Name: Beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer hoe je langdurige depressie induceert in cerebellaire Purkinje-cellen met behulp van elektrofysiologische patch-clamp technieken in genetisch gemanipuleerde dieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken A. Oba voor haar technische assistentie. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gesteund door subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek (C) 17K01982 tot K.Y.

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de RIKEN-Commissie voor de verzorging en het gebruik van dieren in experimenten. Muizen werden bewaard in de dieren faciliteit van het RIKEN centrum voor hersen wetenschappen onder goed gecontroleerde temperatuur (23 – 25 °C) en vochtigheid (45% – 65%) Voorwaarden. Zowel mannelijke als vrouwelijke WT muizen (C57BL/6, 3 – 6 maanden) werden gebruikt.
1. voorbereiding van de in de experimenten gebruikte oplossingen
Opmerking: Alle oplossingen moeten worden gemaakt in ultrapuur watervrij van metalen (weerstand > 18,2 MΩ) en andere onzuiverheden (totale organische koolstof (TOC) < 5,0 ppb). Werken kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) voor slice-Cutting en opname worden vers gemaakt op de dag van het experiment van een 10 keer (X10) voorraad van ACSF. Bel de oplossingen met 5% CO2/95% O2 gasmengsel voor gebruik. De pH van de ACSF wordt aangepast tot 7,4 ± 0,1 en de osmolariteit wordt aangepast 315 ± 5 mOsm/kg door het toevoegen van ultrapuur water.
<ol><li>Bereid 10x voorraad ACSF met 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2po4, en 260 mm NaHCO3. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>
Voorbereiding ACSF met 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mm mg2dus4, 1,25 mm Nah2po4, 26 mm NaHCO3 en 20 mm glucose.
	<ol>
<li>Voeg eerst 1 mL 2 M CaCl2 -oplossing toe, gevolgd door 1 ml van 1 m mg2, dus4 -oplossing in ongeveer 800 ml ultrapuur water, om neerslag te voorkomen. Voeg vervolgens 100 mL 10x ACSF en glucose toe. Tot slot, make-up tot een totaal volume van 1.000 mL door het toevoegen van ultrapuur water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid 3,3% agar voor Brain handling. Los 1 g agar op in 30 mL 0,9% NaCl-oplossing en verwarm in een magnetron tot het gewoon kookt. Roer om te mengen, giet het vervolgens in een steriele 4 cm x 10 cm plastic doos en laat het stollen. Bewaar de agar-plaat (CA. 8 mm dik) in een koelkast.</li>
	<li>
Bereid de interne oplossing voor.
	<ol>
<li>Bereid de K+-gebaseerde interne oplossing met 60 mm kcl, 60 mm K-gluconaat, 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP en 30 mm hepes (pH 7,2). Opmerking: Lage concentratie (0,3 mM) van EGTA, een langzame CA2 +-chelator, wordt toegevoegd aan chelaat mogelijk verontreinigd CA2 + in zuiver water, maar deze lage concentratie van EGTA in de interne oplossing blokkeert nooit de inductie van Ltd (Figuur 3, Figuur 4, Figuur 5) tijdens het opnemen van de gehele cel. De gemeten osmotische druk is 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Bereid de op CS+gebaseerde interne oplossing met 60 mm cscl, 46 mm D-gluconaat, 27 mm tetraethylammoniumchloride (Tea-cl), 0,3 mm EGTA, 4 mm MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mm GTP en 30 mm hepes (pH 7,2, aangepast met behulp van CsOH). Opmerking: CS+ blokkeert spannings afhankelijke K-kanalen en verbetert de ruimte-klem condities bij externe dendrites door de lengte-constante te verhogen. De gemeten osmotische druk is 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Bereid 200 μL aliquots van de oplossingen en bewaar bij-30 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hersen dissectie en trimmen
<ol><li>Chill en zuurstofhoudende verbinding 2 50 ml bekerglazen van acsf op ijs tot de temperatuur lager is dan 4 °c. Voeg 50 μL tetrodotoxine (TTX, 1 mM) toe aan een van de ijskoude bekers van ACSF en Reserveer deze voor plakjes snijden. Voor het verkrijgen van muis cerebellaire slice reserveren LTD-inducerende vermogen, de toevoeging van TTX aan de normale ACSF is noodzakelijk.</li>
	<li>Koel de metalen specimen tray af door een ijsbad van de snij kamer met ijs te vullen.</li>
	<li>Giet 1 ml Isofluraan in een anesthetiserende pot (~1000 ml) en plaats er vervolgens een muis in voor 30 – 45 s. Zorg ervoor dat de muis diep verdoerd is door het onvermogen te bevestigen om te reageren op mechanische stimulatie.</li>
	<li>Onthapitate de muis met behulp van een chirurgische schaar. Houd het hoofd vast en snijd de oppervlakkige huid langs de middenlijn met behulp van een oogheelkundige schaar. Trek de huid door met de vingers te houden om het oppervlak van de schedel op grote schaal bloot te leggen.</li>
	<li>Snijd de schedel horizontaal langs een lijn van het grote SpinoCerebellaire gat net boven het oor en oog met behulp van een oogheelkundige schaar. Snijd de schedel langs een lijn boven beide ogen en verwijder om de schedel te isoleren.</li>
	<li>Snijd de hersenen in het midden van hersenen met behulp van een scalpel, Isoleer vervolgens het caudale deel van de hersenen met inbegrip van het cerebellum uit de schedel. Dompel het onder in een ijskoude Beker van ACSF. Gewoonlijk moet de totale tijd van onthoofding tot onderdompeling van het hersen blok in het voorgekoelde bekerglas van ACSF minder dan 60 s zijn.</li>
	<li>De positie van de borrelende slang moet zodanig worden afgesteld dat het hersen blok niet in het bekerglas wordt roeren. Mechanische beschadiging kan zwelling van het segment veroorzaken tijdens het opnemen. Laat het minstens 7 minuten staan en laat de hersenen afkoelen.</li>
	<li>Snijd een rechthoekig agar-stuk (2 cm x 2 cm) van een grote agarplaat (4 cm x 10 cm, bewaard bij 4 °C) en leg het op een filtreerpapier om de overtollige vloeistof op te vangen om het hersen blok in te korten.</li>
	<li>Draai het agar-stuk ondersteboven op het filtreerpapier en plaats het agar-stuk op een filtreerpapier op een voorgekoelde metalen preparaat lade (16 cm x 20 cm). Pak het hersen blok met behulp van een spatel en absorbeer overmatige vloeistof eromheen met een stukje filtreerpapier.</li>
	<li>Monteer het hersen blok op het agar-blok met lijm (Medical cyanoacrylaat snellijm). Zorg ervoor dat de onderkant (ventrale zijde) van het hersen blok aan de agar wordt bevestigd.</li>
	<li>Knip de rechter hemisfeer af met een lemmet. Zorg ervoor dat de zijkant van het snijvlak zo parallel mogelijk is aan het dendritische vlak van de PC, omdat deze zijde aan het oppervlak van de preparaat lade is bevestigd. Knip en verwijder de andere kant van de hemisfeer. Snijd vervolgens de hersenen tussen de superieure en inferieure colliculi, en afgesneden van het ruggenmerg.</li>
	<li>Lijm de rechterkant van het bijgesneden cerebellum met het agar-blok op de voorgekoelde preparaat lade. Verdeel overtollige lijm rond het cerebellum met het platte deel van een spatel, om te voorkomen dat overtollige lijm zich aan het cerebellaire-oppervlak hecht. Kantel het metalen bakje en giet ACSF om de lijm te fixeren en de overtollige lijm weg te spoelen.</li>
</ol>3. Brain slicing
