Name: Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Leer hoe u menselijke parodontitis ligament cel sferoïden kweekt op chitosan films voor regeneratieve geneeskunde. Deze 3D-cultuurmethode verbetert zelfvernieuwing en osteogene differentiatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gesponsord door National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), fundamenteel Onderzoekfondsen voor de centrale universiteiten (1504219050), Natural Science Foundation van Shanghai (17ZR1432800), en Shanghai Medical Exploration project ( 17411972600).

Het studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de school en het ziekenhuis van stomatologie, Tongji University. Alle patiënten hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven.
1. PDL cel isolatie
<ol><li>Maak proliferatie medium voor cultuur van PDL cellen: α-MEM medium aangevuld met 10% FCS en 100 U/mL pen/keelontsteking.</li>
	<li>Bereid een container met ijs voor de overdracht van geïsoleerde derde kiezen.</li>
	<li>Steriliseren chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf.</li>
	<li>Uittreksel normale menselijke beïnvloed derde molaren van volwassenen (18-28 jaar) op de tandheelkundige kliniek van school en ziekenhuis van stomatologie, Tongji University.</li>
	<li>Plaats derde molaren in het proliferatie middel en breng in het laboratorium bij 4 °C over.</li>
	<li>Plaats de geëxtraheerde tand in een steriel 100 mm Petri schaaltje, werkend binnen een laminaire stromings kap.</li>
	<li>Voeg 10 mL PBS toe om de geëxtraheerde tand te wassen. Herhaal de wassen stap tweemaal.</li>
	<li>Door het gebruik van een steriel scalpel, zachtjes scheiden van de PDL van de wortel. Opmerking: PDL moet worden geschraapt uit het middelste derde deel van de wortel om verontreinigingen te voorkomen van gingivale of apicale weefsels.</li>
	<li>Mince PDL in 1-2-mm fragmenten met de hulp van een gesteriliseerd scalpel mes.</li>
	<li>Plaats PDL fragmenten in een T-25 kweek kolf, gevuld met 3-4 mL proliferatie medium.</li>
	<li>Kweek de monsters in een incubator bij 37 °C in 5% CO2 met bevochtigde lucht.</li>
	<li>Verander het cultuurmiddel na uitgroei van PDL cellen werd waargenomen. Het duurt meestal 1-2 weken voor de uitgroei van PDL cellen. Observeer de uitgroei van PDL cellen via een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.</li>
	<li>Verander het kweekmedium tweemaal per week daarna.</li>
	<li>Wanneer PDL cellen hebben bereikt samenvloeiing, sub-cultuur cellen op ratio van 1:4 (passage 1).</li>
	<li>Observeer de celgroei dagelijks en verander de cultuurmedium twee keer per week.</li>
	<li>Voer elke volgende passage op ratio van 1:4 na de cellen te bereiken 80% samenvloeiing. Gebruik derde-tot vijfde generatie van PDL-cellen voor cel zaaien.</li>
</ol>2. bereiding van Chitosan films
<ol><li>Voor de bereiding van een 1% (v/v) azijnzuur-oplossing voegt u 5 mL azijnzuur toe aan 495 mL dubbel gedistilleerd water in een glazen bekerglas.</li>
	<li>Voor de bereiding van 1% w/v Chitosan oplossing, Weeg 5 g Chitosan poeder (gemiddeld molecuulgewicht 400 kDa, 85% graad van acetylatie) en voeg toe aan 495 mL van 1% (v/v) azijnzuur oplossing.</li>
	<li>Roer de voor bereide oplossing voor 24 uur met roeren bar en magnetische roeren plaat op 60 ° c.</li>
	<li>Autoclaaf de voor bereide oplossing om volledige ontbinding van Chitosan te verzekeren. Opmerking: het experiment kan in dit stadium worden onderbroken.</li>
