Name: Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer de isolatie van speeksel epitheelcellen uit menselijke speekselklieren voor in vitro groei als salispheres of monolagen. Deze methode biedt een fysiologisch relevant model voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen James P. Bridges bedanken voor het verstrekken van belangrijke richtsnoeren voor de methoden die betrokken zijn bij het kweken van primaire cellen. Matthew J. Beucler werd gesteund door de National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Dit werk werd ook gesteund door National Institutes of Health subsidies R01-AI121028 en R21-DE026267 uitgereikt aan William E. Miller.

Deze protocollen en studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de Universiteit van Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Speeksel weefsel wordt gewoonlijk in veel hoofd-en nekchirurgische ingrepen door de hand gelopen en is meestal niet betrokken bij het maligne proces. Normaalgesproken wordt na verwijdering van de patiënt (Figuur 1a) binnen 2-4 h een vers verwijderd speekselklier weefsel gebruikt.
1. bereiding van het reagens
<ol><li>
Bronchiale epitheliale celgroei medium (BEGM)
	<ol>
<li>Voeg onderdelen uit de door de fabrikant geleverde Kit toe (Zie de tabel met materialen).</li>
		<li>Was elke buis één keer met de basismedia om volledige overdracht van componenten te garanderen. Voeg vervolgens houtskool gestript foetaal runderserum toe om een uiteindelijke concentratie van 4% serum te maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rode bloedcel (RBC) lysisbuffer
	<ol>
<li>Voeg, om 10x voorraad te maken, 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3en 0,186 g ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en breng tot een eindvolume van 200 ml met DH2O. Filter vervolgens steriliseren en bewaren bij 4 °C.</li>
		<li>Verdun tot een werkconcentratie van 1x in steriele dH2O vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissociatie oplossing
	<ol>
<li>Naar een flesje van 100 mL dispase (Zie de tabel met materialen) Voeg 0,15 g Collagenase type III toe. Nadat Collagenase volledig is opgelost, steriliseren filter de nieuwe oplossing en aliquot. Bewaren bij-20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. weefsel spijsvertering
<ol><li>Met behulp van een 100 mm weefselcultuur plaat, mechanicallymince het weefsel in fijne stukken ~ 1-2 mm in grootte met behulp van autoclaaf gesteriliseerde ontleden schaar en chirurgische Tang (Figuur 1b,C). Bindweefsel tussen stukken moet worden gesneden om een goede scheiding en gemak in verdere stappen te garanderen.</li>
	<li>Voeg 6 mL van de dispase/Collagenase-oplossing toe aan het fijngehakte weefsel. Inincuberen bij 37 °C gedurende ongeveer 30 minuten tot 1 uur.</li>
	<li>Ontwer het weefsel door pipetteren met een serologische Pipet van 5 mL 15-20 keer.</li>
	<li>Inincuberen bij 37 °C voor nog eens 30 min tot 1 uur.</li>
	<li>Herhaal de stappen 2,3 en 2,4 tweemaal drie keer of totdat het weefsel lijkt op een slurry en gemakkelijk de pipet opening kan passeren (figuur 1d). Opmerking: De begingrootte van het weefsel specimen en hoe fijnheid van de weefsel gehakt zal bepalen hoe vaak men de stappen 2,3 en 2,4 moet herhalen. Meestal ontvangen we weefsel ongeveer 1 cm x 1 cm groot. Daarnaast kan men weefsel dissociatie bewaken met behulp van een standaard omgekeerde weefselkweek Microscoop om de voortgang van celdissociatie van het weefsel te volgen. Kleine clusters van cellen zijn ideaal voor initiële uitgroei van speeksel cellen als salispheres.</li>
</ol>3. coating putten met kelder membraan matrix
Opmerking: de kelder membraan matrix (BMM) moet 's nachts op 4 °C worden ontdooid op de dag voordat deze wordt gebruikt. Eenmaal ontdooid, moet BMM constant worden gehandhaafd op ijs of op 4 °C, omdat het snel stollen (d.w.z. een gel vormen) bij warmere temperaturen. Bovendien moet worden gezorgd als monsters zijn gekoeld op ijs voorafgaand aan het beplating op BMM als koude monsters zal "smelten" de BMM en bloot cellen aan de plastic schotel.
<ol><li>Pipetteer langzaam BMM (Zie de tabel met materialen) in elk goed om te worden gecoat. Gelijkmatig en langzaam verdelen de BMM over de put. Opmerking: over het algemeen gebruiken we 500 μL per stuk van een zes-waterput, maar dit volume kan worden aangepast voor gebruik op andere varianten van platen zoals 12-well of 24-Well, of zoals gewenst voor dikkere of dunnere hydrogels.</li>
	<li>Inincubeer de gecoate platen bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik, zodat de BMM-tijd kan stollen.</li>
</ol>4. filtreren van onverteerd weefsel, RBC lysis en celplating
<ol><li>Overdracht weefsel homogenaat van stap 2,5 naar een conische buis van 15 mL. Was één keer met 6 mL van Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om de resterende cellen over te brengen.</li>