<ol><li>Oriënteer het monster zodanig dat de rugzijde van het cerebellum zich aan de voorzijde bevindt. Giet ijskoud snijden ACSF, met 1 μM TTX, voldoende om het cerebellum volledig onder te dompelen. Plaats een gasbuis in de ACSF en begin te borrelen met O2/co2 gasmengsel.</li>
	<li>Verwijder het Arachnoid Mater met een fijne pincet onder een verrekijker. Snijd de cerebellaire bloem met een lemmet en verwijder de hersenstam en het agar-blok. Draai de lade 180 °, zodat het rugoppervlak van het cerebellum wordt geconfronteerd met een RazorBlade.</li>
	<li>Stel de Blade in en pas de eerste snij locatie aan. Stel de parameters vibratome snijden in op het volgende: amplitude tot 5,5, frequentie tot 85 Hz, snelheid naar 3 – 4 en segment dikte tot 300 μm.</li>
	<li>Breng de cerebellaire slice op een nylon-net over in een acrylaat incubator en dompel het segment volledig onder in de zuurstoomhoudende ACSF. De incubator moet in een waterbad worden geplaatst dat een temperatuur van 26 °C handhaaft.</li>
	<li>Bewaar de segmenten ten minste 1 uur om de beschadiging tijdens het snijden te herstellen.</li>
</ol>4. whole-Cell patch-klem opname
Opmerking: Een patch-klem opname vereist volgende apparatuur: een rechtopstaande Microscoop met infrarood differentieel interferentie contrast (IR-DIC) optiek, een patch-klem versterker, data digitizer, digitale stimulator, isolator, computer, software voor data-acquisitie en analyse, gemotoriseerde manipulator, Microscoop platform, vibratie isolatie tafel, Faraday kooi, oplossing verwarmingssysteem, peristaltische pompen en elektrode puller.
<ol><li>Voeg picrotoxin (0,1 mM) toe aan ACSF en los het op met ultra-sonicatie gedurende 3 minuten.</li>
	<li>Parfumeer een opname kamer met picrotoxine-bevattende, O2-co2-verzadigde acsf met een snelheid van 2 ml/min. Houd de temperatuur van de opname kamer bij ongeveer 30 °c.</li>
	<li>Maak een opname-elektrode door het trekken van een borosilicaatglas capillair met gloeidraad (buitendiameter = 1,5 mm) met behulp van een trekker met 4 stappen. De tip-diameter moet ongeveer 1 μm zijn.</li>
	<li>Maak een stimulerende elektrode door dezelfde capillaire met behulp van de trekker met 2 stappen te trekken en breek vervolgens om een fijne tip te produceren door de punt tegen een ijzeren blok onder een Verrek bare Microscoop te slaan. De uiteindelijke diameter moet 3 – 5 μm zijn.</li>
	<li>Breng het cerebellaire segment over naar de opname kamer en bevestig het met een PT-gewicht met nylon draden. Vul een stimulerende elektrode met ACSF.</li>
	<li>Voor stimulatie van de PFs, plaats de stimulerende elektrode op het oppervlak van de moleculaire laag, rond 50 μm weg van de Purkinje cellaag.</li>
	<li>Voor stimulatie van de CF, plaats de stimulerende elektrode aan de onderkant van de Purkinje Cell Layer (stappen 5,3, 5,4).</li>
	<li>Filter K+-gebaseerde of op CS+gebaseerde interne oplossing met een 0,45 μm filter. Gebruik een micro lader om een opname-elektrode te vullen met een interne oplossing van 8 μL.</li>
	<li>Breng een zwakke positieve druk aan op de opname-elektrode voordat u deze in de ACSF gaat onderdompelen. De weerstand moet 2 – 4 MΩ zijn en het vloeibare junctieve potentieel moet worden gecorrigeerd.</li>
	<li>Benaderen van de gezonde, heldere cel lichaam van de PC met de opname-elektrode. Duw het oppervlak van de Purkinje-cel lichtjes, stop met het toepassen van positieve druk, breng vervolgens negatieve druk aan totdat een Giga-Ohm-zegel wordt gevormd. Stel vervolgens de configuratie van de hele cel in met behulp van negatieve druk.</li>
	<li>Houd het membraanpotentiaal bij-70 mV en breng-2 mV Pulse (duur, 100 MS) bij 0,1 Hz aan om de Ingangsweerstand, serieweerstand en ingangscapaciteit continu te bewaken. Gebruik de serieweerstand compensatie niet. Gooi gegevens weg wanneer de serieweerstand met meer dan 15% varieert.</li>
</ol>5. inductie van LTD
<ol><li>Stimuleer de moleculaire laag met een puls (duur, 0,1 MS). Identificeer de PF-excitatory postsynaptische stromingen (EPSC) door het toepassen van een dubbele impuls stimulus (interspike interval (ISI) van 50 MS). De PF-EPSC moet gepaarde pulsfacilitering en geleidelijke toename van de amplitude vertonen ten opzichte van de toename van de stimulatie intensiteit.</li>
	<li>Noteer de testrespons van de PF-EPSC door een enkele puls toe te passen op 0,1 Hz. Pas de intensiteit van de stimulus aan, zodat de opgeroepen EPSC amplitude rond de 200 pA ligt. Vermijd vervuiling van stroom door het spannings afhankelijke Ionische kanaal.</li>
	<li>Stimuleer de CF aan de onderkant van de Purkinje-cellaag en Identificeer de EPSC die wordt opgewekt door de CF-activatie (door een stimulus met een dubbele impuls toe te passen). De CF-EPSC moet gepaard gaan met een gepaarde puls depressie en een alles-of-geen manier volgens de toename van de intensiteit van de stimulatie. Voor LTD inductie, een enkele stimulans moet worden gebruikt.</li>
	<li>
LTD-inducerende Protocol 1
	<ol>
<li>Met behulp van een elektrode met K+-gebaseerde interne oplossing onder stroom-klem omstandigheden, breng een enkele PF-stimulus en een enkele CF-stimulus tegelijkertijd op 1 Hz gedurende 5 min (300 pulsen) (afbeelding 1a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-inducerende Protocol 2
	<ol>
<li>Met behulp van een elektrode-bevattende K+-gebaseerde interne oplossing onder stroom-klem omstandigheden, toepassen dubbele PF-stimuli (ISI van 50 MS) en enkelvoudige CF-stimulus als de tweede PF-stimulus is samenvallen met CF-stimuli bij 1 Hz gedurende 5 min (Figuur 1b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-inducerende Protocol 3
	<ol>
<li>Gebruik een elektrode met een interne oplossing op basis van CS+onder spannings klem omstandigheden en breng een dubbele PF-STIMULUS (ISI van 50 MS) en een enkele depolariserende spannings stap (-70 tot 0 mV, 50 MS) aan op 1 Hz gedurende 3 minuten, zodat de tweede PF-stimulus gelijk aan het begin van de depolariserende spannings stap (figuur 1c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-inducerende Protocol-4
	<ol>
<li>Gebruik een elektrode met CS+-gebaseerde interne oplossing onder spannings klem condities, breng de PF-stimuli (5x bij 100 Hz) en een enkele depolariserende spannings-stap (-70 tot 0 mV, 50 MS) aan op de soma bij 0,5 Hz gedurende 3 min, gelijktijdig (afbeelding 1d ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Ito, M., Szentagothai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEccles%2C+JC+%22The+Cerebellum+as+a+Neuronal+Machine%22">The Cerebellum as a Neuronal Machine</a>. , Springer. New York. (1967).</li>
<li>Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A theory of cerebellar cortex.</a> Journal of Physiology. 202 (2), 437-470 (1969).</li>
<li>Albus, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+cerebellar+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mathematical+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Theory of cerebellar function.</a> Mathematical Biosciences. 10 (1), 25-61 (1971).</li>