	<li>Om Chitosan films te vormen, voeg 1% w/v Chitosan oplossing in weefselcultuur polystyreen (TCPS) schotels bij 0,25 mL/cm2toe. Bijvoorbeeld, Voeg 0,5 mL van 1% w/v Chitosan oplossing om een goed van 24-goed plaat.</li>
	<li>Droge TCPS gerechten in een oven op 60 °C voor 24 uur tot Chitosan films te vormen.</li>
	<li>Bereid 0,5 N natriumhydroxide (NaOH). Roer 10 g NaOH, een beetje in een tijd, in een groot volume van dubbel gedistilleerd water met behulp van de magnetische roer Bar, en Verdun de oplossing om 0,5 L te maken. Nota: Voeg NaOH aan water toe--voeg geen water aan stevige NaOH toe. Raak NaOH niet aan! Het kan leiden tot chemische brandwonden.</li>
	<li>Neutraliseer Chitosan films met 0,5 N NaOH. Voeg 0,5 mL van 0,5 N NaOH oplossing om een put van 24-Well plaat voor 2 uur.</li>
	<li>Was Chitosan films drie maal met dubbel gedistilleerd water. Opmerking: het experiment kan in dit stadium worden onderbroken.</li>
	<li>Voorafgaand aan cel zaaien, steriliseren de Chitosan-Coated 24-Well platen in 70% alcohol overnachting bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel Chitosan-gecoate platen drie maal met PBS bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Steriliseren Chitosan-gecoate platen door behandeling onder Ultravioletlicht 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
</ol>3. Cell zaaien
<ol><li>Pre-warm proliferatie middelgrote PBS oplossing en trypsine/EDTA oplossing aan 37 °C.</li>
	<li>Gooi de bovendrijvende van de T-75 Cell Culture kolf.</li>
	<li>Was confluente PDL-cellen met 10 mL PBS-oplossing.</li>
	<li>De PBS-oplossing verwijderen.</li>
	<li>Voeg 1 mL trypsine/EDTA-oplossing toe aan T-75 Cell Culture kolf.</li>
	<li>Incubeer cellen met trypsine/EDTA-oplossing voor 3 min bij 37 °C.</li>
	<li>Beëindig het spijsverteringsproces van trypsine door 3 mL proliferatie middel aan T-75 cel cultuur kolf toe te voegen.</li>
	<li>Breng de voor bereide cel schorsing in een 15 mL kegel centrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie gedurende 5 min bij 300 x g en kamertemperatuur.</li>
	<li>Gooi de bovendrijvende van de 15 mL kegel centrifugebuis en de cel pellet in 500 µ L van proliferatie medium opnieuw op te schorten.</li>
	<li>PDL-cellen tellen met een hemocytometer.</li>
	<li>Zaad PDL cellen op de dichtheid van 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104, en 6 x 104 cellen/cm2.</li>
	<li>De PDL cellen van de cultuur op Chitosan films in een incubator bij 37 °C in 5% CO2 met bevochtigde lucht.</li>
	<li>Verander het kweekmedium tweemaal per week daarna.</li>
	<li>Op dagen 1, 2, 3, 4, en 5, observeer de cel morfologie dagelijks via een omgekeerde fasecontrastmicroscoop.</li>
</ol>4. cel overleving
<ol><li>Na 1, 3 en 6 dagen van cultuur, bepalen het voortbestaan van de cellen met behulp van een commerciële levensvatbaarheid/chemo Kit.</li>
	<li>Maak in een buis van 15 mL 2 mL van een nieuwe oplossing van 2 mM calceïne-AM en 4 mM ethidium homodimer in PBS door voor 5 s te vortexen. Opmerking: Houd het proces in het donker.</li>
	<li>Verwijder het kweekmedium en was sferoïden in PBS.</li>
	<li>Incubeer sferoïden in van PBS met 2 mM calceïne-AM en 4 mM ethidium homodimer voor 30 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Spoel sferoïden tweemaal in PBS. Voor sferoïden van één put van 24-goed plaat, gebruik 2 mL PBS voor elke keer.</li>
	<li>Observeer de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop met 10x of 20x vergroting.</li>
</ol>