	<li>Filtreer het homogenaat in een conische buis van 50 mL door middel van een 70 μm nylon mesh Cell zeef om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Verdun 10x RBC lysisbuffer in steriele dH2O om een 1x werkoplossing te maken.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Breng vervolgens de celpellet in 10 mL van 1x RBC lysisbuffer. Inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C.</li>
	<li>Voeg 20-25 mL DPBS toe om de RBC lysisbuffer te neutraliseren en Lysis van de speeksel cellen te minimaliseren. Centrifugeer 5 min bij 500 x g. Opmerking: na behandeling met de RBC lysisbuffer moet de celpellet wit zijn. Rode kleur in de pellet geeft aan dat niet alle RBC volledig lysed zijn geweest. Herhaal stap 4,4 tot en met 4,5 indien nodig voor volledige lysis van alle RBC.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1-2 mL BEGM per putje en plaats vervolgens de herhangende cellen op BMM gecoate putten. Incuberen bij 37 °C.</li>
	<li>Eenmaal verguld op BMM, cellen zullen vormen in sferische structuren of "salispheres" over een periode van 2-3 dagen. Cellen kunnen worden gehandhaafd als salispheres voor ongeveer 5-7 dagen voordat de BMM begint te degraderen waardoor de cellen te openen en te hechten aan het plastic en groeien als een monolayer.</li>
</ol>5. subculturing van de salispheres en onderhoud op BMM
<ol><li>Aspirate media uit putten, voeg vervolgens 1 mL dispase/Collagenase oplossing aan elk putje en inbroed bij 37 ° c voor ~ 15 min of tot BMM is meestal opgelost.</li>
	<li>Breng cellen over naar een conische buis van 15 mL en spoel de putjes eenmaal met DPBS om de resterende cellen te verkrijgen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Hervat de pellet in 2 mL trypsine en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Neutraliseer de trypsine met behulp van alle volledige media die 10% serum bevatten. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Respendeer de cellen in DPBS om rest media, trypsine en serum te verwijderen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Resuspendeer in BEGM en plaat de geredigeerde cellen op gestijde BMM gecoate cultuur gerechten. Resuspendeerde cellen kunnen ook direct worden geplateerd op celcultuur behandeld gerechten voor proliferatie als een monolayer. Voor meer informatie over de groei van speeksel cellen als monolayer, zie rubriek 6. Cellen geteeld op BMM of op plastic moeten worden gevoed met verse BEGM elke 2 – 3 dagen.</li>
	<li>Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>6. subculturing de salispheres op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten
Opmerking: als u cellen als een monolaag op plastic onderhoudt, begint u bij deze stap. Het volgende protocol is van toepassing op cellen die groeien in een schaal van 100 mm.
<ol><li>De media te aspireren. Was één keer met DPBS om rest media te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 2 mL trypsine toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten, of totdat de cellen volledig zijn losgemaakt.</li>
	<li>Neutraliseer trypsine met behulp van 4 mL van alle volledige media die 10% serum bevatten. Breng cellen over in een conische buis van 15 mL.</li>
	<li>Was de plaat één keer met ongeveer 5 mL DPBS om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Respendeer cellen in 6-10 mL DPBS om rest media te verwijderen.</li>
	<li>Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren de supernatant en respenderen in BEGM. Plaat cellen op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Voer elke 2-3 dagen met verse BEGM.</li>
	<li>Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>7. cryopreservering van cellen
Opmerking: cryopreservering van cellen kan worden bewerkstelligd door een enkele celsuspensie die afkomstig is van ofwel salisphere of monolaag gekweekte cellen.
<ol><li>Tel de cellen op een hematocytometer om de totale hoeveelheid aanwezige cellen te berekenen.</li>
	<li>Centrifugeer 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Aspireren het supernatant. Respendeer de pellet in BEGM met 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Concentratie van cellen moet 2 x 106 cellen/ml tot 10 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Aliquot cellen in steriele cryogene opslag buizen. Plaats de buisjes in een geïsoleerde schuimrek en inincuberen bij-80 °C 's nachts om de cellen langzaam te bevriezen.</li>
	<li>Op de volgende dag, plaats buizen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag. Opmerking: cellen moeten snel ontdooid worden bij 37 °C. Bij het ontdooien moeten de cellen worden omhuld met 500 x g en de DMSO-bevattende media vóór het beplating worden verwijderd.</li>
</ol>

