pipetteer 150 µ L van 1 µ M AlexaFluor 633 in Peeters op de glazen coverslipped onderkant van een 35 mm schaal. Plaats de muis, zodat de geopende mucosale oppervlak rechtstreeks contact met de dekglaasje.</li>
	<li>Kantel het hoofd van de Microscoop terug en plaats de muis op de coverslipped schotel op de Imaging fase in een pre-verwarmde incubator. Alternatief, bedek de muis door een verwarmingsdeken om de lichaamstemperatuur te handhaven.</li>
	<li>Start imaging software. De excitatie-intensiteit en de belichtingstijd voor elke Laser mag niet meer dan 10 tot 15 mW of 120 – 150 MS, respectievelijk, om te voorkomen dat fotobleken en om het interval tussen de tijdpunten te minimaliseren. Stel het frame gemiddelde in op "2" en zet de EM Gain functie aan om achtergrondruis te verminderen. Selecteer 63x objectieve kalibratie om de juiste meting van de pixelgrootte te garanderen. Opmerking: De hierboven beschreven montages zijn bedoeld om een aanvankelijke verwijzing te verstrekken, maar zullen afhankelijk van individuele Microscoop configuraties variëren.</li>
	<li>Met behulp van de 405 nm laser en de 20x Air doelstelling, visualiseer de kernen te lokaliseren een gebied van Villi dat een gebrek aan merkbare beweging of drift door het oog. Vermijd gebieden van artefactuele beweging als gevolg van ademhaling, Peristalsis of hartslag.</li>
	<li>Met behulp van de XY-scan, registreert de XY-coördinaat van het gebied van belang en overschakelen naar de glycerol onderdompeling 63X doelstelling.</li>
	<li>Bevestig dat de Villi in het geselecteerde veld stabiel zijn door het verwerven van een live image op de 405 nm kanaal voor maximaal 1 min.</li>
	<li>Terwijl het verwerven van een levend beeld op het kanaal van 405 nm, pas de nadruk aan om het orthogonale vliegtuig enkel onder het villous uiteinde te vinden. Verwerven Z-stacks vanaf de net onder de villous Tip epitheel vaststelling van de vlokken totdat het moeilijk is om de kernen op te lossen, ongeveer 15 tot 20 µm, met behulp van een 1,5 µm stap. Opmerking: Bij de beeldvorming met drie kanalen (405, 488, 640 nm) met behulp van de belichtingstijden hierboven beschreven, is het mogelijk om alle drie de kanalen sequentieel te verwerven op ongeveer 20 s intervallen.</li>
	<li>Open de software in Analysis mode, 3 – 5 min na het begin van de overname, om de beeldstabiliteit en γδ IEL beweeglijkheid te bevestigen. Doorgaan met het verwerven van beelden voor 30 tot 60 min voor elk gebied van Villi. Record 2 – 3 velden voor elke muis. Terwijl de beeldvorming, monitor de muis om de 5 minuten. Opmerking: Als de anesthesie begint te slijten, gebruik een tang om zachtjes Scruff de nek van de muis te beheren 50 µ L van ketamine/xylazine op een moment. Blijf de anesthesie niveaus te controleren en opnieuw te beheren wanneer dat nodig is.</li>
	<li>Het is niet raadzaam om het imago van een enkele muis langer dan 4 uur. Zodra de beeldaanwinst volledig is, offer de muizen door cervicale dislocatie die door bilaterale pneumothorax wordt gevolgd.</li>
</ol>4.4D analyse van beelden
<ol><li>Direct importeren Imaging bestanden naar 4D rendering software.</li>
	<li>Maak individuele oppervlakken voor IELs en het lumen, dan volgen de oppervlakken na verloop van tijd met behulp van de parameters beschreven in tabel 1 als een eerste referentie. Voor de IELs, in staat stellen splitsen aanraken van objecten met behulp van de zaad punt diameter aangegeven.</li>
	<li>Gebruik de autoregressieve tracking algoritme om te bepalen IEL beweeglijkheid. Hoewel de tracking-algoritme is relatief nauwkeurig, is het noodzakelijk om visueel te inspecteren tracks voor elke individuele IEL. Als een track onjuist is, corrigeert u deze met de functies verbinding verbreken en verbinden onder het tabblad tracks bewerken .</li>
	<li>Om de afstand van elke IEL tot het lumen te bepalen, selecteert u het lumen oppervlak en voert u de afstands transformatie functie uit onder het gereedschaps menu. Selecteer buitenoppervlakwanneer daarom wordt gevraagd. Eenmaal berekend, zal de afstand transformatie worden weergegeven als de 4e kanaal.</li>
	<li>Filter de intensiteit min van de 4e kanaal te selecteren γδ IELs die zich binnen de laterale intercellulaire ruimte (LIS). Deze waarde moet dicht bij 15 µm, gebaseerd op de hoogte van een zuilvormige epitheel cel. Het percentage van de totale γδ IELs binnen dit bereik wordt gerapporteerd als de frequentie van γδ IELs in de LIS.</li>
	<li>Voor verdere analyse, export statistische gegevens, waaronder: IEL track snelheid, track verplaatsing, track rechtheid en track lengte. U ook gegevens analyseren met behulp van de Vantage-module. Afhankelijk van het experiment, het verkrijgen van extra statistieken van de verworven gegevens, met inbegrip van stilstaan tijd binnen de LIS of IEL/epitheel interacties.</li>
</ol>