<ol><li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li>
<li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li>
<li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration%3A+current+approaches+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li>
<li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li>
<li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li>
<li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li>
<li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Activities+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.+Biomolecules+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li>
<li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).</li>
<li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li>
<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De huidige studie introduceerde een 3D-cel cultuursysteem om enkele beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur te overwinnen. Volgens het Protocol, werden PDL cellulaire sferoïden met succes gevormd door kweken cellen op Chitosan films. Onze vorige studie meldde dat sferoïde vorming verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen14. In plaats van het gebruiken van een enzym om cellen van TCPS te oogsten, zou de cel sferoïden van PDL ...

Parodontitis, voornamelijk geïnitialiseerd door tandplaque1, wordt gekenmerkt door de schade van parodontitis met inbegrip van PARODONTITIS (PDL), alveolaire bot, en cementum. Huidige behandelingen voor parodontitis zijn meestal succesvol in het voorkomen van de voortgang van de actieve ziekte, maar de regeneratie van verloren parodontitis weefsels blijft een klinische uitdaging. Onlangs is belangrijke vooruitgang geboekt in de cel-gebaseerde benaderingen voor parodontitis weefselregeneratie om de nadelen van de huidige behandelingen te overwinnen2,3,4.
Onze vorige systematische herziening bleek dat PDL cellen groot potentieel voor parodontitis regeneratie5toonde. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur6. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microenvironment7. In vergelijking met cellen gekweekt op 2D substraten, cellen geteeld in een 3D-omgeving vertonen meer gelijkenissen met in vivo cellen8. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur.
Conventionele 3D-cultuurmethode is inkapselen van cellen in 3D biomaterialen. Vergeleken met cellen ingekapseld in 3D biomaterialen, cellulaire sferoïden na te bootsen de in vivo situatie nauwer omdat sferoïden zijn aggregaten van cellen groeien vrij van buitenlandse materialen9,10,11, 12. men rapporteert dat cellulaire sferoïden MSC bioactiviteiten bevorderde via het behoud van extracellulaire matrijs (ECM) componenten met inbegrip van fibronectine en laminin13. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-PDL Cell cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films14. De vorming van sferoïde verhoogde de zelf-vernieuwing en osteogene differentiatie capaciteiten van PDL cellen14. Hier presenteren we gedetailleerde PDL Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de tekortkomingen in verband met conventionele TCPS cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Gibco</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>azijnzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurfles 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurfles 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Heppe Medical&nbsp;Chitosan GmbH</td><td>/</td><td>moleculair gewicht 500 kDa, mate van deacetylering 85%</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Molecular&nbsp;Probes</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td>KGB5001</td><td></td></tr><tr><td>pen/strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA&nbsp;</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td>KGM25200</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische centrifugeerbuis</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr></tbody></table>

vorming van menselijke parodontitis ligament cell sferoïden op chitosan films

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Parodontitis ligament (PDL) cellen houden grote belofte voor parodontitis weefselregeneratie. Conventioneel worden PDL-cellen gekweekt op twee-dimensionale (2D) substraten zoals weefselcultuur polystyreen (TCPS). Nochtans, zijn de kenmerkende veranderingen van PDL cellen waargenomen tijdens in vitro cultuur. Dit fenomeen is waarschijnlijk omdat de 2D TCPS verschilt van de in vivo driedimensionale (3D) microomgeving. In vergelijking met cellen die op 2D-substraten worden gekweekt, vertonen cellen in een 3D-omgeving meer gelijkenissen met in vivo cellen. Daarom, 3D-cel cultuur modellen bieden een veelbelovend alternatief voor conventionele 2D monolayer Cell cultuur. Ter verbetering van conventionele PDL Cell cultuur modellen, hebben we onlangs ontwikkelde een 3D-cel cultuurmethode, die is gebaseerd op sferoïde vorming van PDL cellen op Chitosan films. Hier presenteren we gedetailleerde Cell sferoïde cultuur protocollen op basis van Chitosan films. De 3D-cultuursysteem van PDL cellulaire sferoïden overwinnen enkele van de beperkingen met betrekking tot conventionele 2D monolayer cel cultuur, en kan dus geschikt zijn voor het produceren van PDL cellen met een verbeterde therapeutische werkzaamheid voor de toekomst parodontitis weefselregeneratie.

Met behulp van de huidige protocol, levensvatbare PDL Cell sferoïden werden met succes gevormd. Figuur 1 toonde aan dat zwevende cellen of sferoïden in plaats van bijgevoegde cellen vooral werden waargenomen op Chitosan films. Voor de het zaaien dichtheid van 0,5 x 104 cellen/cm2, werden de in bijlage PDL cellen nu en dan gevonden op dag 1 en 3, en PDL de cel sferoïden werden zelden waargenomen. In tegendeel, voor de het zaaien dichtheid...