<ol><li>Kessler, A. T., Bhatt, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Major+and+Minor+Salivary+Glands%2C+Part+1%3A+Anatomy%2C+Infectious%2C+and+Inflammatory+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Imaging+Science%22%5BJournal%5D)">Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes.</a> Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47(2018).</li>
<li>Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmberg%2C+KV+%22Monographs+in+Oral+Science%22">Monographs in Oral Science</a>. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+Treatment+of+the+Consequences+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).</li>
<li>Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Main+Oral+Manifestations+in+Immune-Mediated+and+Inflammatory+Rheumatic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases.</a> Journal of Clinical Medicine. 8, 21(2018).</li>
<li>Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-year+observation+of+patients+with+primary+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%3A+Initial+presenting+characteristics+and+the+associated+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Rheumatology.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes.</a> International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review.</a> Cancer. 107, 2525-2534 (2006).</li>
<li>Morrison, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+cell+model+for+the+study+of+human+cytomegalovirus+replication+and+spread+within+salivary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium.</a> Journal of Virology. , (2018).</li>
<li>Pomeroy, C., Englund, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus%3A+epidemiology+and+infection+control%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus: epidemiology and infection control.</a> American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+Vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).</li>
<li>Varghese, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cell+aggregates+are+derived+from+self-organization+of+acinar+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells.</a> Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).</li>
<li>Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+human+and+mouse+salivary+glands%3A+A+practice+guide+for+salivary+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers.</a> Oral Diseases. , (2018).</li>
<li>Lin, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-contamination+of+the+human+salivary+gland+HSG+cell+line+with+HeLa+cells%3A+A+STR+analysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study.</a> Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).</li>
<li>Tran, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Polarized+Human+Salivary+Epithelial+Cells+for+Use+in+Developing+an+Artificial+Salivary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland.</a> Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Salivary+Gland+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2011).</li>
<li>Nam, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Primary+Epithelial+Cells+Derived+from+Human+Salivary+Gland+Contributing+to+in+vivo+Formation+of+Acini-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures.</a> Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).</li>
<li>Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Cannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+measures+study+of+weekly+and+daily+cytomegalovirus+shedding+patterns+in+saliva+and+urine+of+healthy+cytomegalovirus-seropositive+children%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children.</a> BMC Infect. Dis. 14, (2014).</li>
<li>Pringle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Salivary+Gland+Stem+Cells+Functionally+Restore+Radiation+Damaged+Salivary+Glands%3A+Hyposalivation+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy.</a> STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).</li>
<li>Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+improves+functional+properties+of+human+submandibular+salivary+gland+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%3A+Differentiation+of+Salivary+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).</li>
<li>Foraida, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-PLGA+hybrid+electrospun+nanofiber+scaffolds+for+salivary+epithelial+cell+self-organization+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization.</a> Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).</li>
</ol>

De auteurs rapporteren niets te onthullen.