<ol><li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).</li>
<li>Hu, M. D., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sentinels+at+the+frontline%3A+the+role+of+intraepithelial+lymphocytes+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmacology+Reports%22%5BJournal%5D)">Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease.</a> Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).</li>
<li>Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+intestinal+mucosa+by+intraepithelial+gamma+delta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).</li>
<li>Swamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+intraepithelial+lymphocyte+activation+promotes+innate+antiviral+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance.</a> Nature Communications. 6, 7090(2015).</li>
<li>Dalton, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepithelial+gammadelta%2B+lymphocytes+maintain+the+integrity+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+in+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection.</a> Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75 (2), 274-282 (1993).</li>
<li>Willcox, B. E., Willcox, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+TCR+ligands%3A+the+quest+to+solve+a+500-million-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery.</a> Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+barrier+is+maintained+by+in+vivo+tight+junction+expansion+during+pathologic+intestinal+epithelial+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding.</a> Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).</li>
<li>Marchiando, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1-dependent+occludin+endocytosis+is+required+for+TNF-induced+tight+junction+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLCK-dependent+exchange+and+actin+binding+region-dependent+anchoring+of+ZO-1+regulate+tight+junction+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).</li>
<li>Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+dendritic+cell+extension+into+the+small+bowel+lumen+in+response+to+epithelial+cell+TLR+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+migration+of+gammadelta+intraepithelial+lymphocytes+requires+occludin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).</li>
<li>Edelblum, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Migration+Limits+Transepithelial+Pathogen+Invasion+and+Systemic+Disease+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice.</a> Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).</li>
<li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+IL-15+Is+a+Critical+Regulator+of+gammadelta+Intraepithelial+Lymphocyte+Motility+within+the+Intestinal+Mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).</li>
<li>Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Epithelial+and+Intraepithelial+T+Cell+Crosstalk+Mediates+a+Dynamic+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection.</a> Cell. 171 (4), 783-794 (2017).</li>
<li>Prinz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+earliest+steps+of+gammadelta+T+cell+development+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.</a> Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).</li>
<li>Sandrock, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+reveal+origin%2C+persistence+and+non-redundant+functions+of+IL-17-producing+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).</li>
<li>Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR18+is+required+for+a+normal+CD8alphaalpha+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR55+regulates+intraepithelial+lymphocyte+migration+dynamics+and+susceptibility+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage.</a> Sci Immunol. 2 (18), (2017).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>Lodolce, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+receptor+maintains+lymphoid+homeostasis+by+supporting+lymphocyte+homing+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation.</a> Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).</li>
<li>Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-presentation+of+IL-15+by+intestinal+epithelial+cells+drives+development+of+CD8alphaalpha+IELs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).</li>
<li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+promote+the+sampling+of+luminal+antigens+and+bacteria+via+colonic+goblet+cell+associated+antigen+passages%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages.</a> Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).</li>
<li>Sujino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+adaptation+of+regulatory+and+intraepithelial+CD4%28%2B%29+T+cells+controls+gut+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation.</a> Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+of+TCR+Signaling+in+Homeostatic+Maintenance+and+Function+of+Dendritic+Epidermal+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).</li>
<li>Chennupati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+intercompartmental+movement+of+gammadelta+T+cells%3A+intestinal+intraepithelial+and+peripheral+gammadelta+T+cells+represent+exclusive+nonoverlapping+populations+with+distinct+migration+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics.</a> Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).</li>
<li>Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+imaging+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract.</a> Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontwikkeling van intravital microscopie technieken heeft een ongekende kans om de reorganisatie van subcellulaire structurenacht,9,22, cel-cel interacties12, 25 en het migrerende gedrag van de cel13,14,15,16,26<...