<li>Maekawa, K., Simpson, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fiber+responses+evoked+in+vestibulocerebellum+of+rabbit+from+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fiber responses evoked in vestibulocerebellum of rabbit from visual system.</a> Journal of Neurophysiology. 36 (4), 649-666 (1973).</li>
<li>Ito, M., Shiida, T., Yagi, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+influence+on+rabbit+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+presumably+effected+via+the+cerebellar+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visual influence on rabbit horizontal vestibulo-ocular reflex presumably effected via the cerebellar flocculus.</a> Brain Research. 65 (1), 170-174 (1974).</li>
<li>Ghelarducci, B., Ito, M., Yagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+discharge+from+flocculus+Purkinje+cells+of+alert+rabbits+during+visual+stimulation+combined+with+horizontal+head+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Impulse discharge from flocculus Purkinje cells of alert rabbits during visual stimulation combined with horizontal head rotation.</a> Brain Research. 87 (1), 66-72 (1975).</li>
<li>Robinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+gain+control+of+vestibulo-ocular+reflex+by+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive gain control of vestibulo-ocular reflex by the cerebellum.</a> Journal of Neurophysiology. 39 (5), 954-969 (1976).</li>
<li>Gilbert, P. F. C., Thach, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell activity during motor learning.</a> Brain Research. 128 (2), 309-328 (1977).</li>
<li>Ito, M., Sakurai, M., Tongroach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climbing+fibre+induced+depression+of+both+mossy+fibre+responsiveness+and+glutamate+sensitivity+of+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Climbing fibre induced depression of both mossy fibre responsiveness and glutamate sensitivity of cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Physiology. 324, 113-134 (1982).</li>
<li>Ito, M., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+depression+of+parallel+fiber-Purkinje+cell+transmission+induced+by+conjunctive+stimulation+of+parallel+fibers+and+climbing+fibers+in+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-lasting depression of parallel fiber-Purkinje cell transmission induced by conjunctive stimulation of parallel fibers and climbing fibers in the cerebellar cortex.</a> Neuroscience Letters. 33 (3), 253-258 (1982).</li>
<li>Ekerot, C. F., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+parallel+fibre+synapses+following+stimulation+of+climbing+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of parallel fibre synapses following stimulation of climbing fibres.</a> Brain Research. 342 (2), 357-360 (1985).</li>
<li>Sakurai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+modification+of+parallel+fibre-Purkinje+cell+transmission+in+in+vitro+guinea-pig+cerebellar+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic modification of parallel fibre-Purkinje cell transmission in in vitro guinea-pig cerebellar slices.</a> Journal of Physiology. 394, 462-480 (1987).</li>
<li>Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+potentiation+of+the+synaptic+transmission+between+a+granule+cell+and+a+Purkinje+cell+in+rat+cerebellar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Depression and potentiation of the synaptic transmission between a granule cell and a Purkinje cell in rat cerebellar culture.</a> Neuroscience Letters. 119 (2), 141-144 (1990).</li>
<li>Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+depression+of+AMPA+currents+in+cultured+cerebellar+purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A long-term depression of AMPA currents in cultured cerebellar purkinje neurons.</a> Neuron. 7 (1), 81-89 (1991).</li>
<li>Linden, D. J., Connor, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+postsynaptic+PKC+in+cerebellar+long-term+depression+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Participation of postsynaptic PKC in cerebellar long-term depression in culture.</a> Science. 254 (5038), 1656-1659 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression%3A+characterization%2C+signal+transduction+and+functional+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression: characterization, signal transduction and functional roles.</a> Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cerebellar long-term depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3, 896-902 (2002).</li>
<li>Ito, M., Jastreboff, P. J., Miyashita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+effects+of+unilateral+lesions+in+the+flocculus+upon+eye+movements+in+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific effects of unilateral lesions in the flocculus upon eye movements in albino rabbits.</a> Experimental Brain Research. 45 (1-2), 233-242 (1982).</li>
<li>Nagao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+vestibulocerebellar+lesion+upon+dynamic+characteristics+and+adaptation+of+vestibulo-ocular+and+optokinetic+responses+in+pigmented+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of vestibulocerebellar lesion upon dynamic characteristics and adaptation of vestibulo-ocular and optokinetic responses in pigmented rabbits.</a> Experimental Brain Research. 53 (1), 36-46 (1983).</li>
<li>Watanabe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+events+correlated+with+long-term+adaptation+of+the+horizontal+vestibulo-ocular+reflex+in+the+primate+flocculus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neuronal events correlated with long-term adaptation of the horizontal vestibulo-ocular reflex in the primate flocculus.</a> Brain Research. 297 (1), 169-174 (1984).</li>
<li>van Neerven, J., Pompeiano, O., Collewijn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABAergic+and+noradrenergic+injections+into+the+cerebellar+flocculus+on+vestibulo-ocular+reflexes+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of GABAergic and noradrenergic injections into the cerebellar flocculus on vestibulo-ocular reflexes in the rabbit.</a> Progress in Brain Research. 88, 485-497 (1991).</li>
<li>Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+motor+learning+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of motor learning in the cerebellum.</a> Brain Research. 886, 237-245 (2000).</li>
<li>De Schutter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+long-term+depression+might+normalize+excitation+of+Purkinje+cells%3A+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar long-term depression might normalize excitation of Purkinje cells: a hypothesis.</a> Trends in Neurosciences. 18 (7), 291-295 (1995).</li>
<li>Hansel, C., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+depression+of+the+cerebellar+climbing+fiber-Purkinje+neuron+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-term depression of the cerebellar climbing fiber-Purkinje neuron synapse.</a> Neuron. 26 (2), 473-482 (2000).</li>
<li>Safo, P., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+dependence+of+the+induction+of+cerebellar+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Timing dependence of the induction of cerebellar LTD.</a> Neuropharmacology. 54 (1), 213-218 (2007).</li>
