Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Inositolfosfaat en fosfoinositides zijn metabolieten die verschillende regulerende functies hebben in eukaryoten, waaronder de controle van genexpressie, eiwithandel, signaaltransductie en celontwikkeling. Ze voeren deze regulerende functie uit door zich te binden aan eiwitten, waardoor eiwitconformatie, katalytische activiteit of eiwitinteracties veranderen. De identificatie van eiwitten die zich binden aan inositolfosfaat of fosfoinositides is essentieel om te begrijpen hoe deze metabolieten hun regulerende functie vervullen.

Dit protocol heeft een eenvoudige workflow die gevoelig, niet-radioactief, lyposome vrij en maakt gebruik van reagentia die commercieel beschikbaar zijn. In deze methode wordt een afgewerkte chromatografie met biotinylated inositolfosfaat of fosfoinositides gebruikt om interagerende eiwitten te isoleren, ze worden vervolgens geïdentificeerd door westerse vlek, of massaspectrometrie. Voor bloedstroomvormen, groeien T.brucei cellen tot halverwege log fase in HMI-9 media, aangevuld met 10%FBS, op 37 graden Celsius, met 5%Kooldioxide.

Houd de celdichtheid tussen 800, 000 en 1,6 miljoen cellen per milliliter. Wanneer u klaar bent, centrifugeren de cellen op 1600 keer G, en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant, en voorzichtig resuspend de pellet in 10 milliletres van PBS-G voorverwarmd op 37 graden Celsius om de cellen te wassen.

Centrifugeren de cellen op 1600 keer G en bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de was te voltooien. Herhaal deze wasprocedure nog twee keer. Dan resuspend de pellet in een milliliter van PBS-G.

Breng deze schorsing naar een punt vijf milliliter buis, dan centrifuge op 1600 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en stel de pellet opnieuw op in nulpunt vijf milliliter lysisbuffer, aangevuld met één punt vijf X protease inhibitorcocktail, en een X-fosfataseremmercocktail die voorgekoeld is op ijs om de cellen te lyse. Centrifuge het lysaat op 1400 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Na dit verzamelen supernatant, die de geëxtraheerde parasietproteïnen bevat, in een nieuw één punt vijf milliliter buis voor de bindende testen. Zet 5% van het totale lysaat opzij voor westerse vlekanalyse. Verzamel 50 microliter inositolfosfaten of fosfoinositides geconjugeerd aan agarosekralen, en voeg ze 500 milliliter bindende buffer toe.

Centrifuge op 1000 keer G voor één minuut. Gooi de supernatant weg en verleg de 50 microliter van bindende buffer om de kralen in evenwicht te brengen. Gebruik niet-geconjugeerde kralen als controle, en gebruik kralen met verschillende fosfaatconfiguraties, waaronder niet-fosforyleerde vormen, om te controleren op niet-specifieke interacties.

Voeg vervolgens 50 microliter IP- of PI-kralen toe aan het cellysaat of de gezuiverde eiwitten. Houd het volume van kralen binnen 10% van het totale lysaat. Gebruik indien nodig de bindende buffer om het volume van de bindingsreactie aan te passen.

Broed de reactie voor een uur of 's nachts bij vier graden Celsius, terwijl het draaien op 50rpm. Na deze, centrifuge de mix op 1000 keer G, en op vier graden Celsius voor een minuut. Verwijder de supernatant, en houd de pellet, zorg ervoor dat 5% van de supernatant te houden voor westerse vlek analyse.

Voeg vervolgens een milliliter wasbuffer toe en tik of draai de buis aan om de hars te resuspend. Centrifuge de reactie op 1000 keer G, en op vier graden Celsius gedurende een minuut, en gooi de supernatant. Herhaal dit proces voor een totaal van vijf wasbeurten.

Voeg hierna 50 microliter 2x Laemmli buffer toe, aangevuld met 710 millimolar 2-mercaptoethanol aan de kralen. Tik of vortex te mengen, en verdun de eiwitten. Vervolgens verwarm je vijf minuten op 95 graden Celsius en verhoog je 10.000 keer G gedurende een minuut.