Epitheliale lymfocyten (IEL) bevinden zich binnen het intestinale epitheel, en worden gevonden zowel langs de kelder membraan en tussen aangrenzende epitheelcellen in de laterale intercellulaire ruimte1. Er is ongeveer één IEL voor elke 5-10 epitheelcellen; Deze IELs dienen als Sentinels om immuun toezicht van de grote uitgestrektheid van de intestinale epitheel barrière2te bieden. IELs het uitdrukken van de γδ T Cell receptor (TCR) bestaat uit tot 60% van de totale IEL populatie in de muizen dunne darm. Studies in γδ T-cel-gebrekkige muizen tonen een grotendeels beschermende rol van deze cellen in reactie op intestinale verwonding, ontsteking en besmetting3,4,5. Ondanks de generatie van de Tcrd knock-out muis6, ons begrip van γδ iel biologie blijft beperkt te wijten aan het feit dat liganden erkend door de γδ TCR nog moeten worden geïdentificeerd7. Dientengevolge, heeft het gebrek aan hulpmiddelen om deze cel bevolking te bestuderen het moeilijk gemaakt om de rol van γδ TCR activering en functie onder fysiologische en pathologische voorwaarden te onderzoeken. Om dit gat te vullen, hebben wij levende beeldvormingstechnieken ontwikkeld om γδ IEL migrerend gedrag en interactie met naburige enterocyten als middel te visualiseren om extra inzicht in γδ IEL functie en ontvankelijkheid aan externe stimuli in vivo te verstrekken.
In de afgelopen tien jaar heeft intravital Imaging aanzienlijk uitgebreid ons begrip van de moleculaire gebeurtenissen die betrokken zijn bij meerdere facetten van intestinale biologie, met inbegrip van epitheelcellen afstoten8, regulering van de epitheel barrièrefunctie9 ,10, myeloïde Cell bemonstering van Luminale inhoud11,12, en gastheer-microbe interacties11,13,14,15,16 . In het kader van de iel biologie heeft het gebruik van intravital microscopie licht geworpen op de spatiotemporal dynamiek van iel beweeglijkheid en de factoren die hun surveillance gedrag bemiddelen13,14,15, 16. De ontwikkeling van TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) reporter muizen, die labels γδ IELs door nucleaire GFP expressie17, bleek dat γδ IELs zijn zeer beweeglijke binnen het epitheel en vertonen een unieke surveillance gedrag dat reageert op microbiële besmetting17,13,14. Onlangs, werd een andere γδ T Cell reporter muis ontwikkeld (Tcrd-gdl) die GFP in het cytoplasma uitdrukt om visualisatie van volledige cel18toe te staan. Gelijkaardige methodologie is gebruikt om de eis van specifieke chemokinen receptoren, zoals G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR)-18 en-55, op de dynamica van iel beweeglijkheid19,20te onderzoeken. Bij afwezigheid van een cel-specifieke verslaggever, fluorescerende geconjugeerde antilichamen tegen CD8α werden gebruikt om te visualiseren en te volgen iel beweeglijkheid in vivo19,20. Hoewel twee-foton laser scanning microscopie wordt vaak gebruikt voor intravital Imaging, het gebruik van spinnen schijf confocale laser microscopie biedt unieke voordelen voor hoge snelheid en High-Resolution Multi-Channel beelden vast te leggen met een minimale achtergrondruis. Deze technologie is ideaal om de spatiotemporal dynamiek van immuun/epitheel interacties in het complexe micromilieu van het intestinale slijmvlies te verhelderen. Bovendien, door het gebruik van verschillende transgene en/of knock-out muismodellen, deze studies kunnen inzicht geven in de moleculaire regulatie van intestinale immuun-en/of epitheelcellen functie.