<li>Schonewille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+role+of+LTD+in+cerebellar+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the role of LTD in cerebellar motor learning.</a> Neuron. 70 (1), 43-500 (2011).</li>
<li>Karachot, L., Kado, T. R., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+parameters+for+induction+of+long-term+depression+in+in+vitro+rat+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulus parameters for induction of long-term depression in in vitro rat Purkinje cells.</a> Neuroscience Research. 21 (2), 161-168 (1994).</li>
<li>Hartell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cerebellar+long-term+depression+requires+activation+of+glutamate+metabotropic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Induction of cerebellar long-term depression requires activation of glutamate metabotropic receptors.</a> Neuroreport. 5, 913-916 (1994).</li>
<li>Aiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+cerebellar+long-term+depression+and+impaired+motor+learning+in+mGluR1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice.</a> Cell. 79, 377-388 (1994).</li>
<li>Steinberg, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+mutations+of+the+AMPA+receptor+subunit+GluR2+and+its+interacting+protein+PICK1+eliminate+cerebellar+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo mutations of the AMPA receptor subunit GluR2 and its interacting protein PICK1 eliminate cerebellar long-term depression.</a> Neuron. 46 (6), 845-860 (2006).</li>
<li>Koekkoek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+FMR1+in+Purkinje+cells+enhances+parallel+fiber+LTD%2C+enlarges+spines%2C+and+attenuates+cerebellar+eyelid+conditioning+in+Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deletion of FMR1 in Purkinje cells enhances parallel fiber LTD, enlarges spines, and attenuates cerebellar eyelid conditioning in Fragile X syndrome.</a> Neuron. 47 (3), 339-352 (2005).</li>
<li>Yamaguchi, K., Itohara, S., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+long-term+depression+in+cerebellar+Purkinje+cells+in+mice+carrying+mutated+GluA2+C+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reassessment of long-term depression in cerebellar Purkinje cells in mice carrying mutated GluA2 C terminus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 10192-10197 (2016).</li>
<li>De Schutter, E., Bower, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+membrane+model+of+the+cerebellar+Purkinje+cell+II.+Simulation+of+synaptic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An active membrane model of the cerebellar Purkinje cell II. Simulation of synaptic responses.</a> Journal of Neurophysiology. 71 (1), 401-419 (1994).</li>
<li>Swensen, A. M., Bean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanisms+of+burst+firing+in+dissociated+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanisms of burst firing in dissociated Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience. 23 (29), 9650-9663 (2003).</li>
<li>Fukuda, J., Kameyama, M., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+cytoskeletal+filaments+selectively+reduces+Na+and+Ca+spikes+in+cultured+mammal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Breakdown of cytoskeletal filaments selectively reduces Na and Ca spikes in cultured mammal neurones.</a> Nature. 294 (5836), 82-85 (1981).</li>
<li>Arancillo, M., White, J. J., Lin, T., Stay, T. L., Silltoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+Purkinje+cell+firing+properties+during+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of Purkinje cell firing properties during postnatal mouse development.</a> Journal of Neurophysiology. 113, 578-591 (2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Shimuta, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+integration+in+single+cerebellar+granule+cell+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory integration in single cerebellar granule cell in vivo.</a> eLife. 4, e12916(2015).</li>
<li>Tempia, F., Minlaci, M. C., Anchisi, D., Strata, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+current+mediated+by+metabotropic+glutamate+receptors+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic current mediated by metabotropic glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neurophysiology. 80, 520-528 (1998).</li>
<li>Wang, S. S., Denk, W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+detection+in+single+dendritic+spines+mediated+by+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coincidence detection in single dendritic spines mediated by calcium release.</a> Nature Neuroscience. 3, 1266-1273 (2000).</li>
<li>Kuroda, S., Schweighofer, N., Kawato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+signal+transduction+pathways+in+cerebellar+long-term+depression+by+kinetic+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exploration of signal transduction pathways in cerebellar long-term depression by kinetic simulation.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5693-5702 (2001).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cerebellar+engrams+in+short-term+and+long-term+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct cerebellar engrams in short-term and long-term motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), E188-E193 (2014).</li>
<li>Inoshita, T., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+long-term+depression+in+the+cerebellar+flocculus+during+adaptation+of+optokinetic+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Occurrence of long-term depression in the cerebellar flocculus during adaptation of optokinetic response.</a> eLife. 27, 36209(2018).</li>
<li>Belmeguenai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity+complements+long-term+potentiation+in+parallel+fiber+input+gain+control+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity complements long-term potentiation in parallel fiber input gain control in cerebellar Purkinje cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (41), 13630-13643 (2010).</li>
<li>Ohtsuki, G., Piochon, C., Adelman, J. P., Hansel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SK2+channel+modulation+contributes+to+compartment+specific+dendritic+plasticity+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SK2 channel modulation contributes to compartment specific dendritic plasticity in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 75, 108-120 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verschillen tussen de vier protocollen
In LTD-inducerende protocollen 1 en 2, Cjs 300 keer bij 1 Hz is voldoende voor het opwekken van cerebellaire Ltd. stimulatie frequentie van de CF leek te zijn in een fysiologische bereik, omdat de complexe Spike vuursnelheid in alert volwassen muizen (P60) werd gemeld te zijn 1,25 Hz36. Echter, de CF stimulatie alleen veroorzaakte op lange termijn plasticiteit in het PF-CF Synapse, zoals gebruikt in de protocollen 1 en 2 (<strong cla...

