Detectie van de Retrotransponerings activiteit van Hot LINE-1S door de lange afstand inverse PCR

Deze methode kan de activiteit van retrotransposities genaamd LINE-1s detecteren. Deze mobiele genetische elementen veroorzaken de novo inserties in kanker genomen en daarmee bijdragen aan genomische instabiliteit. Het voordeel van deze pcr-gebaseerde techniek is dat het eenvoudig en kosteneffectief is in vergelijking met benaderingen met hoge doorvoer.

We tonen hier zijn nut in het detecteren van de novo inserties die afkomstig zijn van een LINE-1 in het TTC28 gen op menselijk chromosoom 22. LINE-1 activiteit kan dienen als biomarker voor maligniteit of pre-maligniteit vooral in epitheliale tumor types, zoals darmkanker of hoogwaardige sereuze eierstokkanker. Naast LINE-1 inserties kan deze methode andere genomische aberraties detecteren, zoals DNA-herschikkingen die altijd niet voor niets moeten worden herindeling.

Om een geschikt restrictieenzym te selecteren en omgekeerde primers te ontwerpen, downloadt u eerst de TTC28 LINE-1-reeks in FASTA-formaat uit een LINE-1-database, zoals L1Base. De L1Base ID voor TTC28 Line-1 is 135. Inclusief vijf kilobases sequentie, flankeren zowel vijf prime en drie prime, einde van de Line-1 sequentie.

Exporteer de reeks naar een tekstverwerker. Hier wordt de lijn-1 flankerende opeenvolging geannoteerd in bruin lettertype en Line-1 sequenties in grijs lettertype. Om de unieke tag te bepalen in een kilobase sequentie stroomafwaarts van TTC28 Line-1's drie prime en in een van de polyadenylation signaal voorspelling tools, zoals Polyadq of Dragon PolyA Spotter.

Annoteren alle polyadenylation signaal in dit een kilobase venster. De volgorde tussen TTC28 LINE-1's eigen zwakke polyadenylation signaal hier gemarkeerd in het roze en de sterkste polyadenylation signaal stroomafwaarts is de unieke tag van deze LINE-1 hier gemarkeerd in het geel. Als u inverse PCR-primers wilt ontwerpen, voert u de unieke tagreeks in een webgebaseerde primer-ontwerptool in, zoals NCBI's Primer-BLAST die specifieke PCR-primers genereert, houdt u de parameter productlengte tot een minimum om primerparen weer te geven die dicht bij elkaar liggen.

Selecteer de juiste genoomdatabase. Aangezien de uitvoer van Primer Blast conventionele PCR-primers naar elkaar tegenover genereert, gebruikt u de omgekeerde complementfunctie voor het primerpaar om omgekeerde PCR uit te voeren. Inter-design primers, die overeenkomen met het oosten polyadenylation signaal waar mogelijk.

We hebben drie primerpars uitgedebuitennen, gemarkeerd in teal en groen, wat overeenkomt met drie sterke polyadenylation signaal in de unieke tag van TTC28 LINE-1. Vervolgens, om een geschikte beperking enzym te selecteren, verteren de LINE-1 sequentie, samen met de vijf kilobase upstream en downstream flanken in silica met behulp van web-based tools, zoals RestrictionMapper. Dit geeft een uitgebreide lijst van beperking enzymen die deze reden verteert, het genereren van verschillende beperking fragmenten.

Selecteer beperkingsenzymen die een vijf priemvoudige snede stroomopwaarts van line-1's vijf prime end of naar de vijf prime end van de LINE-1 als het binnen de LINE-1 zelf. En een drie prime kaart stroomafwaarts van de unieke tag. Het native restrictiefragment met LINE-1-sequentie en de unieke tag die is gemaakt door selectieve restrictieenzymen, mag niet langer zijn dan 12 kilobasissen, omdat het mogelijk niet efficiënt door PCR wordt versterkt.

Merk op dat de selectieve beperking enzymen ongevoelig zou zijn voor DNA-methylatie, moet warmte-inactivatable, en moet genereren kleverige uiteinden die complementair zijn aan elkaar. Om lange afstand inverse PCR aan te tonen, zullen we SacI restrictie enzym dat DNA snijdt op DAZCTC sites hier gemarkeerd in lichtgroen te gebruiken. SacI voldoet aan alle criteria op de TTC28 LINE-1 locus en genereert een native restrictie fragment van 5, 700 basisparen.

Haal genomisch DNA uit monsters met behulp van commercieel verkrijgbare DNA-extractiekit die in staat is om kwalitatief goede, hoge moleculaire DNA te extraheren dat nodig is voor lange afstand inverse PCR. Hier hebben we genomisch DNA uit MCF7 borstkankercellijn en normaal menselijk bloed gehaald met behulp van de instructie van de productie. Meet de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer.