<table><tbody><tr><td>35 mm schotel, No. 1.5 Dekglasje</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Hypodermische naalden - 27 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Tuberculine-sering</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiescharen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Elektrocauter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>Gesloten incubatiekamer</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Oognaalden, Grootte #3; 1/2 Cirkel, Taper Point, 12 mm koordlengte</td><td>Roboz</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) met Start, Track, XT modules</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Omgekeerde DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney</td><td></td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas schaar 3"” (7,5 cm) Lang 5 x 0,15 mm Rechte Scherpe</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Niet-absorbeerbare chirurgische hechtdraad, Zijde Spool, Zwart Gevlochten</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Forceps 4.25"” (11 cm) Lange Hoekige Gladde 1,2 mm Tip</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td></td><td>Smerende Oogzalf</td></tr><tr><td>Spinning disk Yokogawa CSU-W1 met een 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersie objectief, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diodelaser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diodelaser</td><td>Andor</td><td></td><td>Confocal systeem</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Akorn</td><td></td><td>Anesthesie</td></tr></tbody></table>

intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Epitheliale lymfocyten uiten γδ T Cell receptor (γδ IEL) spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem surveillance van het intestinale epitheel. Deels door het ontbreken van een definitief ligand voor de γδ T-cel receptor, blijft ons begrip van de regulatie van γδ IEL activering en hun functie in vivo beperkt. Dit vereist de ontwikkeling van alternatieve strategieën te ondervragen signalering trajecten die betrokken zijn bij de regulering van γδ IEL functie en de responsiviteit van deze cellen aan de lokale microenvironment. Hoewel γδ IELs op grote schaal worden begrepen om pathogeen translocatie te beperken, het gebruik van intravital Imaging is van cruciaal belang voor het begrijpen van de spatiotemporal dynamiek van IEL/epitheel interacties op Steady-State en in reactie op invasieve pathogenen. Hierin presenteren we een protocol voor het visualiseren van IEL trekgedrag in de kleine intestinale mucosa van een GFP γδ T Cell reporter muis met omgekeerde spinnen schijf confocale laser microscopie. Hoewel de maximale Imaging diepte van deze aanpak is beperkt ten opzichte van het gebruik van twee-foton laser-scanning microscopie, spinnen schijf confocale laser microscopie biedt het voordeel van hoge snelheid Beeldacquisitie met verminderde foto bleken en photodamage. Met behulp van 4D beeldanalyse software, T Cell surveillance gedrag en hun interacties met naburige cellen kunnen worden geanalyseerd na experimentele manipulatie om extra inzicht te geven in IEL activering en functie binnen de intestinale mucosa.

Met behulp van intravital Imaging van TcrdEGFP reporter muizen, hebben we eerder aangetoond dat γδ IELs vertonen een dynamisch surveillance gedrag, waarin zij patrouilleren het epitheel door te migreren langs de kelder membraan en in de laterale intercellulaire ruimte (LIS) op steady staat (Figuur 2, film 1).
Deze benadering kan ook worden gebruikt om te evalueren hoe de remming van specifieke cel signalering paden en/of receptoren invloeden γδ IE...