De synaptische organisatie van de bewerkte neuronale netwerken van de cerebellaire cortex, samengesteld uit pc's, moleculaire laag interneuronen (mand en ecoagriturismo late cellen), Golgi cellen, PFs uit submodules cellen, Mossy vezels en klim vezels (CFs), zijn opgehelderd in termen van excitatie/remming en divergentie/convergentie, en het goed georganiseerde circuit diagram heeft gesuggereerd dat het cerebellum is een "neuronale machine"1, hoewel er eerder geen idee over het doel van deze "machine" was. Later stelde Marr voor dat de PFs-invoer naar Pc's een drielaags associatief leer netwerk2vormt. Hij suggereerde ook dat elke CF een cerebrale instructie voor Elemental Movement2overbrengt. Hij veronderstelde dat gelijktijdige activering van PFs en CF zou verbeteren PF-PC Synapse activiteit, en veroorzaken op lange termijn potentiëring (LTP) van de PF-PC Synapse. Aan de andere kant ging Albus ervan uit dat de synchrone activering van PFs en CF resulteerde in Ltd op de PF-PC synapsen3. Zowel de bovenstaande studies interpreteren het cerebellum als een uniek geheugenapparaat, de opname van die in het cerebellaire corticale netwerk leidt tot de vorming van het Marr-Albus model Learning machine model.
Na deze theoretische voorspellingen suggereren twee bewijs lijnen de aanwezigheid van synaptische plasticiteit in het cerebellum. De eerste bewijs lijn werd gesuggereerd door de anatomische organisatie van de flocculus; hier MF trajecten van vestibulaire orgel oorsprong en CF trajecten van retinale oorsprong convergeren op de Pc's4. Dit unieke convergentie patroon suggereert dat een synaptische plasticiteit die zich in de flocculus voordoet, het opmerkelijke aanpassingsvermogen van de vestibulo-oculaire reflex veroorzaakt. Ten tweede ondersteunde de opname van de PCs-respons in de flocculus en de lesioning van de flocculus ook de bovenstaande hypothese5,6,7. Bovendien ondersteunde het PC-ontladings patroon tijdens de aanpassing van de handbeweging van een aap8 de synaptische plasticiteits hypothese, vooral albus's Ltd-hypothese3.
Om de aard van de Synaptische plasticiteit direct te bepalen, herhaalde conjunctie stimulatie (cjs) van een bundel PFs en de CF die specifiek de PC in vivo innert werd aangetoond dat het induceren van Ltd voor de transmissie werkzaamheid van de PF – PC synapsen9, 10,11. In de daaropvolgende in vitro verkenningen met behulp van een cerebellaire slice12 en gekweekte pc's, combinatie van co-gekweekte submodule celstimulatie en olijfcel stimulatie13 of samenwerking van iontophoretisch toegepast glutamaat en somatische depolarisatie14,15 veroorzaakt Ltd. Het signaaltransductie mechanisme aan de basis van de Ltd-inductie werd ook intensief onderzocht met behulp van in vitro preparaten16,17.
Aanpassingen van de VOR en de OKR werden vaak gebruikt voor kwantitatieve evaluatie van genmanipulatie-effecten op cerebellaire motor leren, omdat de vestibule-cerebellaire cortex werd bewezen als de essentiële oorzaak van het adaptieve leren van de VOR18 ,19,20 en de okr19,21 de correlatie tussen falen van Ltd-inductie en bijzondere waardevermindering van gedrags motor leren is opgevat als bewijs dat Ltd een essentiële rol speelt in de motor Leer mechanismen22. Deze standpunten worden gezamenlijk aangeduid als de Ltd-hypothese van motor learning, of Marr-Albus-ito-hypothese23,24,25,26.
Adaptief leren van de oogbeweging werd gemeten met behulp van vergelijkbare protocollen, terwijl verschillende experimentele omstandigheden werden gebruikt voor het induceren van Ltd in segment voorbereiding27,28,29,30,31 . Onlangs meldde Schonewille et al.26 dat sommige met genen gemanipuleerde muizen een normaal motorische leerproces vertoonden, maar de cerebellaire schijfjes toonden Ltd niet, en CONCLUDEERDEN dat Ltd niet essentieel was voor het motor leren. Echter, de inductie van LTD werd alleen geprobeerd met behulp van één type protocol bij kamertemperatuur. Daarom gebruikten we verschillende soorten LTD-inducerende protocollen onder opnamecondities rond 30 °C, en we bevestigden dat de LTD betrouwbaar werd geïnduceerd in de met genen gemanipuleerde muizen door deze protocollen te gebruiken in de buurt van fysiologische temperaturen32.
Er blijven echter enkele vragen over de basiseigenschappen van een conjunctieve stimulatie. De eerste is de relatie tussen de vorm van de complexe Spike en de amplitude van LTD. Ten tweede, in combinatie met PF-stimulatie en somatische depolarisatie, of het aantal gebruikte stimuli noodzakelijk was of niet, was ongrijpbaar. In de huidige studie werden deze vragen onderzocht met behulp van wild type (WT) muizen.