Verzamel de supernatant, en ofwel bevriezen de eluate bij min 80 graden Celsius, of ga naar westerse vlek analyse. De hier gepresenteerde methode wordt gebruikt om de binding van te analyseren door repressor-activator eiwit 1 van T.brucei lysaat, of door recombinant T.brucei repressor-activator protein 1 eiwit. Aangezien RAP1 canonieke PI-bindingsdomeinen mist, worden de bindende tests uitgevoerd met PI's die niet-fosforylated zijn, of die fosforylated zijn op verschillende posities van de inositolring, en met niet-geconjugeerde agarosekralen.

Westerse analyse toont aan dat RAP1 bij voorkeur bindt aan PI(3, 4, 5)P3 kralen, maar dat het ook in mindere mate bindt aan PI(4, 5)P2 kralen. Het heeft zich echter niet aan andere of agarosekralen verbonden. Om te testen of RAP1 zich rechtstreeks aan bindt, wordt een C terminaal gelabeld 6XHis recombinant RAP1 eiwit uitgedrukt en gezuiverd tot homogeniteit van E.Coli.

Westerse blotting toont aan dat het verhogen van de concentratie van PI(3, 4, 5)P3, maar niet PI(4, 5)P2, de interactie van recombinant RAP1 met PI(3, 4, 5)P3 kralen remt. De toevoeging van T.brucei gezuiverd PIP5Pase enzym aan de reactie hersteld PI(3, 4, 5)P3 binding door recombinant RAP1. Dit is te wijten aan PIP5Pase dephosphorylation van vrije PI(3, 4, 5)P3, en geeft dus aan dat het fosforylatiepatroon van deze metaboliet essentieel is voor onze RAP1 binding.

T.brucei eiwitten die binden aan Ins(1, 4, 5)P3 worden vervolgens geïdentificeerd door affiniteit chromatografie gevolgd door massaspectrometrie. SDS-PAGE analyse toont verrijking in eiwitten afkomstig van Ins(1, 4, 5)P3 kralen, in vergelijking met eiwitten ontlokt uit de controle agarose kralen. Massaspectrometrieanalyse van de eluted eiwitten identificeerde meer dan 250 eiwitten waarvan 84 werden verrijkt met Ins(1, 4, 5)P3 kralen, in vergelijking met controle kralen.

De verrijking van eiwitten gebonden aan Ins(1, 4, 5)P3, in vergelijking met controle kralen, correleert met het eiwit signaal gedetecteerd door SDS-PAGE. Een cruciale stap in dit protocol is het gebruik van passende controles, om specifiek te discrimineren van niet-specifieke interacties. We raden aan om niet-geconjugeerde agarosekralen en kralen te gebruiken die zijn geconjugeerd met inositolfosfaat of fosfoinositides, met behulp van verschillende fosfaatconfiguraties, waaronder niet-fosforyleerde vormen.

Deze methode kan worden toegepast op andere eencellige protozoan parasieten, zoals Trypanosoma cruzi, leishmania, of plasmodium. Het kan ook gemakkelijk worden aangepast aan andere organismen, waaronder gist- of zoogdiercellen. Deze methode kan worden gekoppeld aan kwantitatieve massaspectrometrie, zoals SILAC, om dynamische interacties van eiwitten met inositolfosfaat of fosfoinostidden te identificeren.

In kan ook worden gecombineerd met subcellulaire fractionering, om organelle specifieke eiwitten die binden aan deze metabolieten te identificeren. Deze aanpak heeft geholpen om eiwitten te identificeren die zich binden aan inositolfosfaat en fosfoinositides in T.brucei, zoogdiercellen en gist. Het heeft geholpen bij het identificeren van nieuwe eiwitdomeinen die zich binden aan fosfoinositides.

Het heeft de weg vrijgemaakt om de regulerende functie van deze metabolieten te begrijpen, hun rol in genexpressie, celontwikkeling en signaaltransductie in eukaryoten. Sommige van de reagentia in dit protocol zijn giftig of ontvlambaar. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen, en waar nodig, werken in een rookkap.