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Intravital microscopie van het kleine darmslijmvlies kan inzicht geven in de spatiotemporale dynamiek van cellulaire interacties binnen het epitheel tussen verschillende immuunceltypes, of tussen deze twee compartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt de verwerving van high-speed en hoge-resolutie beelden binnen darmslijmvlies in realtime. Live beeldvorming van de darm kan extra inzicht geven in de cellulaire interacties, of celsignalering die betrokken is bij mucosale immuniteit, epitheliale biologie of kankerbiologie.Dit is een uitdagende methode die de praktijk van de chirurgische techniek vereist, evenals geduld en optimale positionering van de muis voor beeld-acquisitie. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde transgene muis, het uitdrukken van een verbeterde groene fluorescerende eiwit, of EGFP, Gamma-delta T-cel receptor, gebruik maken van een tuberculine spuit om langzaam injecteren 200 microliters van vers bereide Hoechst 33342 Dye Solution in de retro-orbitale veneuze sinus. Breng één tot twee minuten na de injectie zalf aan op de ogen van het dier om te voorkomen dat ze uitdrogen.Maak vervolgens een verticale incisie van 2 CM door de huid en het buikvlies, langs de middellijn van de onderbuik en gebruik schuine tangen om het caecum voorzichtig uit de buikholte te trekken. Identificeer een 2-3CM gebied van de dunne darm dat minimale fecale inhoud bevat, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de mesenterische bloedvaten niet scheuren, en breng zorgvuldig de caecum en de resterende dunne darm terug naar de buikholte, waardoor het segment van belang geterterfiseerd blijft. Het plaatsen van twee paar tangen aan weerszijden van de onderstrepen mesentery tussen de bloedvaten, wrijf voorzichtig de uiteinden van de tangen samen om een gat in het membraan te creëren.Met behulp van schuine tangen en een gebogen taper-point naald bevestigd aan een 5CM hechting, dringen een kant van het buikvlies door het gat in het membraan, en omhoog door de andere kant van de buikvlies, het plaatsen van een hechting aan de top, en een andere in de buurt van de onderkant van de incisie om de incisie te sluiten, terwijl de lus van de darm ge externaliseerd. Om de kans op succes te vergroten, niet afbinden of scheuren geen bloedvaten tijdens het plaatsen van de buikhechting en beperken elke externe behandeling van de darm. Sluit vervolgens de huid onder de darmlus op dezelfde manier en plaats één hechting in het midden van de incisie tussen de vorige hechtingen in het onderkomen.Met behulp van een elektrocauterie, maak een lijn van perforatie langs de antimesenteric grens en breng onmiddellijk een paar druppels water aan op het oppervlak van de darm om extra door hitte veroorzaakte weefselschade te voorkomen. Dep met een kimwipe om restwater te verwijderen. Gebruik vanna schaar om een ongeveer 1,5 CM horizontale spleet te snijden aan de distale rand van het cauterized weefsel, langs de lengte van de cauterized lijn, in de richting van het proximale uiteinde van het geexteriseerde weefselsegment.Wanneer het slijmvlies oppervlak wordt blootgesteld, bedek de buik met een vochtige kimwipe om het weefsel gehydrateerd te houden. Voor Spinning Disk Confocal Microscopie Imaging, vervoer de muis naar de microscoop in een overdekt vat. Start de imaging software en kantel het hoofd van de microscoop terug, en voeg 150 microliters van 1 micromolar vlo Alexa Fluor kleurstof en Hank's Buffered Saline Solution op de glass-cover gleed bodem.Plaats de muis zo dat het geopende slijmvlies direct contact maakt met de coverslip. Plaats de muis en de schotel op het beeldvormingsstadium in een voorverwarmde couveuse. Stel de excitatieintensiteit en belichtingstijd voor elke laser in op respectievelijk niet meer dan 10-15 milliwatt en 120-150 milliseconden en pas het framegemiddelde aan op 2.Schakel de functie Elektronenvervoudigen gain in om het achtergrondgeluid te verminderen en selecteer de 63X Objectieve Kalibratie om een juiste meting van de pixelgrootte te garanderen. Met behulp van de 405-nanometer laser en de 20X lucht doelstelling, handmatig visualiseren van de kernen om een veld van villi die merkbare beweging of drift ontbreekt lokaliseren, het vermijden van gebieden van artefactuele beweging als gevolg van ademhaling, peristaltiek of hartslag. Neem met de X-Y Scan de X-Y coördinatie van het interessegebied op en schakel over naar de glycerol onderdompeling 63X doelstelling.Verwerf een live beeld op het kanaal van 405 nanometer voor maximaal 1 minuut om te bevestigen dat de villi in het geselecteerde veld stabiel is, terwijl de focus wordt aangepast om het orthogonale vlak net onder de villus-tip te vinden. Dan verwerven z-stacks, vanaf net onder de villus tip epitheel, ongeveer 15-20 micrometer naar beneden naar de villus totdat het moeilijk is om de kernen op te lossen, met behulp van 1,5 micrometer-stappen. 3-5 minuten na het begin van de overname, bevestig de beeldstabiliteit en de Gamma-delta Intraepithelial Cell Motility, en blijven verwerven van beelden voor 30-60 minuten voor elk veld van villi.Gamma-delta Intraepithelial Lymphocytes stellen een dynamisch toezichtgedrag tentoon, waarin zij epitheel patrouilleren door langs het keldermembraan en in de laterale intercellulaire ruimte bij studiestaat te migreren. In deze representatieve beelden geven de gekleurde sporen de trekpaden aan van individuele Gamma-delta Intraepithelial Lymphocyten in de loop van 30 minuten. Hoewel de frequentie van intraepitheliale lymfocyten in de laterale intercellulaire ruimte werd verhoogd bij muizen behandeld met anti-interleukine-2 receptor bèta-antilichaam, meer dan 30% van deze Gamma-delta Intraepithelial Lymphocyten vertoonde een stationair gedrag.Dit stationair fenotype werd bevestigd door een aanzienlijke vermindering van zowel de momentane snelheid als de opsluitingsratio van de Gamma-delta Intraepithelial Lymphocyten, na interleukine-2-receptor blokkade, ten opzichte van controles. Verder, de nutteloze Gamma-delta Intraepithelial Lymphocyten had langere verblijf-tijden, en werden vaker gelokaliseerd binnen de laterale intercellulaire ruimte, in vergelijking met motile Gamma-delta Intraepithelial Lymphocyten. Het kan moeilijk zijn om velden van villi die overmatige beweging als gevolg van peristaltiek te identificeren.Het herpositioneren van de muis kan helpen bij het vinden van een stabieler veld. Verdere analyse van de cel-tracking gegevens kan helpen om specifieke beweeglijkheid gedrag te identificeren, of om extra statistieken voor het meten van cellulaire interacties. Intravital Imaging en analyse van IEL-beweeglijkheid is een standaard uitlezing van IEL-functie geworden, die inzicht geeft in hoe aangeboren immuunsignalering Gamma-delta IEL-functie reguleert.