<table><tbody><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillair</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>Elektrode puller</td><td>Sutter</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>Lineaire snijder</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiek pomp</td><td>Gilson</td><td>MP1 Single Channel Pump</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Zuivere watermaker</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Software voor experiment</td><td>Molecular probe-Axon</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Software voor statistiek</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxine</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptische plasticiteit biedt een mechanisme voor leren en geheugen. Voor cerebellaire motor learning, lange termijn depressie (LTD) van synaptische overbrengingen van parallelle vezels (PF) naar Purkinje cellen (PC) wordt beschouwd als de basis voor het leren van de motor, en tekortkomingen van zowel LTD en motorische leren worden waargenomen in verschillende gengemanipuleerde dieren. Gemeenschappelijke motorische leer sets, zoals aanpassing van de optokinetische reflex (OKR), de vestibulaire-oculaire reflex (VOR) en de rotarod-test werden gebruikt voor de evaluatie van het motorische leervermogen. Echter, resultaten verkregen uit de GluA2-Carboxy Terminus gemodificeerde knock-in muizen toonde de normale aanpassing van de VOR en de OKR, ondanks het ontbreken van PF-LTD. In dat rapport werd de inductie van LTD slechts geprobeerd met één type stimulatie protocol bij kamertemperatuur. Zo werden de voorwaarden voor het opwekken van cerebellaire Ltd onderzocht in dezelfde knock-in mutanten met behulp van verschillende protocollen bij de meest fysiologische temperatuur. Tot slot vonden we stimulatie protocollen, waarmee LTD kon worden geïnduceerd in deze met genen gemanipuleerde muizen. In deze studie wordt een reeks protocollen voorgesteld om LTD-inductie te evalueren, waardoor het oorzakelijk verband tussen LTD en motor learning nauwkeuriger kan worden onderzocht. Concluderend, experimentele omstandigheden zijn cruciaal bij het evalueren van LTD in gengemanipuleerde muizen.