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

Dit is een gedetailleerd protocol van het kweken van parodontale ligament cel sferoïden door chitosan films. Vergeleken met het conventionele kweeksysteem produceert het sferoïde kweeksysteem parodontale ligamentcellen met verhoogde zelfvernieuwing en osteogene differentiatievaardigheden. Om te beginnen, bereid 1%gewicht-tot-volume chitosan oplossing zoals aangegeven in het manuscript.Voeg 0,5 milliliter chitosan oplossing in elke put van een 24-well weefsel cultuur polystyreen plaat. Droog de plaat in een oven op 60 graden Celsius gedurende 24 uur om chitosan films te vormen. Om de chitosan films te neutraliseren, voeg 0,5 milliliter van 0,5 normale natriumhydroxide toe aan elke put van de 24-put plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur.Was vervolgens de chitosanfilms drie keer met dubbel gedestilleerd water. Steriliseer de chitosan-gecoate 24-well plaat in 70% alcohol 's nachts bij kamertemperatuur. Spoel de plaat drie keer met PBS en laat hem 's nachts onder ultraviolet licht achter.Voorafgaand aan cel zaaien, pre-warme proliferatie medium, PBS oplossing, en trypsine EDTA oplossing tot 37 graden Celsius. Gooi de supernatant uit de celkweekkolf en was de samenvloeiende parodontale ligament, of PDL-cellen, met 10 milliliter PBS. Gooi de PBS en voeg een milliliter trypsine EDTA-oplossing toe aan de kolf.Incubeer de kolf op 37 graden Celsius gedurende drie minuten en voeg vervolgens drie milliliter proliferatiemedium toe om de trypsinevertering te beëindigen. Breng de celsuspensie over op een conische buis van 15 milliliter en vercenter het vijf minuten op 300 keer g. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 500 microliter proliferatiemedium.Tel de cellen met een hemocytometer en zaad ze op de plaat op vijf, 10, 30 en 60 duizend cellen per vierkante centimeter. Kweek de PDL-cellen in een couveuse bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide en bevochtelde lucht, waardoor het kweekmedium twee keer per week verandert. Observeer celmorfologie dagelijks gedurende vijf dagen via een omgekeerde fase contrastmicroscoop.Levensvatbare PDL-celferoïden worden met succes gevormd met behulp van dit protocol. Sferoïden worden zelden waargenomen voor de lagere zaaidichtheid op dag één en drie. Maar bij de twee hogere dichtheden zijn vanaf dag één verschillende maten sferoïden aanwezig.De optimale zaaidichtheid is 30 duizend cellen per vierkante centimeter omdat het resulteert in homogene sferoïden. Na vijf dagen van cultuur, grotere sferoïden worden waargenomen voor alle zaaien dichtheden. Een levensvatbaarheidstest toont aan dat de meerderheid van de PDL-cellen in leven zijn op dag één, drie en zes, maar het aantal dode cellen neemt toe op dag zes.Een beperking van dit protocol is de verminderde proliferatie van cellen na sferoïde vorming. Dus verdere studies ter bevordering van de proliferatie van cellen na sferoïde vorming zijn vereist.

formation-human-periodontal-ligament-cell-spheroids-on-chitosan

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De vervaardiging van een nieuwe, flexibele dunne film chirurgische kleefmiddel van FDA goedgekeurde ingrediënten, chitosan en indocyaninegroen beschreven. Binding van deze lijm collageenachtig weefsel via een eenvoudige activeringsproces met een laag vermogen infrarode laser wordt aangetoond.

Een Chitosan Based, Laser Geactiveerde Thin Film Chirurgische lijm, &#39;SurgiLux&#39;: Voorbereiding en demonstratie

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Wij presenteren een model van ligamentweefsel waarin driedimensionale constructen worden behandeld met het menselijk oefenconditionerende serum en geanalyseerd voor collageengehalte, functie en cellulaire biochemie.

Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Wij ontwikkeld een heterogene borst kanker model bestaande uit vereeuwigd tumor en fibroblast cellen ingebed in een bioprintable alginaat/gelatine bioink. Het model recapituleert de tumor in vivo communicatie en vergemakkelijkt de vorming van meercellige tumor spheroïden, inzicht in de mechanismen van tumorvorming rijden oplevert.

Bioprintable alginaat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemen induceren sferoïde celvorming

Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.

Voortplanting van tandheelkundige en respiratoire cellen en organen in microzwaartekracht

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

In deze studie wordt een rattenmodel van inductie van parodontitis gepresenteerd via een combinatie van retentieve ligatuur en repetitieve injecties van lipopolysaccharide afgeleid van Porphyromonas gingivalis, gedurende 14 dagen rond de eerste maxillaire kiezen. De ligatie- en LPS-injectietechnieken waren effectief in het induceren van peridontitis, resulterend in alveolair botverlies en ontsteking.

Inductie van parodontitis via een combinatie van ligatuur en lipopolysaccharide-injectie in een rattenmodel

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Deze studie beschrijft een aangepaste 6-0 nylon ligatiemethode voor het induceren van parodontitis bij muizen, die zeer reproduceerbaar is en een alternatief vormt voor onderzoekers om parodontitis te bestuderen, van de ontwikkeling tot de pathologische gevolgen.

muismodel van gevorderde parodontitis geïnduceerd door nylon ligatuur in de tweede bovenkies

Leer hoe u menselijke parodontitis ligament cel sferoïden kweekt op chitosan films voor regeneratieve geneeskunde. Deze 3D-cultuurmethode verbetert zelfvernieuwing en osteogene differentiatie.

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

Meer video's verkennen