Speeksel dysfunctie is een zorg voor de kwaliteit van leven voor mensen die lijden aan het syndroom van Sjögren, evenals degenen die radiotherapie ondergaan voor kankers naast de speekselklieren3,4,5, 16. Een voorgestelde therapie voor de behandeling van deze patiënten is om te groeien functionele speeksel stamcellen of organoïden in vitro, die vervolgens kunnen worden ingebracht in beschadigd...

Bij zoogdieren zijn de speekselklieren ingedeeld in 3 paar grote speekselklieren: de parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Er bestaat ook een reeks van kleine klieren gelegen op de tong en verspreid over de mondholte1. De belangrijkste klieren zijn verantwoordelijk voor het bulk volume van speeksel geproduceerd2. Naast het verstrekken van antimicrobiële bescherming door uitgescheiden factoren, het speeksel is belangrijk in het proces van kauwen en smeren van voedsel als het passeert de slokdarm2. Als zodanig, speekselklier dysfunctie vertegenwoordigt een medisch probleem waarbij patiënten die niet in staat zijn om voldoende speeksel te produceren meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van maladies zoals tandheelkundige holten of orale candidiasis3. Bovendien, verminderde speeksel resulteert in grotere moeilijkheden eten en verteerd voedsel met een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven.
De speekselklier dysfunctie is voornamelijk te vinden bij patiënten die lijden aan het syndroom van Sjögren, een auto-immuunstoornis of bij patiënten met hoofd-en nekkanker die bestraling van3,4,5, 6. Beschadigde secretoire acini binnen de klieren als gevolg van auto-immuniteit of bestralingstherapie ondergaan geen zelf vernieuwing, wat resulteert in een patiënt leven met onherstelbare schade6. De studie van de speekselklieren heeft ook de aandacht of onderzoekers geïnteresseerd in mechanismen van virale pathogenese gegarnerd. Sommige pathogenen, zoals humaan cytomegalovirus (hcmv), voortdurend repliceren binnen de speekselklieren, die vervolgens het mogelijk maakt voor de overdracht van ontluikende virus naar een nieuwe gastheer via speeksel7,8. Zo is er een onvervulde behoefte om robuuste en reproduceerbare in vitro modellen van speekselklier weefsel te ontwikkelen om een divers scala aan medische problemen aan te pakken en te begrijpen.
Verschillende modellen van het Murine speekselklier systeem zijn gebruikt als uitgangspunt voor het begrijpen en karakteriseren van de verschillende epitheelcellen die de speekselklieren vormen9,10. Er bestaan duidelijke en grote verschillen tussen menselijke en muriene speekselklieren11. Met name de humane holte klier is groter ten opzichte van de submandibulaire klier, terwijl de muis submandibulaire en holte veel vergelijkbaar zijn in grootte1,2,11. Terwijl vereeuwigd menselijke submandibulaire cellijnen bestaat, er zijn grote bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet nauwkeurig het fenotype van het primaire weefsel en secundaire bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet daadwerkelijk worden afgeleid van speeksel epitheel zelf12. Om deze redenen is er een belang en een noodzaak om primaire speeksel weefsel van de mens te bestuderen.
Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren voor weefselkweek. Ons protocol is gebaseerd op de werken van Pringle et al. en Tran et al. met wijzigingen die zijn aangebracht om hun procedures over het algemeen te vereenvoudigen13,14. Ten eerste, terwijl het Protocol van Tran et al. vraagt om een lange incubatietijd van vijf uur voor enzymatisch verteren van het speeksel weefsel, is ons gewijzigde protocol succesvol geweest met zo weinig als een incubatie van één uur, vergelijkbaar met die in Pringle et al. Ten tweede gebruiken we verschillende enzymen voor de spijsvertering van weefsels, met name we gebruiken geen trypsine zoals wordt gebruikt in het oorspronkelijke Tran et al.-Protocol, maar in plaats daarvan een mengsel van dispase en Collagenase gebruiken. We voorkomen dat trypsine in de eerste digestie stappen als een recente studie suggereerde dat de initiële vertering van het speeksel weefsel door trypsine resulteert in verminderde levensvatbaarheid van de cel, mogelijk door het verlies van een zeldzame stamcel populatie15. Ten slotte cultuur we de salispheres op het oppervlak van de kelder membraan matrix (BMM) met behulp van een commercieel beschikbare media oorspronkelijk geformuleerd voor de voortplanting van bronchiale epitheelcellen. Ons protocol kan worden gebruikt om speeksel cellen te isoleren van parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Deze cellen Express speeksel amylase en andere speeksel specifieke genen die erop wijzen dat ze een fenotype vergelijkbaar met dat van speeksel acineuze epitheelcellen7. We hebben met succes speeksel culturen gegenereerd uit > 50 primaire menselijke weefselmonsters met behulp van deze methodologie. Bovendien kunnen de primaire speeksel cellen gemakkelijk worden cryopreserved voor gebruik op een later tijdstip.