In deze studie werden vier protocollen gebruikt om cerebellaire Ltd te induceren. In de eerste twee protocollen (Protocol 1 en 2) werd de combinatie van de PF-stimulatie en de CF-stimulatie toegepast onder stroom-klem condities. In de andere twee protocollen (Protocol 3 en 4) werd somatische depolarisatie vervangen door de CF-stimulatie onder spannings klem condities. Spannings sporen of stroom sporen tijdens de conjunctieve stimulatie werden vergeleken (Figuur 2).
<p class="jove_content...

In sommige genen gemanipuleerd dieren, met behulp van een enkel protocol kan falen om te induceren LTD in cerebellaire Purkinje cellen, en er kan een discrepantie tussen LTD en motorische leren. Er zijn meerdere protocollen nodig om LTD-inductie in gengemanipuleerde dieren te beoordelen. Standaardprotocollen worden weergegeven.

Beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Wanneer een bepaalde eiwitfunctie wordt gewijzigd door genmanipulatie, wordt coördinatie van prikkelend falen en motorische loopstoornissen beschouwd als een noodzakelijke voorwaarde voor oorzakelijk verband tussen LTD en motorisch leren. Hier tonen we het gebruik van meerdere protocollen om LTD te beoordelen die kunnen worden geïnduceerd via compenserende mechanismen bij gengemanipuleerde dieren. Voor het oogsten van de hersenen, chill en oxygenaat twee 50 milliliter bekers van ACSF op ijs.Wanneer de temperatuur van de oplossing lager is dan vier graden Celsius, voeg 50 microliter van een millimolar tetrodotoxine toe aan een van de ijskoude bekers. Om de hersenen te oogsten, houd het hoofd en gebruik oogheelkundige schaar om de oppervlakkige huid langs de middellijn te snijden. Trek de huid handmatig in om het schedeloppervlak op grote schaal bloot te leggen en gebruik de schaar om horizontaal langs de schedel te snijden van het grote spinocerebellargat tot net boven de ogen en oren voordat je de schedel langs een lijn boven beide ogen snijdt.Gebruik een scalpel om de hersenen in het midden van de cerebrum te snijden en het caudale deel van de hersenen, inclusief het cerebellum, te isoleren van de schedel. Dompel het monster onder in het ijskoude bekerglas van ACSF en pas de bubbelbuis aan zodat het hersenblok niet in het bekerglas roert. Gebruik na ten minste zeven minuten een spatel om het hersenblok op te rapen en gebruik een stuk filterpapier om overtollige ACSF op te nemen.Monteer de weefselventilalzijde naar beneden op een stuk van twee bij twee centimeter van agar met een geschikte medische lijm. Gebruik een mes om de rechter hersenhelft van het hersenweefsel zo parallel mogelijk aan het dendritische vlak van de Purkinje cellen uit te snijden. Snijd en verwijder de andere kant van het halfrond en snijd de hersenen tussen de superieure en inferieure colliculi.Snijd het ruggenmerg af en lijm de rechterkant van het getrimde cerebellum met het agarblok op de voorgekoelde monsterlade. Dan, kantelen van het monster lade, giet ACSF op het monster om het weefsel te repareren en weg te wassen overtollige lijm. Om het hersenmonster te snijden, oriënteer het monster zodanig dat de rugzijde van het cerebellum zich aan de voorkant bevindt en genoeg van het ijskoude snijdende ACSF, aangevuld met tetrodotoxine, giet om het cerebellum volledig onder te dompelen.Plaats een gasbuis in de snijoplossing en start borrelen met een zuurstof-koolstofdioxide gasmengsel. Verwijder met behulp van fijne pincetten en vergrootglazen de arachnoïdale mater en verduister de cerebellar peduncle. Na het verwijderen van de hersenstam en agar blok, draai de lade 180 graden, zodat het dorsale oppervlak van het cerebellum gezichten het scheermesje van de vibratome en pas de eerste snijlocatie.Stel de vibratome amplitude in op 5,5 en frequentie op 85 Hertz, de snelheid op drie tot vier en de plakdikte op 300 micrometer. Gebruik een nylon net om de secties in een waterbad van 26 graden Celsius over te brengen naar een acrylverbende en de monsters gedurende ten minste één uur volledig onder te dompelen in verse zuurstofhoudende ACSF. Los voor de rapportage van de hele celpleisters één micromolar picrotoxine in ACSF op door drie minuten te ultasonicatie voordat een opnamekamer van 30 graden Celsius met de toxineoplossing wordt neergedaald met een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut.Breng na een paar minuten een cerebellar-plak over naar de opnamekamer en bevestig het weefsel met een platinagewicht en nylon draden. Vul vervolgens een stimulerende elektrode met verse ACSF. Om de parallelle vezels te stimuleren, plaatst u de stimulerende elektrode op het oppervlak van de moleculaire laag ongeveer 50 micrometer van de Purkinje-cellaag.Voor stimulatie van de klimvezels plaatst u de stimulerende elektrode aan de onderkant van de Purkinje-cellaag en gebruikt u een microloader om een opnameelektrode te vullen met acht microliters van 0,45 micrometer gefilterde kalium of cesiumgebaseerde interne oplossing. Breng een zwakke positieve druk op de opname-elektrode aan voordat u de elektrode in de ACSF dompelt. De elektrodenweerstand moet twee tot vier megaohms zijn en het vloeibare junctionale potentieel moet worden gecorrigeerd.Benader het gezonde heldere cellichaam van een Purkinje-cel met de opnameelektrode en duw het oppervlak van de Purkinje-cel iets. Stop dan met het toepassen van de positieve druk en breng negatieve druk toe totdat een gigaohm-afdichting wordt gevormd. Gebruik vervolgens negatieve druk om een hele celconfiguratie vast te stellen, het membraanpotentieel op min 70 millivolt te houden en een min twee millivolt 100 milliseconde pulsen toe te passen op 0,1 hertz, continue monitoring van de ingangsweerstand, serieweerstand en inputcapaciteit.Voor langdurige depressie inductie, stimuleren van de moleculaire laag met een 0,1 milliseconde puls en breng een dubbele puls stimulus om de parallelle vezel excitatory post-synaptische stromen te identificeren. Een gepaarde pulsfacilitering en geleidelijke toename van amplitude ten opzichte van de toename van de stimulatieintensiteit moeten worden waargenomen. Om de testrespons op te nemen, past u een enkele 0,1 hertz-puls toe en past u de intensiteit van de stimulus aan, zodat de opgeroepen amplitude ongeveer 200 picoamps bedraagt.Stimuleer de klimvezels aan de onderkant van de Purkinje-cellaag en om de parallelle vezel excitatory post-synaptische stromingen te identificeren die door de activering van de klimvezel worden opgewekt, breng een dubbele impulsstimulus toe. Een gepaarde pulsdepressie moet worden waargenomen op een geheel of geen manier in correlatie met de toename van de stimulatie intensiteit. In dit representatieve experiment werd een combinatie van een parallelle vezelstimulatie en één klimvezelstimulatie onder de huidige klemomstandigheden gebruikt voor de slice-voorbereiding.De vorm van de complexe piek opgewekt door de conjunctive stimulatie was vergelijkbaar met die ontlokte door de klimmen vezel stimulatie alleen met de eerste steile spikelet gevolgd door twee tot drie spikelets. Een eveneens gevormde complexe piek werd waargenomen toen een parallelle vezelstimulatie 50 milliseconden later werd gevolgd door een conjunctive tweede parallelle en klimmende vezelstimulatie. In deze test onder spanningsklemomstandigheden met behulp van een op cesium gebaseerde interne oplossing, werd een parallelle vezelstimulatie 50 milliseconden later gevolgd door een gelijktijdige toepassing van een tweede parallelle vezelstimulatie en somatische depolarisatie.Een binnenstroom werd opgewekt bij somatische depolarisatie van min 70 tot nul millivolt en de staartstroom werd ook opgeroepen na repolarisatie. Ten slotte werden vijf parallelle vezelstimuli op 100 hertz gelijktijdig gegeven met de somatische depolarisatie onder spanningsklemomstandigheden. Nogmaals, een repetitieve generatie van innerlijke stromingen werd opgewekt tijdens depolarisatie en de staart stroom werd veroorzaakt na de repolarisatie.Om de relatie tussen cerebellar LTD en motorisch leren bij gengemanimaniseerde dieren te beoordelen, moeten meerdere protocollen worden gebruikt om LTD onder gezellige fysiologische omstandigheden te induceren. Als cerebellar LTD wordt gevisualiseerd in gen-gemanipuleerde dieren na motorisch leren, kan de causale relatie tussen hen directer worden onderzocht.