100 honderd nanogram DNA op een persoon agarose gel naast een DNA moleculaire gewicht marker om DNA-kwaliteit en kwantiteit te controleren. Om circulaire DNA-sjablonen te maken, verteerbaar u eerst het DNA met geschikt restrictieenzym. Hier gebruiken we SacI om MCF7 te verteren en bloed genomic DNA Maak een spijsvertering reactie mix volgens tekst protocol.

Meng de oplossing door de buis te bewegen en kort te centrifugeren. Broed het reactiemengsel op 37 graden Celsius gedurende een uur, gevolgd door warmte-inactivatie, volgens de instructies van de fabrikant. Maak vervolgens een ligatiereactie-mixoplossing volgens het tekstprotocol om het verteerde DNA zelf te binden.

Voeg voor elke reactie 30 microliters van deze ligatiereactiemix direct toe aan 50 microliter verteerd DNA-oplossing uit de vorige stap. Meng de oplossing door de buis te bewegen en de buis kort te centrifugeren. Incubeer deze reactiemix in een thermische cycler bij 22 graden Celsius gedurende 10 minuten, eindigend met een warmte-inactivatiestap bij 60 graden Celsius gedurende nog eens 10 minuten.

Deze circulaire DNA-sjabloon zal worden gebruikt in de volgende omgekeerde PCR-stap. Stel een gloeiend temperatuurgradiënt in een thermische cycler in om de optimale temperatuur van de bloeiingen te bepalen door gradiënt PCR. Bereid een mastermix voor de PCR door alle componenten te combineren en te mengen volgens het tekstprotocol.

Stel één reactie in voor elke gloeiende temperatuur in het verloop. Voor elke reactie, toewijzen 19 microliters van de master mix PCR buizen en voeg een microliter van circulaire DNA-sjabloon, gegenereerd uit bloed genomic DNA. Voer het verloop-PCR-programma uit.

Run zes microliters van PCR product, verwarm het bij verschillende annealing temperatuur in een cursus in agarose gel. Om de novo TTC28 LINE-1 retrotranspositieactiviteit in het genoom van de MCF7-cellijn te detecteren, voert u PCR uit met behulp van inverse primer pair op cirkelvormige DNA-sjablonen, gegenereerd uit MCF-7-cellijn. Volg dezelfde instructies als voor gradiënt PCR, maar deze keer ter vervanging van de temperatuur gradiënt met een optimale annealing temperatuur, die is 64 graden Celsius.

Analyseer de lange afstand omgekeerde PCR producten door agarose gel voor de resultaten. Deze agarose gel beeld genomen na een elektroforeses toont de genomische DNA gewonnen uit MCF7 en bloedmonsters hebben een hoog moleculair gewicht, waardoor het geschikt is voor lange afstand omgekeerde PCR. Deze agarose gel beeld genomen na elektroforeses toont aan dat de omgekeerde primer paar dat we ontworpen versterkt de juiste cirkelvormige sjabloon op alle annealing temperaturen in de gradiënt zoals waargenomen door intense spanwijdte tussen 5 kilobase en zeven kilobase DNA marker.

Echter, verschillende banden worden ook waargenomen bij lagere temperaturen, wat wijst op een slechte primer specificiteit en slechte annealing temperaturen. Dus, voor deze primer paar, 64 graden Celsius is de optimale annealing temperatuur. Deze agarose gel afbeelding toont het PCR-product verkregen na het uitvoeren van lange afstand omgekeerde PCR op DNA geëxtraheerd uit MCF7 cellijn en normaal bloed.

Een PCF-product van 5,700 basisparen, gemarkeerd met een sterretje, vertegenwoordigt de native PCR die overeenkomt met Line-1 in zijn eigen locus. Dit native PCR product is zichtbaar in zowel MCF7 als normaal bloed DNA. De novo LINE-1 retrotransposition en MCF7 genoom is detecteerbaar als PCR product van verschillende grootte, samen met native PCR product in de agarose gel.

Sequencing van de lange afstand omgekeerde PCR product door single-moleculaire langgelezen sequencing technologieën kunnen identificatie van doel identificatie in een nucleaire-tight resolutie. Hoewel een omslachtige aanpak, klonen en sanger sequencing van de lange afstand omgekeerde PCR product is ook mogelijk. In deze video werd de activiteit van een LINE-1 op chromosoom 22 gedetecteerd.

Dezelfde workflow kan worden aangepast om andere LINE-1's te monitoren die actief zijn in verschillende tumortypen.