<table><tbody><tr><td>100 mm kweekschalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buizen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buizen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Bronchiale Epitheelcel Groeimedia</td><td>Lonza</td><td>CC-3171</td><td>Voeg bullet kit toe volgens de instructies van de fabrikant. Supplement met 20 mL geactiveerde koolstof gestript serum.</td></tr><tr><td>Celzevener 70 &micro;m nylon gaas</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Geactiveerde koolstof gestript foetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>12676-029</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type III</td><td>Worthington</td><td>LS004182</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cryogene buis</td><td>Fisher</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Cell Applications</td><td>07923</td><td>Los collagenase op om een 0,15% (w/v) stock oplossing te maken. Filter sterieel en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Corning</td><td>55-031-PC</td><td></td></tr><tr><td>Algemene chemicaliën</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PathClear Basaalmembraan extract</td><td>Cultrex</td><td>3432-005-01</td><td>Ontdooi bij 4 &deg;C ten minste 24 uur voor gebruik. Altijd hanteren op ijs.</td></tr><tr><td>Zes-well kweekschalen</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische pincet</td><td>Fisher</td><td>22-079-742</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA oplossing</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als salispheres of monolagen

Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers

De speekselklieren zijn een site van aanzienlijke belangstelling voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in meerdere aspecten van de menselijke ziekte. Een doel van de onderzoekers is het herstellen van de functie van klieren beschadigd door straling therapieën of als gevolg van pathologieën geassocieerd met het syndroom van Sjögren. Een tweede doel van de onderzoekers is het definiëren van de mechanismen waarmee virussen repliceren binnen klierweefsel waar ze dan toegang tot speeksel vloeistoffen belangrijk voor horizontale overdracht kunnen krijgen. Deze doelstellingen benadrukken de noodzaak van een robuuste en toegankelijke in vitro speekselklier model dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de bovengenoemde en aanverwante onderzoekgebieden. Hier bespreken we een eenvoudig protocol om epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren en ze in vitro te propageren. Ons protocol kan verder worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van individuele studies. Kort, speeksel weefsel is mechanisch en enzymatisch gescheiden om te isoleren van enkele cellen of kleine clusters van cellen. Selectie voor epitheliale cellen treedt op door plating op een kelder membraan matrix in de aanwezigheid van media geoptimaliseerd om epitheliale celgroei te bevorderen. Deze resulterende culturen kunnen worden gehandhaafd als driedimensionale clusters, aangeduid als "salispheres", of gekweekt als een monolaag op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Dit protocol resulteert in de uitgroei van een heterogene populatie van voornamelijk epitheelcellen die kan worden gekweekt voor 5-8 passages (15-20 populatie doublings) voordat het cellulaire senescentie ondergaat.