assessment-long-term-depression-induction-adult-cerebellar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

In this video, a mouse cerebellar brain slice was used to investigate synaptic interactions between parallel fibers, climbing fibers, and Purkinje cells, which are essential for motor control. Stimulation of climbing fibers induced long-term depression (LTD) in Purkinje cells, weakening synaptic strength and resulting in reduced response to parallel fiber stimulation.

Induction of Long-Term Depression in Cerebellar Purkinje Neurons in a Mouse Brain Slice

Studies hebben aangetoond dat cathodale transcraniële gelijkstroom-stimulatie onderdrukkende effecten kan hebben op geneesmiddelresistente epileptische aanvallen. In deze studie werd een in vitro experimentele opstelling bedacht waarin de gelijkstroom-stimulatie en de multi-elektrode array-registratie van aanvallen-achtige activiteit werden geëvalueerd in een herfsnede-preparaat van muizen. De parameters van de gelijkstroom-stimulatie werden geëvalueerd.

Direct-current stimulatie en multi-elektrode Array Registratie van Inbeslagneming-achtige activiteit in de muizen Brain Slice Voorbereiding

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

Hier wordt gedemonstreerd hoe een wakker gesloten-hoofdletselmodel kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van herhaald licht traumatisch hersenletsel (r-mTBI) op synaptische plasticiteit in de hippocampus. Het model repliceert belangrijke kenmerken van r-mTBI bij patiënten en wordt gebruikt in combinatie met in vitro elektrofysiologie.

Het beoordelen van veranderingen in synaptische plasticiteit met behulp van een wakker gesloten-hoofdletselmodel van mild traumatisch hersenletsel

Leer hoe je langdurige depressie induceert in cerebellaire Purkinje-cellen met behulp van elektrofysiologische patch-clamp technieken in genetisch gemanipuleerde dieren.

Beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes

Meer video's verkennen