intravital-imaging-intraepithelial-lymphocytes-murine-small

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een techniek voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de lies lymfeklier (LN) is geschetst. Een dergelijke techniek maakt het mogelijk voor...

Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time...

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

This video demonstrates the visualization of γδ intraepithelial lymphocytes (IELs) in transgenic mice using confocal microscopy. The surgical procedure involves creating a perforation line and making a longitudinal incision to expose the intestinal mucosa and villi. The transgenic mice express reporter proteins exclusively in γδ IELs, allowing their tracking. Intravital imaging captures the dynamic movement of green fluorescence-labeled γδ IELs along the intestinal epithelial cell's basement...

Intravital Visualization of Gamma Delta Intraepithelial Lymphocytes

Door het gebruik van transgene reportermuizen en injecteerbare fluorescerende labels, maakt langdurige intravitale spinning disk confocale microscopie directe visualisatie mogelijk van het gedrag van myeloïde cellen in darmadnomen in het ApcMin/+ colorectaal kankermodel.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier presenteren we een methode om beelden van de darm te verkrijgen bij laser-geïnduceerde verwonding. Door de darm van de muis bloot te stellen aan een multifotonenlaser, wordt het verlies van een enkele of meerdere crypt(en) lokaal geïnduceerd. Door het beschadigde gebied gedurende maanden herhaaldelijk in beeld te brengen, wordt de real-time dynamiek van darmherstel vastgelegd.

Laserablatie en intravitale microscopie om intestinale remodellering te bestuderen

Leer intravitale beeldvorming van epitheliale lymfocyten in de dunne darm van muizen met behulp van omgekeerde spinning disk confocale microscopie. Deze techniek maakt real-time tracking van levende immuuncellen mogelijk.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Meer video's verkennen