Twee-drie dagen na het plating van cellen van verteerd weefsel op BMM, cellen zullen gemakkelijk vormen kleine clusters die zullen blijven uitbreiden in grootte tot 15-20 cellen per cluster (Figuur 2a). Cellulaire puin en losgekoppelde dode cellen worden meestal gezien en moeten worden verwijderd door aspireren en aanvullen met verse media. Cellen zullen blijven prolifereren als salispheres voor over 3-10 dagen, of zolang de BMM laag intact blijft. Af en toe,...

We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

The salivary glands are a site of significant interest for researchers interested in multiple aspects of human disease. One goal of researchers is to ...

Het genereren van primaire cellulaire modellen of organoïde-achtige structuren is de sleutel tot het beantwoorden van veel hedendaagse vragen in de biologie. We zijn bijvoorbeeld al geruime tijd geïnteresseerd in de mechanismen die door menselijke virussen worden gebruikt om replicatie in de speekselklier te vergemakkelijken, omdat het een belangrijke plaats is voor horizontale transmissie. De ontwikkeling van het in dit protocol beschreven salisfeergebaseerde systeem is een cruciale vooruitgang in onze zoektocht naar het beantwoorden van dit soort vragen.Deze techniek stelt ons in staat om primaire cellen te genereren uit verschillende patiëntmonsters. De cellulaire modellen doen meer denken aan de in vivo type situatie als de cellen zijn niet gemodelleerd of getransformeerd zoals vele celtypes vaak gebruikt voor in vitro experimenten. We hebben dit protocol gebruikt om vergelijkbare cellen te genereren uit de primaire submandibulaire klier van muizen en het protocol zou waarschijnlijk nuttig zijn voor andere organen met vergelijkbare cellulaire structuren.Binnen twee tot vier uur na verwijdering van de patiënt, op een cultuurplaat, gebruik autoclaved gesteriliseerde ontleedschaar

isolation-salivary-epithelial-cells-from-human-salivary-glands-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

This video presents the protocol for culturing salispheres, the three-dimensional spheroids derived from salivary glands. The salispheres can be further used to assess the impact of head and neck cancer on saliva production from salivary glands of affected human patients.

Culturing Salispheres from Salivary Gland Tissue: A Method to Develop Salispheres from Human Salivary Gland Derived Epithelial Cells

Een techniek om genetisch te manipuleren epitheelcellen binnen het...

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.

De behandeling van de straling van Organotypic culturen van submandibulaire en Parotis speekselklieren modellen sleutel in vivo kenmerken

De traanklier (LG) heeft twee soorten cellen uitdrukken α-Smooth spier actine (αSMA): Myo cellen (MECs) en pericyten. MECs zijn van ectodermale oorsprong, gevonden in vele klier weefsels, terwijl pericyten zijn vasculaire gladde spiercellen van endodermal oorsprong. Dit protocol isoleert MECs en pericyten van muizen LGs.

Isolatie van Myo cellen van volwassen muizen traan en submandibulaire klieren

Hier presenteren we een aangepaste methode voor de isolatie en kweek van menselijke gingivale epitheelcellen door de Rock-remmer, Y-27632, toe te voegen aan de traditionele methode. Deze methode is eenvoudiger, minder tijdrovend, verbetert de eigenschappen van stamcellen en produceert grotere aantallen epitheelcellen met een hoog potentieel, zowel voor het laboratorium als voor klinische toepassingen.

Isolatie en cultuur van primaire menselijke gingivale epitheelcellen met behulp van Y-27632

De tandheelkundige follikel bevat een epitheliale populatie en mesenchymale cellen. De epitheliale populatie werd geselecteerd uit de heterogene tandheelkundige follikelcelpopulatie door een afzonderlijk kweekmedium te bieden. Epitheelcellen overleefden en vormden kolonies in een serumvrij medium.

Isolatie van epitheelcellen uit menselijke tandheelkundige follikel

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Leer de isolatie van speeksel epitheelcellen uit menselijke speekselklieren voor in vitro groei als salispheres of monolagen. Deze methode biedt een fysiologisch relevant model voor virologisch onderzoek.

Isolatie van speeksel epitheelcellen van menselijke speekselklieren voor in vitro groei als Salispheres of monolagen

Meer video's verkennen